זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי
30 בדצמבר 2013
זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.
BioRad V three Workflow מספק לחוקרים כימות אמין יותר וביטחון בתהליך הכתמים המערבי. זה מושג על ידי שימוש ראשון בג'לים נטולי כתמים TGX כדי להפריד ולדמיין דגימות חלבון. לאחר ההפרדה מועברים חלבונים לממברנה באמצעות מערכת ההעברה המהירה של הטורבו הכתם המאפשרת אימות איכות ויעילות ההעברה.
לאחר אימות ההעברה, הממברנה נחסמת ונבדקת בנוגדנים ראשוניים ומשניים לחלבוני המטרה. לבסוף, רמות חלבון המטרה מנורמלות באמצעות מדידת החלבון הכולל ללא כתמים כבקרת העמסה. זרימת העבודה של V three מביאה נוחות ושקיפות לתהליך הכתמים המערבי, ומספקת לחוקרים ביטחון בכל שלב מהפרדה ועד העברה וכימות.
היתרון העיקרי של זרימת העבודה V three Western על פני כתמים מערביים מסורתיים הוא שטכנולוגיה נטולת כתמים מציעה בקרת טעינת חלבון כוללת מעשית, נוחה ואמינה לנורמליזציה של אותות חלבון היעד שלך. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לאמינות של מתודולוגיות בקרת העמסה עבור טכניקת הכתמים המערביים הכוללות רוויה יתר של אותות חלבון משק בית ורמות הביטוי הדיפרנציאליות של חלבוני משק בית בתנאי ניסוי משתנים. גילינו כי ניתן לדמיין חלבונים המופעלים בג'לים ללא כתמים גם על בלושים ללא צביעה נוספת, מה שמאפשר להשתמש בהם כחלופה לכתמי חלבון קונבנציונליים, כמו גם בקרות העמסת חלבון משק בית.
בדקות הקרובות, נדגים את זרימת העבודה המלאה של V 3 באמצעות פלואורסצנטיות מרובה. ניתן להשתמש באותו הליך גם לכימילומינסנציה לאחר הכנת דגימות חלבון על פי פרוטוקול הטקסט. בעזרת קריטריון TGX שחרר כל ג'ל טרומי KD, הסר את המסרק והסרט מתחתית הקסטה.
הנח את הקסטה במנגנון הג'ל ומלא את שני המאגרים במאגרים פועלים. טען את תקני החלבון והדגימות. לאחר מכן הפעל את הג'ל למשך 20 דקות בחום של 300 וולט.
לאחר השלמת האלקטרופורזה, השתמש בכלי פתיחת קלטת הג'ל על מכסה תא הקריטריון כדי לפתוח את הקסטה. לאחר מכן מרחו כמה מיליליטר מים על מתמר ה-UV של מצלמת Chemi Dock MP. הרם בזהירות את הג'ל מהקסטה והנח אותו על תוכנת UV Trans Illuminator Launch Image Lab והגדר פרוטוקול ערוץ יחיד חדש לג'לים נטולי כתמים תוך שימוש בזמן ברירת המחדל של הפעלת ג'ל של דקה אחת, בחר את סוג הג'ל המתאים ואת האופטימיזציה האוטומטית המוגדרת כברירת מחדל עבור להקות אינטנסיביות.
לאחר מכן לחץ על הפעל פרוטוקול. לאחר השלמת לכידת התמונה, דמיין את ההפרדה ואת איכות הדגימה. ואז המשך מיד לשלב ההעברה.
כדי לבצע העברת חלבון, פתח חבילת העברת טרנס בלוק טורבו MIDI PVDF. הנח את הערימה התחתונה במרכז בסיס הקלטת. הסר את הג'ל מההדמיה.
יישר את הג'ל על גבי הממברנה. השתמש בעדינות ברולר הכתם כדי להסיר בועות אוויר בין הג'ל לממברנה. לאחר מכן, יישר את הערימה העליונה על גבי הג'ל.
לאחר הסרת בועות אוויר, הנח את מכסה הקסטה על הבסיס. לחץ על המכסה כלפי מטה בחוזקה, סובב את החוגה בכיוון השעון כדי לנעול והכנס את הקסטה לאחד משני מפרצי הכתמים. במסך הבית, בחר את פרוטוקול הטורבו.
בחר את שני המיני או מיני ג'ל אחד, ולחץ על כפתור ההפעלה למפרץ המתאים. ההעברה תושלם תוך שבע דקות. הסר את הקסטה מהמפרץ.
פתח את נעילת הקסטה ופרק את כריך הספיגה. הנח את הג'ל לאחר ההעברה על ה-UV transluminator של מצלמת ה-Chemi dock MP, והנח מיד את הממברנה במים נטולי יונים. הגדר פרוטוקול ערוץ יחיד חדש לג'לים נטולי כתמים ללא זמן הפעלה.
