Name: ייצור של ארנבים נוק אפוליפופרוטאין C-III באמצעות nucleases אצבע האבץ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למד לייצר ארנבים נוקאאוט ל-Apolipoprotein C-III באמצעות nucleases אצבע האבץ. שיטה זו מדגימה עריכת גנים יעילה למחקר מחלות לב וכלי דם בבני אדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (HL105114, HL088391, NS066652, וHL068878 לYEC), איגוד הלב האמריקאי (National מדען פיתוח 0835237N לJZ). YEC נתמך כלכלית כמו פרדריק Huetwell פרופ ניחן של לב וכלי דם לרפואה במרכז הרפואי של אוניברסיטת מישיגן (UMMC). עבודה זו מנוצל שירותי ליבה נתמכים על ידי מרכז למודלים מתקדמים למדעי Translational וTherapeutics (CAMTraST) בUMMC.

כל נהלי תחזוקת בעלי החיים, הטיפול ושימוש היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת האוניברסיטה בשימוש וטיפול של בעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן. 1. ZFN עיצוב ובחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את מידע רצף הגנומי של הגן של עניין (למשל ארנב ApoCIII) ליצרן. בחר קבוצת ZFN (ים) לניסויים המבוססים על ציוני ZFN. </li></ol> 2. אוסף עובר ארנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superovulate מיני התבגר (6-18 חודשים) ניו זילנד לבנה (NZW) ארנבות נשיות על ידי הזרקה תת עורית (SC) של FSH פעמיים / יום עם מינון של 3 מ&quot;ג לשתי הזריקות הראשונות, 5 מ&quot;ג לשתי הזריקות הבאות ו6 מ&quot;ג לשתי הזריקות האחרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל (iv) הזרקה תוך ורידית אחת של 200 IU hCG ב72 שעות לאחר הזרקת FSH הראשונה כדי לגרום לביוץ. Mate נקבות superovulated עם ארנב זכר מייד לאחר הזרקת hCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Euthanize ארנבות תורם superovulated עם נתרן pentobarbital (150 מ&quot;ג / קילוגרם, ד) בשעה 16-18 לאחר שעה הזרעה (psi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר ampullae oviduct ידי איסוף מבנה oviducts והשחלות כל זהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן כל oviduct עם מדיום מניפולציה 10 מיליליטר של HEPES נאגר TCM 199 תוספת 10% בסרום שור עוברי, על ידי הזרקה בינונית מקצה הרחם של oviduct. אסוף הבינוני הסמוק בפתיחת השחלה-end של oviduct לצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתבונן ולזהות עוברים התאוששו במדיום הסמוק, לשטוף את העוברים שלוש פעמים במדיום המניפולציה, לשמור אותם במדיום המניפולציה ב38.5 מעלות צלזיוס באוויר, ולבחון אותם תחת סטראו להתרחשות של הפריה. היכונו microinjection על עוברי שלב pronuclear 19-21 h psi </li></ol> 3. הכנת ZFN mRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה-mRNA וכתוצאה מכך לפני resuspension בRNAse ללא 0.1X TE (1 מ&quot;מ טריס-Cl-pH8.0, 0.1 mM EDTA). למדוד את הריכוז ולאחסן את ה-mRNA ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את mRNAs קידוד זוג ZFN (4-10 ng / μl ב1 mMTris-Cl, 0.1 mM EDTA ב-pH 7.5), aliquot לתוך 10 בקבוקוני μl. אחסן אותם ב-80 º C עד מוכן לשימוש. לפני microinjection, להפשיר את בקבוקון RNA (ים), ולשמור אותו על קרח. </li></ol> 4. Microinjection עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פלטפורמת microinjection ידי הצבת ירידה של 5 μl של מדיום מניפולציה בשקופית קאמרית 1 היטב שיש לו את תא התקשורת הוסר. כסה את הירידה בינונית עם שמן מינרלים ומקום על הבמה מיקרוסקופ המחוממת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיפטה מחזיקה (120 מיקרומטר קוטר) לתוך זרוע בעל micromanipulator ולמקם אותו לירידה של מדיום מניפולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק micropipettes הזרקה על ידי חימום ומושך צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט במכשיר חולץ micropipette. טען את ה-mRNA להיות מוזרק בפיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הפעל את אספקת האוויר הדחוס שמחוברת לmicroinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיפטה הזרקה לבעל ההזרקה, לשים אותו על micromanipulator ומקם אותה לירידה של מדיום מניפולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת microinjector, עם