Name: במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: חקור את פעילות משאבת הזרימה MexAB מ-Pseudomonas aeruginosa בשיטה מבוססת שיקום חלבוני ממברנה בליפוזומים. הפרוטוקול מאפשר יצירת מפל פרוטונים הניתן לכוונון לחקר מנגנוני תחבורה מולקולריים וסינון תרופתי של מעכבים פוטנציאליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (פרויקט ANR-2010-BLAN-1535) ועל ידי מענק מהאזור איל דה פרנס (DIM-Malinf 110058).

1. ייצור חלבון וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mexa, MexB מPseudomonas aeruginosa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך פלסמידים מחסה גנים Mexa וMexB בE. זן חיידק ייצור (למשל C43 DE3). צלחת על LB אגר בתוספת בינונית עם האנטיביוטיקה המתאימה. פיק מושבה אחת לחסן preculture O / N. למחרת בבוקר, לחסן preculture ב1 ליטר של LB ולגדול על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה (240 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הגיעו לשלב מעריכי (OD 600 = 0.6-0.8) להשרות עם 1 מ&quot;מ IPTG. לבצע אינדוקציה ל2-3 שעות ב30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה (9,000 XG עבור 20 דקות) ו resuspend ב 30 מיליליטר טריס-HCl 20 מ&quot;מ, pH 8, NaCl 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים באמצעות עיתונות צרפתית (10,000 psi, 4 פס). בטל תאים רצופים וגופי הכללה ידי צנטריפוגה ב9,000 XG עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעות קרומים גלולה ב 100,000 XG וresuspend כל גלולה ב30 מיליליטר pH Bis-טריס 10 מ&quot;מ 7.4, גליצרול 20% (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז חלבון קרום הכולל באמצעות assay colorimetric BCA וsolubilize הקרומים O / N עם 2% maltoside dodecyl (DDM) בנפח סופי נקבע כך שחומר ניקוי: החלבון הוא 1:1.5 (w / w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ב100,000 XG במשך שעה 1 להשליך חומרי solubilized ומצטברים שאינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את supernatant לשעה 2 ב 4 ° C עם שרף ניקל (טיהור Mexa) או שרף קובלט (טיהור MexB) equilibrated עם Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 7.4, 5% גליצרול (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את השרף בעמודה ריקה. לאסוף את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף עם 50 מיליליטר של Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 7.4, 20% גליצרול (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%, ולאחר מכן עם 25 מיליליטר של Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 6, גליצרול 5% (w / v), imidazole 10 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute protein עם 20 מיליליטר Bis-טריס pH 10 מ&quot;מ 7.4, 5% גליצרול (w / v), imidazole 300 מ&quot;מ, NaCl 500 מ&quot;מ, DDM 0.2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את החלבון עם מכשיר אולטרה עד 3 מיליליטר ועומס על עמודת desalting equilibrated עם חיץ ללא imidazole. רגע לפני הכינון מחדש (ראה להלן), Ultracentrifuge חלבוני solubilized (100,000 XG עבור 20 דקות) כדי להיפטר משומנים וחלבונים unsolubilized. ואז לרכז את החלבון שוב ל0.3 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bacteriorhodopsin מsalinarium Halobacter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי salinarium Halobacter תחת תאורה על 37 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים במדיום גידול נוזלי המכיל 4 NaCl M, MgSO 4 150 מ&quot;מ, ציטראט 10 מ&quot;מ, KCl 30 מ&quot;מ, L / 5 גרם תמצית שמרים, וpeptone 5 גר &#39;/ ל&#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את התאים על ידי dialyzing נגד המים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הקרום הסגול על 30-40% (w / v) שיפוע סוכרוז (100,000 XG במשך 17 hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize ההשעיה הקרום עם octylgluc 2%oside ל24 שעות על 37 מעלות צלזיוס (נפח לsolubilization כדי resuspend הקרום בחומר ניקוי 2:01 (w / w): יחס חלבון). להעריך את הריכוז של BR solubilized באמצעות ε (570 ננומטר) = 54,000 M -1 cm -1. רגע לפני הכינון מחדש (ראה להלן), Ultracentrifuge BR solubilized (100,000 XG עבור 20 דקות) כדי להיפטר משומנים וחלבונים unsolubilized. הערה: קרומי הילידים מועשרים באופן טבעי בBR כך אין צורך בטיהור נוספת. </li></ol></li></ol> 2. הכנת Proteoliposomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היווצרות Liposome: שים 400 μl של dOPC מומס בכלורופורם (25 מ&quot;ג / מיליליטר) בכוס זכוכית ולהוסיף 1.5 מ&quot;ג של כולסטרול מאוחסן כאבקה. לייבש אותם ממש לפני המניפולציה תחת אדים של חנקן או ואקום במשך שעה לפחות 1 בכוס זכוכית. DOPC: יחס טוחנת כולסטרול הוא 3.3:1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שהם מיובשים, מימה השומנים עם 1 מיליליטר של HEPES 25 pH מ&quot;מ 7,K 2 SO 4 100 מ&quot;מ, MgCl 2 2 מ&quot;מ, pyranine 2 מ&quot;מ. ההשעיה אמורה להופיע עכורה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הפתרון עבור 10 דקות ב37 ° C. Sonicate 10 דקות ב W 40 עם 30 דופק שניות, 30 מחזורי הפסקה שניות ב RT. ההשעיה צריכה להופיע ברורה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג אוכלוסיית monodisperse של ליפוזומים, לבצע שני מחזורים של חול ולכל מחזור, להעביר את ההשעיה יפוזום דרך המסנן לפחות 11x. למחזור הראשון, השתמש בגודל נקבובית קרום של 200 ננומטר ולמחזור השני, השתמש בגודל נקבובית קרום של 100 ננומטר. ניתן לבצע מדידות פיזור אור דינאמי בשלב זה כדי לבדוק את ההומוגניות של ההשעיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב חלבון ניתן מחדש חלבונים בממברנה ביפוזומים הודות להשפעת solubilizing של חומרי ניקוי: עיקרון. ליפוזומים solubilized-דטרגנט מודגרת עם חלבון אבקת-solubilized הממברנה והיווצרות של proteoliposomes מופעל על ידי חיסול מהיר של חומר הניקוי עם חרוזי פוליסטירן 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 28 מ&quot;ג של טריטון X-100 (0.56% סופיים) ו דגירה O / N ב 4 ° C (טמפרטורת solubilization יכולה להיות מותאמת לנחקר החלבון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את חלבון אבקת-solubilized (BR, MexB וMexa) ליפוזומים solubilized דגירה 15 דקות ב 4 ° C. מוסיף את החלבונים להשעית יפוזום solubilized ביחסים הבאים (w / w): שומנים / MexB = 20, MexB / Mexa = 2.5, ושומנים / BR = 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חרוזי פוליסטירן ב30:1 חרוזים: יחס חומרי ניקוי (w / w, בהתחשב במשקל הכולל של חומר ניקוי, כולל חומרי ניקוי נוספים עם החלבונים המטוהרים) ודגירת שעה 5, בחושך (בגלל BR) ב RT תחת עדין ערבוב. לפני הליך זה, להפעיל את biobeads עם מתנול ודגירת אתנול והרחבה לשטוף עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את חלבון proteoliposomes ומצעים בחינם באמצעות PD-10טור desalting equilibrated עם HEPES pH 25 מ&quot;מ 7, K 2 SO 4 100 מ&quot;מ וMgCl 2 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את proteoliposomes ב18 ° C בחושך לתקופה של עד 2-3 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה של יעילות הכינון מחדש בשיפוע סוכרוז. כדי לבדוק ששני MexB וBR כבר מחדש בליפוזומים, לטהר את ההשעיה proteoliposome על שיפוע סוכרוז רציף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתיישב proteoliposomes בשיפוע חמש שכבה של סוכרוז (60%, 20%, 10%, 5%, ו2.5% w / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ל17 שעות ב 100,000 XG (עם מינימאלי תאוצה ושיעורי האטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף בזהירות את שברי השונים שיפוע (בעיקר את הממשקים בין כל שכבה של סוכרוז) ולנתח אותם ב- SDS (10%) באמצעות מכתים Coomassie או מערבי סופג. חלבונים מצטברים נמצאים בחלק התחתון של הצינור, בעוד חלבוני nonincorporated, חומרי ניקוי-solubilized נמצאים בחלק העליון שלהצינור. Proteoliposomes ויפוזומים נמצאים בממשקים סוכרוז שהמתאימים לצפיפות הפנימית שלהם. ליפוזומים ריקים הם התאוששו במעלה בשיפוע מאשר proteoliposomes. </li></ol></li></ol> 3. מדידת הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מדידות הקרינה ב25.0 מעלות צלזיוס באמצעות spectrofluorometer מאפשר למדידות כפול אורך גל (מנורת Xe, 150 W). תקופות חלופי תאורה (כדי להפעיל BR עם אורכי גל עירור / פליטה של ​​550 ננומטר / 550 ננומטר) ומדידות הקרינה באורכי גל עירור / פליטה של ​​455 ננומטר ננומטר / 509 במשך 2 שניות כדי למדוד את הקרינה pyranine. הגדר את רוחבי פס העירור ופליטה ל5 ננומטר. לבצע את המדידות בנוכחות 50 valinomycin ננומטר כדי למנוע היווצרות של ΔΨ פוטנציאל הממברנה הפוך. הערה: אכן, בגלל BR משאבות פרוטונים, יש מטענים חיוביים יותר פנימי של יפוזום יותר מאשר בחוץ. חיוב זהשיפוע יכול להיות מושלך באמצעות valinomycin, שהיא K + ionophore סלקטיבית. הוסיף פעם אחת לvalinomycin ההשעיה ליפוזומים, כמולקולה הידרופובי, יחדיר לתוך קרום יפוזום, פסיבי להעביר K +, ולכן להתפוגג ΔΨ פוטנציאל הממברנה. </li></ol>