בחר את סוג הג'ל המתאים והגדר ידנית את זמן החשיפה לזה של הג'ל לפני ההעברה ולחץ על פרוטוקול הפעלה. לאחר השלמת לכידת התמונה. ודא את יעילות ההעברה על ידי השוואת עוצמות פס הדגימה בין הג'לים לפני ואחרי ההעברה.
הסר את הג'ל ממגש הדגימה מכיוון שהוא כבר לא נחוץ והשליך. כדי לאמת, העבר לכתם. הנח את הממברנה על מגש הדגימה והגדר פרוטוקול ערוץ יחיד חדש.
לכתם ללא כתמים. בחר את סוג הג'ל המתאים ואת המיטוב האוטומטי של ברירת המחדל לרצועות אינטנסיביות. לאחר מכן לחץ על הפעל פרוטוקול.
לאחר השלמת לכידת התמונה, ודא את ההעברה לממברנה. הסר את קרום הכתם ממאיר הטרנס UV והנח אותו במאגר חוסם להכתמה מערבית. לאחר דגירה של הממברנה בטמפרטורת החדר למשך שעה, דגרו אותה עם נוגדנים ראשוניים של עכבר וארנב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.
שפכו את תמיסת הנוגדנים והשתמשו ב-50 מיליליטר TBST כדי לשטוף את הכתם למשך חמש דקות. דגרו את הכתם עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורסצנטיים, אנטי מוזה ואנטי ארנב למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש ב-TBST כדי לשטוף את הכתם חמש פעמים במשך חמש דקות כל אחת.
כדי לצלם את הכתם, הנח אותו על תאורת הטרנס UV של מצלמת Chemi doc MP בתוכנת מעבדת תמונות. הגדר פרוטוקול רב-ערוצי חדש. הגדר את הערוץ הראשון על ידי בחירת dite six 50 תחת יישומי כתמים והשתמש באופטימיזציה האוטומטית המוגדרת כברירת מחדל עבור להקות אינטנסיביות.
חזור על שלבים אלה כדי להגדיר את הערוצים 2 ו-3 עבור DITE 5, 49 וכתם ללא כתמים בהתאמה. בחר את סוג הג'ל המתאים ולחץ על פרוטוקול הפעלה. כדי להגדיר נתיבים, בחר את הנתיב והרצועות של התמונה ללא כתמים.
לאחר מכן איתור נתיב אוטומטי לכימות מדויק. ודא שפרופילי הרקע בכל נתיב דגימה דומים על ידי התאמת גודל הדיסק המתגלגל ל-70. אשר את אחידות הרקע על-ידי סריקה של כל פרופילי הנתיב כדי להגדיר רצועות בשני הערוצים, שישה 50 ו-5 49
.השתמש בכלי לאיתור הרצועות כדי לזהות רצועות באמצעות הגדרות הרגישות המוגדרות כברירת מחדל. כדי לייעד את ערוץ הנורמליזציה, חזור לארגז הכלים של הניתוח. לחץ על נורמליזציה ובחר כתם ללא כתמים, וודא שנבחר חלבון נתיב כולל.
כדי להקצות את הנתיבים הסטנדרטיים של המשקל המולקולרי לארגז הכלים של הניתוח, לחץ על כלי ניתוח MW וסמן את התיבה מתחת לנתיב המתאים. לבסוף, כדי להציג את עוצמות רצועת החלבון המנורמלת, לחץ על טבלת הניתוח בסרגל הכלים. התוכנה תיצור באופן אוטומטי טבלה המכילה עוצמות נפח, גורמי נורמליזציה ואמצעי אחסון מנורמלים.
יש להשתמש באמצעי האחסון המנורמלים לניתוח נתונים ודיווח. ניתן לייצא את הטבלה. לניתוח נוסף, הדגמנו את זרימת העבודה המלאה של V three Western Blotting.
כעת נציג בפניכם תוצאות מייצגות מניסוי אמיתי. תרביות תאי לימפובלסטים של בקרה ולימפובלסטים מוקרנים נותחו באמצעות זרימת העבודה V three Western blot. אות החלבון הכולל ללא כתמים מופיע בכחול.
חלבון המטרה M CM 7 מוצג באדום, ובקרת העמסת חלבון משק הבית המאומתת GA DH מוצגת בירוק. GA DH אומת כבקרת העמסה מתאימה על ידי הערכת הליניאריות שלו באמצעות תנאי הניסוי המתוארים בסרטון זה. אותות החלבון הכוללים ללא כתמים עבור כל נתיב על הכתם נמדדו באמצעות תוכנת מעבדת תמונות.