הפרמטרים הציעו הבאים: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, שניות Injtime = 1, אשר תגרום נפח הזרקה של 1-5 pl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קצה פיפטה הזריקה בעדינות על ידי הקשה עליו נגד פיפטה מחזיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים (30-50) עד טיפת המיקרומניפולציה על הרציף. השתמש פיפטה מחזיקה ללכוד עובר וליישר את מחט הזריקה, עובר ופיפטה מחזיק לאורך ציר ה-x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הגדלה 400X, לקדם את פיפטה ההזרקה דרך את העובר. להיות זהיר, כדי למנוע את הגרעין. ברגע שקרום הפלזמה הוא פירסינג, דוושת רגל העיתונות להזריק. לאחר הזרקה, למשוך את המחט, שחרר את העובר. חזור על התהליך עבור כל אותם שנותרוbryos. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עוברים הזריקו שלוש פעמים במדיום תרבות עובר, אשר מורכב מתמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) בתוספת חומצות אמינו חיוני (NEAA), חומצות אמינו חיוניות (EAA), 1 מ&quot;מ L-גלוטמין, פירובט נתרן 0.4 מ&quot;מ, ו10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר ב38.5 ° C ב 5% CO 2 באוויר במשך 1-2 שעות לפני שהם מועברים בניתוח לתוך oviducts של ארנב NZW נשי נמען מסונכרן (ראה שלב 5.1). לחלופין, תרבות העוברים עד שהם מגיעים שלב הבלסטוציסט לפני שהם משמשים במבחנת אימות או מבחני. </li></ol> 5. העברת עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ארנב נשי NZW ישן 5-12 חודשים, בבריאות טובה, במשקל של כ. 4.0-5.0 קילוגרם כחית נמען. לנהל גונדוטרופין הורמון משחרר (GnRH) לשריר בהזרקה (IM, 50 מק&quot;ג / מיליליטר, 0.3 מיליליטר / בעלי חיים) לנמען באותה נקודת הזמן עם זה של הזרקת hCG לבעלי חי התורם (ים) (ראה שלב 2.2). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת microinjection, להכין את ארנב הנמען להעברת עובר (בדרך כלל 16-24 שעה לאחר הזרקת GnRH). להרדים את הארנב עם 10-40 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין (IM), ו / או isoflurane מתאדה (2-4%) באמצעות שאיפה. להגן על העיניים של הארנב מייבוש יתר על ידי היישום של משחת עיניים סטרילית. שים לב לבעלי החיים עד שהוא לא מודע באופן מלא, כלומר. אינו מגיב לרפלקסים דוושה; לסחוט את כרית כף הרגל משמשת לבדיקה לחוסר רפלקס דוושה שהוא אינדיקציה להרדמה נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את בטנו של הארנב, לשטוף עם לשפשף חיטוי, ואחריו פתרון אנטיספטי, ולנגב את האזור המגולח עם ספוגים גזה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח בתנאים סטריליים, להקליט סימנים חיוניים של ארנב הנמען בערך כל דקות 15 לאורך כל הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10-25 עוברים לחית נמען אחד, תלוי במספר זמין של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו שלפרוצדורות כירורגיות, סגרו את שכבת השריר עם תפר נספג מצופה. לתפור את העור עם או תפר subcuticular באמצעות תפר נספג או עם תפרי עור הופסקו פשוטים באמצעות תפר nonabsorable (למשל ניילון monofilament או דומה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור החמים לבעלי החיים ולפקח על זה עד שעינת חזה תושג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על בעלי החיים מדי יום. עקוב אחר ההוראות של הווטרינר לטפל בבעלי החיים. לנהל meloxicam (1.0 מ&quot;ג / קילוגרם sc) כדי להקל על כאב ו / או להפחית את הפוסט יומי חום פעולה אם נקבע צורך על ידי הווטרינר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תפרי עור nonabsorable בכ 10-14 לאחר ימי מבצע. </li></ol> 6. איתור של שיבוש גנטי ZFN מושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאימות במבחנה, לבצע גנוטיפ בעוברים בתרבית במבחנה. עוברי אדם Lyse שפיתחו לשלבי morula / הבלסטוציסט ב5 פתרון NP40 μl (NP40 1% בתוספת 1 ug / מיליליטר proteinase K בתקי הצפת) ל0.5-1 שעות ב55 מעלות צלזיוס, ו10 דקות ב 95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגנוטיפ של הצאצאים, לאסוף דגימות עור אוזן מערכות שזה עתה נולדו, לחלץ הדנ&quot;א הגנומי, ולהשתמש בם כתבניות עבור סידור ה-PCR. החל Kwik-Stop לאזור הדגימה לאחר איסוף כדי לעצור את הדימום ולהפחית את אי הנוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תמוגה מצעד 6.2 או 6.3 כתבנית לPCR באמצעות LA-תקי וזוג PCR פריימר, אשר ממוקמים במעלה הזרם (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &quot;) ומורד הזרם (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&quot;) של אתר יעד ZFN . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-PCR ורצף אותם עם פריימר רצף (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות דגימות מוטציה על ידי מחפש עקומה כפולה בתרשים הרצף סביב אתר המיקוד. לתייג את אלה עם קימורים כפולים כמו &quot;חיובי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את המוצרים &quot;חיוביים&quot; PCR לוקטור שיבוט ת&quot;א, להרים 10-20 שיבוטים, רצף מוסיף, ולאשר את המוטציות סביב tאתר argeting. </li></ol>

<ol><li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+C-III%3A+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li>
<li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li>
<li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li>
<li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li>
<li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+%28VLDL%29+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li>
<li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li>
<li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li>
<li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+physiology+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li>
<li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li>
<li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li>
<li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+%28WHHL%29+rabbit%2C+its+characteristics+and+history+of+development%3A+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li>
<li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li>
<li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+%27molecular+scissors%27+for+transgenic+farm+animal+production%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility%2C+and+Development%22%5BJournal%5D)">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li>
<li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045(2011).</li>
<li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28X-SCID%29+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870(2010).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li>
<li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

בעבודה הנוכחית, חמש ארנבות ApoCIII KO היו שנוצרו באמצעות טכנולוגית ZFN. בעבר הדיווח רק מהייצור של ארנבי GTT גם השתמש בטכנולוגית ZFN 18. העבודה הנוכחית אישרה כי ZFN שימושי למקד ביעילות גנים בארנבות. במחקר הנוכחי, השיעור המהונדס (נולד ערכות / סך חיובי) is23.8% (5/21), שהיא דומה לזו של הדו&quot;ח הקודם ZFN בארנבים (30.8%, 16/52) 18, ודיווחו אלה של שימוש ZFN בבעלי חיים אחרים, כוללים דגי זברה 19, עכברים 20, חולדות 21 וחזירים 17. שיעור זה הוא למעשה גבוה יותר מהשיעורים של רבים מחקרי ייצור ארנב מהונדס קונבנציונליים, אשר בדרך כלל נופלים בטווח של 5-20%. לדוגמא, במאמץ ארנבות מהונדסים המוצר ApoCIII באמצעות microinjection דנ&quot;א הקונבנציונלי, דינג et al. השיג 3 מייסדים חיוביים מתוך 54 גורים נולדו (5.6%) 22. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים, המוטציות באתרי המיקוד משתנות, כוללים מחיקות או הוספות מורכבות מספר שונה של בסיסים (החל 1-21 בחמש ארנבות KO). בהתבסס על מידע שרצף המסוים של בעלי החיים המייסד, הוא ניבא כי לפחות ארבעה (כלומר. אלה המכילים Δ1, +1, +1, או Δ20 מוטציות) היו אובדן פונקציה של ApoCIII. בעלי החיים R-16 עם Δ21 עשוי שלא להציג אובדן פונקציונלי, כמוטציה זו צפויה ירידה בגורם היחידה של שבע חומצות אמינו, אך לא לשינוי מסגרת קריאה. סופו של דבר, מבחני הפנוטיפ נחוצים כדי לקבוע אם חיות מייסד אלה באמת להציג את האובדן של פונקציות ApoCIII. אף אחד מחמש ארנבות KO שנוצרו במחקר הנוכחי מכיל שינויי biallelic. מעניין, זה גם המקרה בדו&quot;ח