<ol><li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us%3F+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li>
<li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li>
<li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li>
<li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li>
<li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134(2009).</li>
<li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li>
<li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li>
<li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li>
<li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes%3A+caveats+and+keys%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li>
<li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis%2C+edited+by+iConcept+Press%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

אנו מתארים הליך הכינון מחדש מיועד למנסה לאמוד תחבורת חלבון קרום. הוקם פעם, הליך הכינון מחדש החלבון מוביל למדידות, כי הם מאוד לשחזור. עם זאת, התנאים המדויקים עבור בנייה מחדש של החלבונים משתנים מחלבון אחד למשנו. טיפול הרבה חייב להילקח באופטימיזציה של הפרמטרים הבאים: א) איכות הטיהור (טוהר והעדר החומר מצטבר); ii) יעילות של צעד solubilizing חומר הניקוי (במידת האפשר, חומרי ניקוי CMC נמוכים צריכים להיות מועדף משום שהם קלים יותר לקבל להיפטר מ); iii) desorption של חומרי הניקוי (זה למשל ניתן לשלב את השימוש בחרוזי פוליסטירן בצעד דיאליזה אבל זה עלול להשפיע על שיעור desorption, פרמטר קריטי לפעילות הבאה של החלבון, ראה נ&quot;צ [ 9]); ד) הכינון מחדש שומנים (האופי הכימי של השומנים בדם, השומנים בדם ליחס חלבון, הנוכחות של amphiph נוסףIles הם פרמטרים קריטיים שחייבים להיות מגוון ומותאם). בטמפרטורה בנוסף וזמן דגירה משפיע על כל הנושאים הללו. בקרת איכות היא אפוא קדמונית בכל שלב של הליך הכינון מחדש. מנקודת מבט זו, פיזור אור הוא טכניקה מאוד נוחה כי זה מהיר, הורסות, וזה רק דורש 20 μl של מדגם בריכוז בטווח מייקרו. ברגע שproteoliposomes נוצרים, שיפוע סוכרוז גם הוא לעזר רב משום שהיא פותחת את הדרך לאימות שיטתית של הכינון מחדש: איכותי (הוא החלבון אכן משובץ לתוך קרום יפוזום), כמו גם כמותית (כמה חלבון ביפוזום אחד). זה האחרון יהיה לטפל על ידי בדיוק מדידת החלבון וריכוזי שומנים בדם. assay שלנו אינו מסתמך על טיטרציה של המצע עצמו וזה נמנע משיקולים שלא בנוח בנוגע לדיפוזיה פסיבית artifactual האפשרי של<html> המולקולה בשל מחיצות הידרופובי בקרום. Assay מנצל מאפיינים של pyranine כמו בדיקה אמינה וכמותי לשינויי pH הניטור. התוצאות שלנו הן בהסכם עם תוצאות שהושגו בהליך אחר שבו היווצרות שיפוע הפרוטון בוצעה באמצעות valinomycin 10, אבל זה מאפשר שיפוע חזק יותר ולשעתק 11. בנוסף, שיפוע הפרוטון יכול להיות מכוון בדיוק, פשוט על ידי שינוי הריכוז של החיץ (לפרטים נוספים ראה Verchere et al. 12). בהליך מדידת שליטה מתבצעת ראשונה בהיעדרו של מצע (זה נותן גישה לפעילות הפסיבית של החלבון). פעילות טרנספורטר חלבון קרום בפועל לאחר מכן נמדדת לאחר המצע כבר הוסיף באותו קובט. זה באמת נכס, כי הניסוי יכול להיחשב כתוצאה אמיתית, שאינה דו משמעית, הנגרם מצע. אף אוזן גרון &quot;&gt; הפרוטוקול יכול להיות מותאם לתפוקה גבוהה בינונית (למשל מדידות 96 בארות) אוטומציה כי מאיר את המדגם מעורר את התגובה. האוטומציה ועמות יהיו מורכבות בהכנת קבוצה גדולה של proteoliposome, ומחלק aliquots ב96 בארות צלחת. מצעים (וגם מעכבים אפשריים) אז היו ניתן להוסיף ולאחר הדגירה בחושך במשך 45 דקות הצלחת תהיה נתון למחזורי מדידת הקרינה התאורה / pyranine על קורא microplate. לקבלת מידע נוסף על הפרוטוקול, קוראים מוזמנים לקרוא Verchere et al. 12,13