שבע עוצמות אותות MCM נורמלו הן באמצעות החלבון הכולל והן באמצעות אותות GA DH. MCM שבעה נפחי פס חלבון מנורמלים בשתי השיטות חשפו ירידה של 25% ברמות הביטוי בדגימות מוקרנות ביחס לדגימות הביקורת לפני נורמליזציה מדויקת. חלבון משק הבית דורש אימות המאשר את הטווח הליניארי שלו ואת רמות הביטוי העקביות שלו בין דגימות ללא אימות.
בקרות העמסת חלבון משק בית אינן מבטיחות נורמליזציה מדויקת. לעומת זאת, נורמליזציה כוללת של חלבון אינה דורשת אימות. לפיכך, אות החלבון הכולל ללא כתמים המתקבל על ידי זרימת העבודה V three מציע בקרת טעינה מעשית, נוחה ואמינה יותר תוך כדי ניסיון הליך זה.
זכור כי טכנולוגיה נטולת כתמים מאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של דגימות חלבון באמצעות שינוי קוולנטי המושרה על ידי UV של שאריות טריפטופן זמינות. רק במקרים נדירים שינוי זה ישפיע באופן משמעותי על יישומים במורד הזרם כגון זיהוי חיסוני או ספקטרומטריית מסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את זרימת העבודה המערבית V three ונורמליזציה כוללת של חלבון ללא כתמים.
למרות שהדגמנו את זרימת העבודה הזו עבור כתמים מערביים פלואורסצנטיים מרובים, ניתן להשתמש בטכנולוגיה נטולת כתמים גם לנורמליזציה מוחלטת של חלבון עם כתמים מערביים זוהרים.
סקירה כללית
תהליך העבודה של V3 הוא פרוצדורת western blot המשתמשת בגלים נטולי צביעה (stain-free), ובכך משפרת את הוויזואליזציה והכימות של החלבונים. שיטה זו מאפשרת בקרה אמינה על כמות החומר שהועמס (loading control) ואימות של יעילות העברת החלבון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ניתוח חלבונים
רקע
- בלוטינג מערבי (Western blotting) הוא טכניקה נפוצה לאנליזה של חלבונים.
- טכנולוגיה נטולת צביעה (Stain-free technology) משפרת את מהימנותם של ביקרי טעינה.
- שיטות מסורתיות עלולות לסבול מרוויית-יתר של חלבוני בית.
- סבב העבודה של V3 מציע חלופה מעשית לכימות חלבוני מטרה.
מטרת המחקר
- להדגמת תהליך העבודה של V3 עבור western blotting.
- לתיקוף השימוש בג'לים נטולי צביעה (stain-free) כביקורת העמסה.
- להגברת הביטחון בשיטות לכימות חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בג'לים מסוג TGX stain-free להפרדת חלבונים.
- העברה מהירה של חלבונים לממברנות באמצעות מערכת blot turbo.
- חסימה (Blocking) וסריקה של ממברנות באמצעות נוגדנים לחלבונים המטרה.
- נורמליזציה של רמות חלבוני המטרה באמצעות מדידת חלבון כולל בשיטת stain-free.
תוצאים עיקריים
- טכנולוגיית Stain-free מאפשרת ויזואליזציה ללא צביעה נוספת.
- ניתן לוודא את יעילות ההעברה על ידי השוואה בין הג'לים לפני ואחרי ההעברה.
- נורמליזציה באמצעות ג'לים מסוג Stain-free משפרת את דיוק הכימות.
- תהליך העבודה משפר את השקיפות והנוחות בביצוע Western blotting.
מסקנות
- תהליך העבודה של V3 מספק שיטה מהימנה לניתוח חלבונים.
- ג'לים נטולי צביעה (Stain-free) משמשים כביקורות טעינה יעילות.
- שיטה זו נותנת מענה למגבלות של טכניקות מסורתיות של western blotting.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סבב העבודה של V3 stain-free פותר צוואר בקבוק קריטי בבליטינג מערבי (Western blotting) על ידי אספקת בקרת טעינה כמותית ומעשית של חלבון כולל, המבטלת את הצורך בתיקוף של חלבוני בית (housekeeping proteins). דבר זה משפר את מהימנות הנתונים ומאיץ את קבלת ההחלטות בתהליכי תיקוף מטרות ואופטימיזציה של מובילים (lead optimization), שבהם יש לכמת במדויק שינויים בביטוי חלבונים. על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בזמן אמת של איכות הג'ל, יעילות ההעברה ואותות מטרה מנורמלים, סבב העבודה מפחית את אי-הוודאות הניסויית ותומך בהפחתת סיכונים של מטרות פרה-קליניות באופן הדיר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות נרמול מדויק של רמות חלבון המטרה ללא הסתמכות על חלבוני בית (housekeeping proteins) שעשויים להיות משתנים.