ארנב ZFN הקודם. לעומת זאת, כאשר ZFNs מיקוד ,3-galactosyltransferase α1 יושמו חזירתאים, את התדר של מיקוד אלל אחד נע 7-46%, עם כשליש ממוטציות יוצרות בשלב יחיד biallelic knockouts 23. עולה בקנה אחד עם זה, כאשר Talen היה מוחל על תאי פיברובלסטים חזיר, שינויי biallelic נמצאו בכ 15-40% מהשיבוטים החיוביים בסך הכל 14. יתכן כי הכישלון לייצר ארנבות KO biallelic במחקר הנוכחי עשוי להצביע על הבדל מינים (כלומר ארנבים לעומת חזירים) עבור כגון קיבולת של גן nuclease מבוסס מיקוד. היא, לעומת זאת, סבירה יותר שזה פשוט כי מספר ארנבי KO שנוצרו בפרויקט זה הוא קטן יחסית. אנו מאמינים כי ZFN היא מסוגל לייצר מוטציות bialleic בארנבים, שצריך להיחשב כעוד יתרון פוטנציאלי של ייצור ארנב GTT מבוסס ZFN. יש צורך בניסויים נוספים כדי לאשר כגון קיבולת של ZFN בארנבות. לסיכום, העבודה הנוכחית מדגימה כי Zהגן מבוסס FN גישת יעדים הוא יעיל בייצור ארנבות KO. בפרט, אנו נוצרו חמש ארנבות ApoCIII KO עם שיעור מהונדס משביע רצון של 23.8%. הם האמינו בעלי חיים אלה כדי לספק מידע משמעותי יותר על תפקידו של חלבון זה בחילוף חומרים של שומנים בבני אדם מאשר המודלים העכבר המתאימים. אנו צופים מיקוד מבוסס ZFN גן, כמו גם טכנולוגיות nuclease מבוססות אחרות כגון Talen וRGEN, בבעלי החיים nonmurine באופן משמעותי להקל על הפיתוח של מודלים של בעלי חיים רומן ללמוד מחלות אנושיות שונות. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. תרשים זרימה של ייצור של ארנבים בנוקאאוט תוך שימוש בטכנולוגית ZFN. ייצור של ארנבי KO באמצעות טכנולוגיית ZFN מתחיל עם הבחירה של הגן של עניין. מידע הרצף מסופק, ערכות ZFN נועדו, וSubjected לשמרי אימות בבית מבוסס. בעת ביצוע צ&#39;ק 1 נקודה (CP-1) (CP), רק אלה סטים עברו אימות בבית (50% או גבוהים יותר של השליטה הפנימית החיובית) יינתנו למשתמשים לבחירה. אם לא סטים יעברו CP-1, רצף נוסף עשוי להיות נחוץ לעיצוב סטי ZFN יעילים. אימות עובר במבחנה ואחריו על מנת להבטיח את סט ZFN נבחר יכול לגרום למוטציות באתרים נבחרים (CP-2). סט ZFN (ים) ישמש רק אם הוא עובר CP-2 (&gt; = שיעורי מוטציה 10% בעוברים במבחנה). כישלון בCP-2 ידרוש תכנון מחדש של ערכות ZFN. תורמי עובר יהיו מוכנים ועוברים שלב pronuclear יהיה microinjected עם סטי ZFN אומתו. עוברי microinjected אלה יועברו למקבלי עובר מסונכרנים. לאחר תקופת הריון חודש אחד, תינוקות יהיו genotyped (CP-3). אם אף אחד מהתינוקות הם חיוביים, microinjection נוסף יבוצע. זה לוקח 2-3 חודשים מתחילת הפרויקט לCP-2, בהנחת nכישלון o במהלך התהליך. זה לוקח 2-3 חודשים נוספים מCP-2 לCP-3. לכן זה אפשרי ליצור ארנב בנוקאאוט במסגרת זמן 4-6 חודש באמצעות טכנולוגית ZFN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. עיצוב ZFN. שלושה סטי ZFN (Set 1, 2, ו -3) נועדו מיקוד רצפים שונים על אקסון 1 או אקסון 2 של הארנב ApoCIII (א &#39;). כל שלוש הקבוצות היו נתונים assay הכתב MEL-1 שמרים כדי לקבוע את פעילות ZFN. על פי הפרוטוקולים של הייצור, ZFNs המציג פעילויות&gt; 50% מזה של השליטה הפנימית החיובית של הייצור נחשבים שימושי עבור במבחנה ובניסויים בעריכת הגנום vivo.פעילויות ZFN היו 224.2% עבור 1 סט, 196.9% לסט 2 ו177.8% לסט 3 (ב), ולכן הגדרה 1 נבחר במחקר הנוכחי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. אימות עובר במבחנה של ZFN. MRNA (5 מיקרוגרם / מיליליטר) של 1 סט היה microinjected לציטופלסמה של 35 עוברי ארנב שלב pronuclear (א &#39;). עוברים סמוקים ללא טיפול microinjection (n = 31 ב) שימשו כקבוצת ביקורת. קצב פיתוח BL היה 77.4% בקבוצת הביקורת. בקבוצת microinjected, שיעור BL היה 51.4%. 16 BLS נתון רצף ה-PCR, 8 (50%) זוהו כחיובי, המעיד על 1 סט הוא סט ZFN יעיל כדי לגרום למוטציות בtargeאתר טינג (B, apoc3wt.seq, שחור בקופסה) של ApoCIII בארנבות. BLS המכיל מוטציות הם # אייפוק-3 BL, 4, 5, 7, 11, 13, 15, ו17 (B, אדום עם קו תחתון). BLS שנותר (# אייפוק-2, 6, 9, 10, 12, 14 ו16) אין לי מוטציות באתר המיקוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. ייצור של ארנבי ApoCIII KO. מאה וארבעים וחמישה עוברים microinjected עם mRNAs 1 ZFN הסט הועברו ל7 ארנבים פסאודו הריון נמען (א &#39;). עוברים סמוקים טרי (n = 75) ללא microinjection ZFN הועברו לנמענים (n = 6) כקבוצת ביקורת. שיעור הטווח מחושב כערכות לטווח סך הכל / עוברי סך הכל בקבוצת ניסוי הוא 14.5% (21/145), ואילו השיעור הוא 29.3% (22/75) בקבוצת הביקורת (א &#39;). מתוך 21 ערכות נולדו בקבוצת microinjected, חמש (R1, R9, R11, R12 וR16) זוהו ערכות KO חיוביות לאחר רצף PCR (ב &#39;). Indels באתר המיקוד כולל שתי תוספות (+1 עבור שני R9 וR11) ושלוש מחיקות (Δ1, Δ 20, Δ 21 לR1, R12 וR16, בהתאמה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