חלבוני קרום נפרד מייצגים עד 30% מהגנים המקודדים בגנום אוקריוטים. הם חולקים בתפקידים מרכזיים כגון שמירה על שער (קולטנים), הובלת חומרים מזינים, יונים או תרכובות רעילים (מובילים) או שמירה של החדירות פני bilayers קרום (ערוצים) בין כל תאי החיים 1. בזרימת משאבות יש להם תפקיד מרכזי בהתנגדות נגד טיפול אנטיביוטי 2. בחיידקים גראם השליליים, Pseudomonas aeruginosa, אשר מוגנו על ידי קרום חיצוני, מובילי זרימה מאורגנים כמערכות משולשת שבו MexB, המשאבה בזרימת הממוקמת בקרום הפנימי, עובדת בשיתוף עם Mexa, חלבון periplasmic, וOprM, ערוץ קרום חיצוני. חלבון הקרום הפנימי cytoplasmic פועל כמשאבת אנרגיה תלויה עם סגוליות מצע רחבות. חלבון הקרום החיצוני פועל כPorin ואילו שליש נמצא בשטח periplasmic והוא חשב על מנת לייצב את המכלול השלם <sעד&gt; 3. בחלק הבא, אנו מתמקדים בעיצוב של assay פונקציונלי להרכבת Mexa MexB. מידע מבני נצבר במשך 5 השנים האחרונות הודות לנחישות רנטגן של AcrB החלבון הומולוגי מEscherichia coli 4-7. למרות שזה ברור שחשוב לבני זוג מידע כזה עם נתונים דינמיים והקינטית, עיצוב assay פונקציונלי לטרנספורטר הזה הוא אתגר אמיתי 8. ואכן, חלבוני הקרום חייבים להישמר בסביבה קרומית ותא סגור חייב להישמר לתחבורת וקטורים של מצע להיות מושגת. הכינון מחדש של חלבונים בממברנה לproteoliposomes כבר הציג בהרחבה וביקורת (ראה ריגו ו9 לוי). פרוטוקולים כגון לאפשר הניטור של פעילות חלבונים בממברנה, למשל על ידי ביצוע מצעים פני קרום יפוזום. במקרה זה נובעות ממגבלותvailability של מצעי titratable (ניאון, רדיואקטיבי, וכו &#39;.) ומן העובדה כי לעתים קרובות מאוד מצעים אלה הם הידרופובי ויש נטייה לחצות קרומים ללא קשר לנוכחות של טרנספורטר. כחלופה, אפשר לעקוב וריאציות ספקטרוסקופיות של צבע דיווח רגיש לשינויים כימיים המתרחשים כתוצאה מהובלה. כאמור לעיל, פרוטונים להמריץ תחבורה באמצעות MexB. לפיכך, אפשרות רלוונטית היא לפקח וריאציות ספקטרוסקופיות של צבע דיווח pH רגיש לעקוב וריאציות pH כתוצאה מהובלת מצע מונחה פרוטון. הבחירה של צבע פלואורסצנטי תמנע תופעות artifactual בשל האופי ההידרופובי של המצע. קושי נוסף הוא הדור של שיפוע פרוטון. ניתן למצוא כמה פרוטוקולים בספרות. ביניהם, השימוש בטכניקת valinomycin הוא נפוץ אך שהראינו שזה מייגע לבצע 10-11. יתר על כן הואלא לשחזור וזה לא הפיך. אנחנו נקטו השימוש בbacteriorhodopsin (BR), משאבת פרוטון אור הופעל מsalinarium Halobacter, archaeon halophilic הימי גראם שלילי לחייב אירובי. חלבון זה coreconstituted ליפוזומים עם MexB ו, על תאורה, BR משאבות פרוטונים בתוך ליפוזומים ולכן יוצר ΔpH (חומצי בפנים) נדרש על ידי החלבון להעביר את המצע 12-13.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Invitrogen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>פירנין (8- הידרוקסיפירן-1,3,6-חומצה טריסולפונית)</td><td>Invitrogen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranoside)</td>ערכת מכבש <td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>(מכבש, מזרקים אטומים לגז של המילטון)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 סופחים</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac כרומטוגרפיה עמודה ריקה</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>עמודי התפלה</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר לפיזור אור דינמי</td><td>Wyatt Technology</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>פלואורומטר JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה של החקירה וmexab זרימת המשאבה מpseudomonas aeruginosa

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

קיים צורך מדעי המתעוררים לכלים אמינים לניטור תחבורת חלבון קרום. אנו מציגים מתודולוגיה שהובילה לכינון מחדש של משאבות בזרימת מaeruginosa Pseudomonas חיידקים גראם שליליים בסביבת biomimetic המאפשר חקירה מדויקת של פעילותם של תחבורה. שלושה תנאים מוקדמים מתקיימים: מידור בסביבה lipidic, שימוש במדד רלוונטי להובלה, ודור של שיפוע פרוטון. טרנספורטר חלבון הקרום מחדש ליפוזומים יחד עם bacteriorhodopsin, משאבת פרוטון אור הופעל שיוצרת שיפוע פרוטון שהוא חזק, כמו גם הפיך ומתכונן. הפעילות של החלבון היא להסיק מוריאציות ה-pH המתרחשות בתוך יפוזום, באמצעות pyranin, בדיקה ניאון pH תלוי. אנו מתארים הליך צעד אחר צעד שבו טיהור חלבוני קרום, היווצרות יפוזום, הכינון מחדש חלבון, ותחבורהnalysis מטופלות. למרות שהם תוכננו במיוחד עבור טרנספורטר RND, השיטות המתוארות עלולות להיות מותאמות לשימוש עם כל טרנספורטר חלבון קרום אחר אנרגיה על ידי שיפוע פרוטון.