- ערך תפעולי: מפחית את הזמן המושקע בהסרת חלבונים (stripping) ובחשיפה חוזרת (reprobing) של הבלוטים עבור בקרות העמסה, ובכך מגביר את התפוקה במבחני תיקוף של חלבון המטרה.
- ערך ניבוי: תומך בקבלת החלטות בטוחה של go/no-go על ידי מזעור של תוצאות חיוביות/שליליות שגויות הנובעות מנרמול לא מספק בניתוח מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להכנת ליזטים ותיקוף איכות הדגימה לפני סריקת תרכובות.
- פלט כמותי: מייצרת מדידות של חלבון כולל ללא צביעה, המשמשות כבקרת טעינה אוניברסלית התואמת לגילוי פלואורסצנציה ומולטיפלקס ולכימילומניסצנציה.
- יכולת הרחבה: תואם לג'לים מוכנים מראש (precast gels) ומערכות העברה מהירות, מה שמאפשר שילוב בתהליכי עבודה אוטומטיים או חצי-אוטומטיים של Western blotting לאישור פגיעות (hit confirmation).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מבטיחה כימות חלבון עקבי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי ביטול השונות הנובעת משינויים בביטוי של חלבוני בית (housekeeping proteins) תחת תנאי עקה או טיפול.
- הלימה של סמנים ביולוגיים: תומכת בזיהוי מהימן של סמנים ביולוגיים תרגומיים, במקרים שבהם נורמליזציה של חלבון כולל מועדפת על פני שימוש בחלבוני בית שעשויים להשתנות במודלים של מחלה.
- קידום מותאם סיכונים: מגבירה את רמת הביטחון בנתוני יעילות פרה-קליניים על ידי אספקת שיטת נורמליזציה מתוקפת, שאינה דורשת תיקוף נפרד עבור כל תנאי ניסויי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
סבב העבודה של V3 משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקות ראשוניות של מעורבות המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות, שבהן כימות מדויק של חלבונים חיוני לאישור המנגנון ולמחקרים של קשר מבנה-פעילות (SAR).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות למדידה מדויקת של מודולציה של חלבון מטרה בתגובה להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- סריקה: משפרת את מהימנות הבדיקה על ידי אימות שלמות הג'ל ויעילות ההעברה, ובכך מבטיחה שאותות המושרים על ידי תרכובות משקפים שינויים ביולוגיים אמיתיים.
- אנליטיקה: מספקת עצימויות מנורמלות של פסי חלבון באמצעות תוכנת Image Lab, מה שמאפשר השוואה ישירה בין קבוצות טיפול ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מקלה על ההמשכיות למחקרים פרה-קליניים על ידי אספקת שיטה לבקרת טעינה העמידה לשינויים בתנאי הניסוי המשפיעים על חלבוני בית.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת סטנדרטית, ללא תלות בפלטפורמה, לכימות חלבונים שניתן לחלוקה בין מחלקות ופרויקטים ללא צורך בתיקוף מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי אספקת שיטת נורמליזציה אמינה שאינה מושפעת ממודולציה ניסויית של חלבוני בית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור ומקצר את זמן העבודה המעשית באמצעות שלבים מהירים של צביעת ג'ל, העברה ודימוג.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת מספר הניסויים שנכשלו עקב נורמליזציה לקויה ומאפשר איטרציות מהירות יותר במסעות SAR.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף של מטרות מותאם סיכון על ידי שיפור איכות הנתונים במחקרי יעילות ומנגנון פעולה בשלבים מוקדמים.
שיקולי יישום
- נדרשת היכרות עם טיפול בג'לים ללא צביעה (stain-free) ומערכות דימוי המופעלות ב-UV, כגון הדמייה מסוג Chemi Doc MP.
- הביצועים האופטימליים תלויים בגישה לג'לים מסוג Bio-Rad TGX stain-free ומערכות העברה מסוג Blot Turbo.
- נדרש סטנדרטיזציה של הגדרות תוכנת Image Lab לצורך זיהוי נתיבים (lanes), תיקון רקע ונורמליזציה בין משתמשים שונים.
- עשוי לדרוש התאמה בעת שימוש באחוזי ג'ל או בסוגי ממברנות שאינם סטנדרטיים, אם כי גמישות הפרוטוקול הוכחה הן עבור פלואורסצנציה והן עבור כימילומינצנציה.
- מוגבל על ידי הצורך במדמיות תואמות UV; אינו תואם למערכות סטנדרטיות המיועדות לכימילומינצנציה בלבד ללא יכולת לכידת תמונה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Gel Electrophoresis with Stain-free Gels and Ge Imaging
3:29
Protein Transfer with Trans-blot Turbo System and Antibody Incubation
6:32
Imaging and Calculating the Total Protein Normalization: Image Lab
8:53
Total Protein Normalization Results for MCM-7 in Irradiated Lymphoblastoid Cells
10:43
Conclusion