אפוליפופרוטאין (Apo) C-III (ApoCIII) הוא חלבון O-מסוכר קטן הפרשה כי הוא מסונתז בעיקר בכבד ובמעי. הוא שוכן על פני השטח של chylomicron הפלזמה (CM), ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL) ויפופרוטאינים בצפיפות גבוהים (HDL). ApoCIII הוכר כגורם סיכון למחלות לב וכלי דם 1. יש חולים עם חסר תורשתי של ApoCIII טריגליצרידים נמוכים פלזמה רמות (TG) וטרשת עורקים בעורקים הכליליים תת קליניים מופחתים 2,3. רמת ApoCIII הפלזמה גבוהה, לעומת זאת, לעתים קרובות בקורלציה עם תנגודת לאינסולין, השמנת יתר, וhypertriglyceridemia (HTG) 4,5. נוקאאוט הגן (KO) הוא אמצעי רב עוצמה כדי לחקור את תפקודו של גן. עולה בקנה אחד עם התצפיות באוכלוסיות מוטציה אנושיות, בנוקאאוט של גן ApoCIII בעכברים הוביל לירידה של הפלזמה TG והגנה מפני HTG לאחר הארוחה 6. תפקיד חיובי כזה של ApoCIII הופיעלהיות עצמאי של אפוליפופרוטאין E (ApoE), כעכברים החסרים של שני ApoE וApoCIII גם מוגנים מפני היפרליפידמיה לאחר הארוחה 7. למרות שהמודלים של העכברים אלה ApoCIII KO סיפקו מידע רב ערך על הפונקציות אפשריות של ApoCIII בבני אדם, הוא ציין כי חילוף החומרים של ליפופרוטאין של עכברים שונים מזה של בני אדם בהיבטים רבים. לדוגמא, עכבר חסר חלבון הפלזמה כולסטריל העברת אסתר (CETP), אנזים מרכזי מעורב בהובלה של VLDL, LDL, HDL ו8. לכן, יש צורך לפתח מודל חיה מתאים כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי של ApoCIII in vivo נוסף. הארנבת היא מינים של בעלי חיים מודל קלאסיים 9-11. יש לו תקופה קצרה של הריון (30-31 ימים), גודל המלטה גדול (4-12/litter) ויכול להיות שוכנו בנוחות במתקן מקורה. בהשוואה לעכברים, ארנבים הם פילוגנטית קרובים יותר לבני אדם 10. חשוב לציין, כמו huאדם, אך שלא כמו עכברים, ארנבים הם יונקי LDL-עשיר ויש רמות משמעותיות של CETP 10,12. יתר על כן, הם רגישים לטרשת עורקת נגרם דיאטה עשיר בכולסטרול עם הנגעים דומים לאלה שראו בטרשת עורקת אדם 13. מסיבות אלה, שערנו כי ארנבות ApoCIII KO יכולות לשמש מודל טוב יותר מאשר עמיתיהם בעכבר כדי לחקור את התפקידים של ApoCIIIplay בחילוף חומרים של שומנים בדם וטרשת עורקים בבני אדם. ייצור של גן ממוקד מהונדס ארנבים (GTT) כבר אתגר. זאת בעיקר בשל חוסר בתאי מין העברת תאי גזע עוברי (ESC), ונמוכה ביותר היעילות של העברת סומטי תא גרעינית (SCNT) בארנבות. ESC הוא הכלי העיקרי ליצירת עכברי GTT, ואילו וSCNT יושם בהצלחה כדי ליצור חיות KO במינים חסרי ESCs העברת תאי מין, ובכלל זה חזירים, כבשים ובקר, אך לא ארנבות. לאחרונה אצבע Nuclease אבץ (ZFN), טראןscription Activator-Like Effector Nuclease (Talen) 14, וendonuclease RNA מודרך (RGEN) 15 הגיחו אמצעי רב עוצמה כמו לעריכת הגנום. nucleases אלה, מה שנקרא &quot;מספריים מולקולריים&quot;, הם יעילים ביצירת הפסקות גדיל פעמיים (DSB) בגנום שיכול להוביל לKO תפקודי של הגן הממוקד או משומשת לשלב רצף ה-DNA במוקד ספציפי בגנום ב מספר המינים 16. ב2011, בין הראשונים התאמת טכנולוגית ZFN, אנחנו שנוצרנו גמא הופעל proliferator peroxisome הקולטן תאים חזיריים KO (PPARγ) באמצעות גישה זו וחזירים PPARγ KO נוצרו בהצלחה לאחר השימוש בתאים אלה לSCNT 17. באותה השנה, שיבוש יעיל אימונוגלובולינים גן והחלפה ממוקדות בארנבים גם באמצעות ZFN דווחו 18. במחקר הנוכחי, חמש ארנבות ApoCIII KO נוצרו כפי שאושרה על ידי רצף ה-PCR, באמצעות ZFN סט 1 (ראה איור 1 </sטרונג&gt;. להמחשה תרשים זרימה). בעלי חיים אלה הם משאבי רומן ללמוד את התפקידים של ApoCIII בחילוף חומרים של שומנים.