Assay מורכב מניטור הקרינה pyranine כפונקציה של זמן, בעוד שיפוע פרוטון שנוצר. לצורך כך, דגימות נתון לחלופין לתאורה (ומכאן שאיבת פרוטון על ידי BR מופעל) ולאחר מכן פלואורסצנטי מדידה באמצעות העירור ופליטת אורכי גל של pyranine (λ לשעבר = 455 ננומטר וλ em = 509 ננומטר). איור 1 מציג שליטה שהושגה עם נציג assay, בהעדר Mexa / MexB, שאימת כי שיפוע הפרוטון שנוצר על ידי BR הוא הפיך. לאחר מחזור אחד של החמצה, proteoliposomes נשמרים בחושך במשך 45 דקות על מנת שBR להפסיק שאיבת פרוטונים (פרוטונים מפוזר באיטיות ובאופן פסיבי על פני bilayers השומנים הבאים מפל הריכוזים שלהם). לאחר זמן התאוששות זו, הפעלה של BR היא אפשרית, פשוט על ידי המאיר אותה ההשעיה שוב. איור 2מתאים למדידת הובלה בפועל. בקרה שלילית עם ליפוזומים בחינם חלבון מראה כי, כצפוי, את ה-pH היא קבועה על תאורה (2A דמויות ו2B, עיגולים כתומים). עם זאת, proteoliposomes מכיל BR בקרומים שלהם אין משאבת פרוטון, ובכך ה-pH בתוך ירידות יפוזום ושיפוע יציב בנוי (2A דמויות ו2B, ריבועים סגולים). משולשים אפורים ויהלומים אדומים (איור 2 א) לייצג את ה-pH בתוך proteoliposomes מכיל BR וMexB, בנוכחות או בהעדר Hoechst 33342, בהתאמה. אנו צופים פעילות מצע עצמאי שבו שיפוע הפרוטון מתפזר באופן חלקי בלבד על ידי נגד תחבורת MexB. אנו מייחסים את תצפית זו לפעילות בסיס של MexB. על מנת לבחון את ההשפעה של Mexa על פעילות MexB, Mexa התווסף לכינון מחדש, תחילה בהיעדר כל מצע ( <strong&gt; איור 2 ב, יהלומים כחולים). שוב, שיפוע הפרוטון שנוצר על ידי BR מתפזר באופן חלקי בלבד. מדידת ההובלה בפועל הוא הבין באותו המדגם. לפני כן, שיפוע הפרוטון יש reinitialized והמצע יש להוסיף בהשעיה על מנת להגיע לאתר הקישור שלו בחלבון. למטרה זו ההשעיה מודגרות בחושך בנוכחות המצע 45 דקות. עם תאורה שלאחר מכן, ניתן לראות כי שיפוע הפרוטון שנוצר על ידי BR כעת התפוגג לחלוטין על ידי MexAB (תרשים 2B, משולש ירוק), כתוצאה מתחבורת מצע על ידי המשאבה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . איור 1 הפיכות של שיפוע הפרוטון נבנה על ידי תאורת BR: Pyranine fluorescence של proteoliposomes BR נמדד כפונקציה של זמן. מ0-15 דק &#39;, BR משאבות פרוטונים כתוצאה מהפעלת אור. מ15-60 דקות, proteoliposomes מודגרת בחושך; בתקופה זו, באופן פסיבי פרוטונים לנוע מחוץ ליפוזומים עד pH intravesicular וpH extravesicular שווים. מ60-75 דק &#39;, BR הוא עדיין פונקציונלי ומשאבות פרוטונים על תאורה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . איור 2 התחבורה assay: הקרינה pyranine, שהומרה לוריאציות pH המתאימות, כפונקציה של זמן pH) בתוך ליפוזומים שליטה (עיגולים כתומים); pH בתוך proteoliposomes מכיל BR בקרום (ריבועים סגולים); pH בפנים. של proteoliposomes מכיל BR, וMexB בקרום ללא Hoechst 33,342 (ד האדוםiamonds); pH בתוך proteoliposomes מכיל BR וMexB בקרום עם Hoechst 33,342 (משולשים אפורים) B-pH) בתוך ליפוזומים שליטה (עיגולים כתומים);. pH בתוך proteoliposomes מכיל BR בקרום (ריבועים סגולים); pH בתוך של proteoliposomes מכיל BR, MexB וMexa בקרום ללא Hoechst 33,342 (יהלומים כחולים); pH בתוך proteoliposomes מכיל BR, MexB וMexa בקרום עם Hoechst 33,342 (משולשים ירוק).

אנו מציגים פרוטוקול לחקירה במבחנה של משאבות בזרימת מPseudomonas aeruginosa. פרוטוקול זה מאפשר לדור של שיפוע פרוטון חזק, הפיך, ומתכונן בתוך קרום יפוזום ולכן צריך להיות מותאם לכל חלבון קרום אנרגיה על ידי כוח protomotive.

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את ה-FLX pump me AB מ-Pseudomonas aosa באמצעות בדיקה פונקציונלית המבוססת על בנייה מחדש של חלבוני ממברנה. בליפוזומים. זה מושג על ידי ביטוי וטיהור יתר של חלבוני ממברנה, תערובת B ורודן חיידקי בחלבוני ממברנה של חיידקים מופקים לאחר מכן מהממברנות ומטוהרים טהורים על ידי כרומטוגרפיה של זיקה.השלב השני הוא הכנת ליפוזומים על ידי שילוב של סרט שומנים מיובש עם חיץ המכיל פורין, מה שמוביל להיווצרות שלפוחיות מולטי-לאם. לאחר סוניקציה, הליפוזומים מוחצנים כדי לקבל אוכלוסייה הומוגנית של ליפוזומים. לאחר מכן מוסיפים לתמיסת הליפוזום חלבוני קרום דטרגנט ולאחר מכן חרוזי פוליסטירן.הזנבות ההידרופוביים של חומר הניקוי מוסיפים לספוג על חרוזי הפוליסטירן, ומאפשרים לחלבוני הממברנה לשחרר את חגורת חומר הניקוי ולהכניס לקרום הליפוזום. השלב האחרון הוא הסרת פורין שאינו מכוסה על ידי הפעלת ליפוזומי הפרוטאה על עמוד התפלה, ליפוזומי פרוט גדולים מגיעים לתחתית העמוד הרבה יותר מהר מאשר פורין שאינו מכוסה, שנשאר קשור בחלק העליון של העמוד. בסופו של דבר, נאספים ליפוזומים פרוטליים והפלואורסצנטיות שלהם משמשת לחקירת פעילות Mex AB באמצעות השינוי ב-pH שנוצר עם הארת אופסין חיידקי.משאבות Rodin Effects הן טרנספורטרים המקדמים עמידות לאנטיביוטיקה עקב זיהוי והובלה של מגוון רחב של מצעים מכל משפחות האנטיביוטיקה, יש צורך דחוף בבדיקות פעילות מבחנה חדשות ואמינות להשפעות חלבון הממברנה. מובילים. ואכן, בדיקות כאלה יציעו תובנות חדשות במנגנונים המולקולריים של ההובלה ויסייעו בסינון פרמקולוגי של מועמדים פוטנציאליים חדשים למעכבים. אנו מתמקדים במיקס תערובת, B-O-P-R-M, eFlex Perm מג'ין Pseudomona.אנו מציגים עצות טכניות ושיטה הדרושה כדי לעמוד בשלוש דרישות לתכנון בדיקה פונקציונלית יעילה במבחנה לערבב משאבת B ffl, כולל מבנה החלבון בממברנה, שימוש בתא סגור הדרוש להובלה וקטורית של מצע, מופעים עדינים של ארובות ומות המונע השפעה ארטיפקטית עקב אופי האדרו של המצע ויצירת שיפוע חלבון הדרוש לתערובת AB ל פונקציה. חוזק הבדיקה שלנו הוא האופן שבו אנו מייצרים שיפוע T הניתן לשחזור והפיך ליצירת pH דלתא שאנו מכנים חיידקי nstitute או VR עם תערובת AB בקרום ליפוזום. BR הוא חלבון ממברנה מטוהר מהקרום הסגול של aob salinium allic Marin גרם שלילי, aans אירובי מחייב.עם ההארה, חלבון זה שואב באופן פעיל חלבונים. לכן, אם BR מורכב יחד עם החלבון בליפוזום, סילוק הליפוזום ייצור pH דלתא עקב ה-br, השואב חלבונים בתוך הליפוזומים. הכנת חומר חלבוני טהור ויציב היא בעלת חשיבות עליונה.הליך הטיהור של חלבון הממברנה גורם ל-B תואר יפה בפרסום J ovy שפורסם בעבר, כמו גם בפרוטוקול הטקסט הנלווה לסרטון זה שבו ניתן למצוא גם תיאור של טיהור תערובת חלבון ממברנה A להכנת רודן חיידקי מ-Halabach Salinium לגדל תאי סליניום חלבך תחת תאורה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 ימים. במדיום גידול נוזלי, יש לשבש את התאים על ידי דיאליזה כנגד מים נטולי יונים. טהר את הממברנה הסגולה בשיפוע סוכרוז של 30 עד 40%.לאחר מכן, יש להמיס את תרחיף הממברנה עם גלוקוציד אוקטלי של 2%. היו 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. הגן על הצינור מפני אור על ידי עטיפתו בנייר אלומיניום.העריכו את ריכוז החיידקים המסיסים או המינוזין באמצעות מקדם ההכחדה המופיע בפרוטוקול הטקסט ממש לפני הבנייה מחדש. אולטרה-צנטריפוגה מסיס אופסין חיידקי כדי להיפטר משומנים ולבטל את המסה של חלבונים. להכנת הליפוזומים ברמקול זכוכית, שקלו 1.5 מיליגרם כולסטרול המאוחסן כאבקה והוסיפו 400 מיקרוליטר דיול פוספטידילכולין או DOPC מומס בכלורופורם בכוס זכוכית, יבשו אותם בוואקום לפחות שעה בכוס זכוכית ממש לפני המניפולציה.היחס בין DOPC לכולסטרול מולארי המתקבל הוא 3.3 ל-1. לאחר שהם ייבשו לחות את השומנים עם מיליליטר אחד של מאגר hebes, המתלה אמור להיראות טוריד. בשלב זה, מחממים את התמיסה למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס סוניקט למשך 10 דקות ב-40 וואט עם דופק 32 לסירוגין, מחזורי הפסקה 32 בטמפרטורת החדר, המתלה אמור להיראות ברור.בשלב זה, ההיבט הקריטי ביותר של ההליך הוא השגת השעיה הדוקה ומונו מפוזרת של ליפוזומים. על מנת לעשות זאת, אנו מקפידים מאוד בהגדרת מכשיר הטבעת הנוספת כך שלא תתרחש דליפה. בנוסף, אנו מנקים את המכשיר בקפדנות רבה לאחר כל שימוש.