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>גן מטרה: APOC3, מספר אצווה: 12201118MN</td></tr><tr><td>ערכת mMESSAGE</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>סינתזת mRNA</td></tr><tr><td>ערכת MEGAclear&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>mRNA טיהור</td></tr><tr><td>הורמון מגרה זקיקים</td><td>Bioniche Life Sciences</td><td>Folltropin-V</td><td>טיפול בארנבות תורמות עוברים</td></tr><tr><td>גונדוטרופין כוריוני אנושי</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>טיפול בארנבות תורמות עוברים</td></tr><tr><td>הורמון משחרר גונדוטרופין</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>טיפול בארנבות</td></tr> <tr><td>מקבלות עוברתמיסת המלח המאוזנת של ארל (EBSS)&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>SH30029.02</td><td>תרבית עוברים, מדיום בסיס</td></tr><tr><td>MEM (חומצת אמינו לא חיונית)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M7145</td><td>תרבית עוברים, תוספי</td></tr><tr><td>BME תמיסת חומצות אמינו</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B6766</td><td>תרבית עוברים, תוספי</td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>25030-149</td><td>תרבית עוברים, תוספי</td></tr><tr><td>מזון נתרן פירובט&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>תרבית עוברים, תוספי</td></tr><tr><td>מזון סרום בקר עוברי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>תרבית עוברים, תוספי</td></tr><tr><td>HEPES חוצץ TCM 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>מדיום מניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>חממה</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>ציוד לתרבית עוברים</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>ציוד למניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>ציוד מניפולציה לעוברים</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td>ציוד למניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>, צינורות נימיים מזכוכית בורוסיליקט&nbsp;</td><td>מכשירי דיוק עולמיים, בע"מ</td><td>TW100F-6</td><td>אספקת מניפולציה לעוברים</td></tr><tr><td>Euthasol (פנטוברביטול נתרן)</td> <td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>המתת חסד של ארנבות תורמות עוברים</td></tr></tbody></table>

ייצור של ארנבים נוק אפוליפופרוטאין c-iii באמצעות nucleases אצבע האבץ

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

אפוליפופרוטאין (Apo) C-III (ApoCIII) שוכן על פני השטח של chylomicron פלזמה (CM), ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL) ויפופרוטאינים בצפיפות גבוהים (HDL). זה כבר הכיר בכך שרמות גבוהות של גורם הפלזמה ApoCIII constitutea סיכון למחלות לב וכלי דם (CVD). רמת ApoCIII הפלזמה גבוהה לעתים קרובות בקורלציה עם תנגודת לאינסולין, השמנת יתר, וhypertriglyceridemia. ידע לא יסולא בפז על התפקידים של חילוף חומרים של שומנים וApoCIIIin CVD כבר מתקבל ממודלי עכבר מהונדסים כוללים נוקאאוט עכברי ApoCIII (KO), עם זאת, הוא ציין כי חילוף החומרים של ליפופרוטאין בעכברים שונים מזה של בני אדם בהיבטים רבים. לא ידוע עד עכשיו אם הפלזמה גבוהה ApoCIII הוא ישירות atherogenic. עבדנו לפתח ארנבות ApoCIII KO במחקר הנוכחי מבוסס על ההשערה שארנבים יכולים לשמש כreasonablemodelfor לומד את חילוף החומרים של שומנים בדם אדם וטרשת עורקת. ארנב nuclease אצבע אבץ סטים (ZFN) מיקוד ApoCIIIgene היו נתונים לאימות במבחנה לפני microinjection עובר. MRNA היה מוזרק לציטופלסמה של 35 עובר שלב pronuclear ארנב, והעריך את שיעורי המוטציה במדינת הבלסטוציסט. שישה עשרה בלסטוציטים שהיו assayed, קצב משביע רצון 50% מוטציה (8/16) באתר המיקוד הושג, התומך בשימוש של 1 סט לin vivo ניסויים. בשלב הבא, אנחנו microinjected 145 עוברים עם הסט 1-mRNA, והועברו עוברים אלה עד 7 ארנבי נמען. לאחר הריון 30 ימים, 21 ערכות נולדו, מתוכם חמישה אושרו כארנבות ApoCIII KO אחרי מבחני רצף ה-PCR. שיעור בעלי החיים KO (# נולד ערכות KO / סך הכל) היה 23.8%. יעילות הייצור הכוללת היא 3.4% (5 kits/145 עוברים הועברו). העבודה הנוכחית הוכיחה כי ZFN הוא שיטה יעילה ביותר כדי לייצר ארנבות KO. ארנבי ApoCIII KO אלה הם משאבי רומן ללמוד את התפקידים של ApoCIII בחילוף חומרים של שומנים.

באימות מבחנה של זוגות ZFN זוגות שש עשרה ZFN בתחילה תוכננו. רצף השיבוש הממוקד של 1 סט ממוקם באקסון 2 של ארנב ApoCIII (איור 2 א). שלושה זוגות (1 סט, 2, ו -3, איור 2 א) נבחרו ובכפופים לassay כתב השמרים MEL-1 כדי לקבוע את פעילות ZFN (איור 2). הגדר יש 1 ציון ZFN של 224.2%, גבוה מאלה של סט 2 (196.9%) ו -3 סט (177.8%) וגבוה בהרבה מהסף לבחירה (כלומר 50% מהשליטה הפנימית החיובית). לכן 1 סט נבחר לניסויי אימות במבחנה. קבוצה מסוימת צריכה לגרום לשיעורים חיוביים בעוברים של 10% או גבוהים יותר כדי לעבור את אימות עובר במבחנה, המבוסס על קריטריוני אימות הפנימיים. MRNA (5 מיקרוגרם / מיליליטר) של 1 סט היה microinjected לציטופלסמה של 35 עוברי ארנב שלב pronuclear (איור 3 א &lt;/ Strong&gt;). עוברים סמוקים ללא טיפול microinjection (n = 31 ב) שימשו כקבוצת ביקורת. שמונה עשר עוברים של קבוצת microinjected פיתחו לבמת BL בD5, מתוכם שישה עשר היו רצף, ושמונה (# BL אייפוק-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, איור 3B, אדום עם קו תחתון) מוצגים מוטציה רצפים באתר המיקוד (שחורה בארגזים, איור 2, שורה העליונה, apoC3wt.seq). שיעור BL של קבוצת microinjected (51.4%) הוא נמוך מזה של קבוצת הביקורת (77.4%), המצביעה על יכולת התפתחותי מעט לקויה של עוברי microinjected. שיעור המוטציות החיובי של עוברי microinjected הוא 50.0% (8/16), גבוהים בהרבה מהסף לבחירה (כלומר 10%). תוצאות אלו עולות כי 1 סט הוא סט ZFN יעיל כדי לגרום למוטציות באתר המיקוד של ApoCIII ארנב. לכן 1 סט נבחר לייצור vivo של ארנבות ApoCIII KO. ייצור של ארנבי ApoCIII KO MRNA oו ZFN סט 1 היה microinjected לציטופלסמה של עוברי שלב pronuclear ארנב, והועבר 145 עוברי microinjected ל7 ארנבים פסאודו הריון נמען (איור 4 א). עוברים סמוקים טרי (n = 75) ללא microinjection ZFN הועברו לנמענים (n = 6) כקבוצת ביקורת. לאחר 30 ימים של הריון, 21 ערכות נולדו בקבוצת microinjected. רצף ה-PCR זיהה חמש (apoC3-R1, R9, R11, R12 וR16) כערכות חיוביות KO (איור 4). שיעור הטווח מחושב כערכות לטווח סך הכל / עוברים כולל הוא 14.5% (21/145), ואילו השיעור הוא 29.3% (22/75) בקבוצת הביקורת. שיעור KO מחושב כסך ערכות KO / טווח כולל הוא 23.8% (5/21). ערכה אחת KO (אייפוק-R16) מתה חמש לאחר לידה ימים (20.0%, 1/5). Indelsat אתר המיקוד כולל שתי תוספות ושלוש מחיקות, הם areΔ1, +1, +1, Δ20 וΔ21, לארנבים # R1, R9, R11, R12, R16 ו, בהתאמה (איור 4). Biניתוח oinformatics שימש לזיהוי ZFN הפוטנציאלי מחוץ למטרות עם 7 או פחות אי התאמות להגדרת רצף 1, כפי שתואר לעיל 17. היחיד שחזה אתר מחוץ יעד אפשרי, הממוקם על כרומוזום 14, היה מזוהה עם 7 bps תואם. assay PCR זוהה אין אירועים מחוץ יעד בכל אחת מהחיות המייסד.

ההתפתחות אחרונות בכלי מיקוד גן הופכת את הייצור של נוקאאוט ארנבים (KO) אפשרי. בעבודה הנוכחית, יצרו חמש ארנבות אפוליפופרוטאין (Apo) C-III KO באמצעות nucleases אבץ אצבע (ZFN). עבודה זו הראתה כי ZFN הוא שיטה יעילה ביותר כדי לייצר ארנבות KO.