כדי להשיג אוכלוסיית פיזור מונו של ליפוזומים, בצע שני מחזורי שחול לכל מחזור. העבירו את תרחיף הליפוזום דרך המסנן לפחות 11 פעמים. עבור המחזור הראשון, השתמש בגודל נקבוביות ממברנה של 200 ננומטר, ובמחזור השני, בגודל נקבוביות ממברנה של 100 ננומטר.בשלב זה ניתן לבצע מדידות פיזור אור דינמיות כדי לבדוק את ההומוגניות של המתלה. מוצגת כאן תוצאה אופיינית של שלב זה. ניתן לשחזר חלבוני ממברנה בליפוזומים בשל ההשפעה המסיסה של חומרי ניקוי.ליפוזומים מסיסים מודגרים עם חומר הניקוי, חלבון הממברנה המסיס ויצירת הפרוטאה. ליפוזומים מופעלים על ידי חיסול מהיר של חומר הניקוי בעזרת חרוזי פוליסטירן. כדי לשלב חלבון, הוסיפו 28 מיליגרם טריטון X 100 ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.הוסיפו את החלבון המסיס בחומר הניקוי, כולל החיידקים אופסין מקס B ומקס A לליפוזומים המסיסים ודגרו במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף חרוזי פוליסטירן שהופעלו בעבר. הוסף יחס של 30 לדבורה אחת לחומר ניקוי ודגירה במשך חמש שעות בחושך בטמפרטורת החדר.תחת ערבוב עדין, יש לטהר את חלבון הליפוזומים של הפרוטיה ואת המצעים החופשיים באמצעות עמוד התפלה PD 10 מאוזן עם מאגר הס. כדי לבדוק שגם ה-Mex B וגם החיידק אופסין נוצרו מחדש בליפוזומים, טהר את תרחיף הליפוזום של הפרוטאה בשיפוע סוכרוז לא רציף. הניחו בעדינות את הפרוטאוזום על שיפוע של חמש שכבות של סוכרוז.לאחר מכן אולטרה צנטריפוגה למשך 17 שעות במאה אלף גרם לאחר אולטרה-פיקציה, חלבונים מצטברים נמצאים בתחתית הצינור ואילו חלבונים מסיסים של חומרי ניקוי שאינם משולבים נמצאים בחלק העליון של הצינור. פרוטאה, ליפוזומים וליפוזומים נמצאים בממשקי סוכרוז התואמים את הצפיפות הפנימית שלהם. ליפוזומים ריקים מתאוששים במעלה השיפוע מאשר ליפוזומי הפרוט.אסוף בזהירות את שברי השיפוע השונים לפני ניתוחם עם נתרן דיל סולפט. אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד באמצעות צביעת קומאסי או כתמים מערביים. בצע מדידות פלואורסצנטיות ב-25 מעלות צלזיוס באמצעות פלואורמטר ספקטרלי, המאפשר מדידות אורך גל כפול.החלף את תקופות ההארה להפעלת רודן חיידקי המאופיין באורכי גל עירור ופליטה של 550 ננומטר עם מדידות של פלואורסצנטיות פורין, המאופיינות באורך גל עירור של 455 ננומטר ואורך גל פליטה של 509 ננומטר למשך שתי שניות. הגדר את רוחבי הפס של העירור והפליטה לחמישה ננומטרים. בצע את המדידות בנוכחות 50 ננו-מולרי ליני, כדי למנוע היווצרות פוטנציאל ממברנה הפוכה.אנחת דלתא המוצגת כאן היא בקרה מייצגת המתקבלת עם הבדיקה בהיעדר מקס a, מקס B, המאמתת ששיפוע הפרוטונים שנוצר על ידי אופסין מוט החיידק הוא הפיך. לאחר מחזור אחד של החמצה, ליפוזומי אוראו נשמרים בחושך למשך 45 דקות על מנת שהחיידק אופסין יפסיק לשאוב פרוטונים. לאחר זמן התאוששות זה, הפעלה של חיידקים אופסין אפשרית פשוט על ידי הארת אותו מתלה.שוב, מדידת הובלה בפועל מראה שלשליטה שלילית עם ליפוזומים נטולי חלבון יש pH קבוע עם התאורה כצפוי. עם זאת, ליפוזומי פרוטיאה המכילים חיידקים או אופסין בקרומים שלהם אכן שואבים פרוטונים. לפיכך, ה-pH בתוך הליפוזומים יורד ונבנה שיפוע יציב.משולשים אפורים מייצגים את ה-pH בתוך ליפוזומי פרוטיאה המכילים חיידקים או אופסין ומקס B בנוכחות מתיחה. 3, 3, 3, 4, 2 צבע. בעוד שהיהלומים האדומים מייצגים את ה-pH בהיעדר הצבע, נצפית פעילות בלתי תלויה במצע A כאשר שיפוע פרוטון מתפזר רק באופן חלקי על ידי הובלה נגדית של מקס B, המיוחסת לפעילות בסיסית של מקס B.In כדי לבדוק את ההשפעה של מקס A על הפעילות של מקס b מקס A נוסף תחילה לבנייה מחדש.בהיעדר מצע כלשהו, שוב, שיפוע הפרוטונים שנוצר על ידי האופסין החיידקי מתפזר רק חלקית. מדידת ההובלה בפועל מתממשת על אותה דגימה ממש והפרוטון מאותחל, והמצע מתווסף בתרחיף על מנת להגיע לאתר הקישור שלו בחלבון. עם התאורה שלאחר מכן, ניתן לראות ששיפוע הפרוטונים שנוצר על ידי האופסין החיידקי מתפזר כעת לחלוטין על ידי Mex AB כתוצאה מהובלת המצע על ידי המשאבה, חשוב לזכור שהמצב המדויק הדרוש להתאמת פרוטוקול זה לחלבון אחר עשוי להיות שונה ממה שתואר כאן.יש לנקוט בזהירות באופטימיזציה של הפרמטרים הבאים, איכות הטיהור, יעילות חומר הניקוי, ספיגת שלב מסיס של חומר הניקוי, הרכב השומנים ויחס השומנים לחלבון. בנוסף, תקופות זמן טמפרטורה ודגירה נוטות להשפיע על כל הפרמטרים הללו. הפרוטוקול שלנו פותח את הדרך להבנה טובה יותר של הפעילות של תערובת משאבות r ו-d flix B.עם זאת, אם הוא נמכר במיוחד עבור טרנספורטר מו"פ, ניתן להתאים שיטה זו לכל מוביל דואר זבל FFL המופעל על ידי PMF.

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

מקור: Bru, J., et.al. הדמיית זמן-lapse של נחילי חיידקים ותגובת הלחץ הקולקטיבית. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים כיצד לדמיין ולמדוד התנהגות הימנעות מנחילים ב-Pseudomonas aeruginosa באמצעות בדיקת צלחת אגר נחיל. הוא מציג את ההגדרה להדמיית זמן-lapse בתנאים מבוקרים ומסביר כיצד אותות מתח הנגרמים על ידי אנטיביוטיקה מכוונים מחדש את תנועת החיידקים, אשר מכומתת באמצעות ניתוח תמונה.

הדמיה וכימות תגובות הימנעות מנחילים ללחץ אנטיביוטי ב-Pseudomonas aeruginosa

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומשתנה של מודל העכבר של זיהום כדי להעריך את הנחת של זנים מהונדסים גנטית של הפסאודומונס aeruginosa בהשוואה לארצות הברית מינהל המזון והתרופות (FDA)-מאושר es, האנציכיה ליישומים מסחריים.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

זרימת עבודה זו יכולה לשמש לביצוע בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות מודל ex vivo הוקמה של ביופילם חיידקי בריאות של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס. שימוש במודל זה יכול לשפר את התוקף הקליני של MBEC (ריכוז מיגור ביופילם מינימלי) מבחנים.

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

כיום חסרים מודלים in vivo המתאימים לבדיקת תרופות נגד זיהומים חיידקיים כרוניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לזיהום פצע על ידי מבודד קליני של Pseudomonas aeruginosa כדי ליצור זיהום מתמשך בזחלי דג הזברה.

מידול זיהום מתמשך של Pseudomonas aeruginosa בזחלי דג זברה פצועים

עמידות לאנטיביוטיקה בקרב זני Escherichia coli פולשניים דבקים מהווה אתגרים בהערכת פלישה חיידקית באמצעות בדיקת הגנה מסורתית של ג'נטמיצין. מתוארת שיטה משופרת להערכת פלישת חיידקים באופן כמותי על ידי מניית יחידות יוצרות מושבות ובאופן איכותי באמצעות הדמיה של תאים נגועים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנציה.

בדיקת הגנה על אמיקצין לכימות והדמיה של פלישת תאי אשריכיה קולי

חקור את פעילות משאבת הזרימה MexAB מ-Pseudomonas aeruginosa בשיטה מבוססת שיקום חלבוני ממברנה בליפוזומים. הפרוטוקול מאפשר יצירת מפל פרוטונים הניתן לכוונון לחקר מנגנוני תחבורה מולקולריים וסינון תרופתי של מעכבים פוטנציאליים.

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

גלה סרטונים נוספים