ייצור של ארנבים נוק אפוליפופרוטאין C-III באמצעות nucleases אצבע האבץ

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח מודלים חדשניים של ארנב למחקר של מחלות קרדיווסקולריות אנושיות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תכנון וסינתזה של נוקלאזות אצבעות אבץ (zinc finger nucleases) המכוונות לגן הרלוונטי. השלב השני של ההליך הוא הזרקה זעירה (micro injection) של ה-ZFN RNAs אל תוך הציטופלזמה של עוברים בשלב הפרו-גרעין (Pronuclear stage).השלב השלישי הוא העברה כירורגית של העוברים לארנבת מקבלת. השלב הסופי הוא ביצוע גנוטיפיקציה ליילודים כדי לזהות בעלי חיים טרנסגניים. באופן כללי, תכנון גנים באמצעות ZFN הוא יעיל ביותר, והדבר מודגם כאן על ידי יצירת ארנבת עם נוק-אאוט של A OC three.טכניקה זו היא נקודת מפנה בהנדסה גנטית, שכן היא הראשונה שאפשרה ייצור של ארנבים נטולי קוד (no-code). ההשלכות של טכניקה זו משתמרות לעבר טיפול במחלות אנושיות רבות, כגון מחלות קרדיווסקולריות. גוברת ההכרה בכך שדרושים מודלים של בעלי חיים גדולים כדי לדמות טוב יותר את הפיזיולוגיה והפתולוגיה של בני אדם.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר קראנו את המאמר שדיווח על targeting גנטי מוצלח באמצעות nuclease משמעותי בארנבים בשנת 2009. באופן כללי, אנשים המכירים שיטה זו יתקלו בקשיים כיוון שהיא כוללת מיקרו-הזרקה של construct לתוך הציטופלזמה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי targeting גנטי בארנבים, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים, כגון חזירים.התחילו עם ארנבות לבנות מניו זילנד בוגרות מינית שעברו ביוולת-יתר (super ovulation), באמצעות הזרקה תת-עורית של FSH פעמיים ביום במשך שלושה ימים, תוך העלאה יומית של המינון. 72 שעות לאחר הזרקת ה-FSH האחרונה, הזריקו 200 IUs של HCG תוך-ורידית כדי להשרות ביוולת בנקבות שעברו ביוולת-יתר. מיד לאחר מכן, יש להכין גם את חיית המקלדת.16 עד 18 שעות לאחר ההפריה, יש להקריב את ארנבות התורמות שעברו גירוי להביאת ביציות מרובות (super ovulated) באמצעות סודיום פנטובריטול. הוציאו את קרן הרחם (UCT) על ידי איסוף זהיר של הרחם כולו. לאחר הפרדת מבני קרני הרחם והשחלות, שטפו כל UCT עם 10 milliliters של תמיסת טיפול (manipulation medium) על ידי הזרקת התמיסה מקצה הרחם של ה-UCT.אספו את המדיום שנשטף מקצה השחלה של ה-UCT אל תוך צלחת פטרי. העוברים שהופקו נמצאים במדיום שנשטף. לאחר מכן, שטפו את העוברים שלוש פעמים עם מדיום מניפולציה.לאחר מכן, דגרו את העוברים בתרגיף המניפולציה בטמפרטורה של 38.5 °C באוויר רגיל. כעבור 19 עד 21 שעות לאחר ההפריה, בחרו את העוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.אספו כ-30 עוברים שנמצאים בשלב הפרו-גרעין (pronuclear stage) עבור כל תנאי הזרקה; צפו ל-30 עד 40 עוברים כאלו לכל נקבה שעברה סופר-אוביולציה. מראש, רכשו ערכות ZFN עבור הגן הרלוונטי מיצרן.בחירת אלו עם ציוני ה-ZFN הטובים ביותר. בדוגמה זו, הגן המדובר הוא A OC three. כדי להכין את ה-mRNA של ה-ZFN, ראשית בצעו תמלול של ה-RNA השליח של ה-ZFN in vitro והוסיפו זנב פולי-A לתמלילים.בשלב הבא, טהרו את ה-mRNA שהתקבל ותוהילו אותו ב-RNA spree 0.1 xte E. לאחר מכן, מדדו את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר והכינו מנות (aliquots) של mRNA המקודד לזוגות ZFN בריכוז של 4 עד 10 nanograms per microliter במבחנות של 10 microliter לצורך אחסון. התחילו בחימום של במת המיקרו-הזרקה ל-38 °C.להכנת פלטפורמת המיקרו-הזרקה, ראשית, הסר את תא המדיום ממתגית עם תא בודד, לאחר מכן טפטף 5 µL של מדיום למניפולציה על גבי השקף וכסה אותו בשמן מינרלי. הנח את השקף המוכן על במת המיקרוסקופ המחוממת.בשלב הבא, חברו פיפטית החזקה בעלת קוטר של 120 micron למיקרו-מניפולטור ומיקמו את הפיפטית בתוך טיפת המדיום שעל הפלטפורמה. כעת, הפשיתו על קרח את ה-mRNAs המיועדים להזרקה. טענו אותם לתוך פיפטית הזרקה, שיוצרה מצינור קפילריה של זכוכית bo silicate באמצעות מכשיר משיכת מיקרו-פיפטות.כעת הפעל את אספקת האוויר הדחוס המחוברת למיקרו-מזרק. לאחר מכן, קבע את פיפטת ההזרקה למחזיק שלה וחבר אותו למניפולטור מיקרו שני. מקם גם פיפטה זו בתוך טיפת המצע.כעת הגדירו את המיקרו-מזריק לנפח הזרקה של 1 עד 5 picoliters. כדי לפתוח את קצה פיפטת ההזרקה, הקישו עליה בעדינות אל מול פיפטת התמיכה.העבירו באמצעות פיפטת זכוכית 30 עד 50 עוברים למערכת המיקרו-מניפולציה. הניחו אותם על הפלטפורמה. לאחר מכן, התבוננו בהגדלה של 100 x.השתמשו בפיפטת התמיכה (holding pipette) כדי לתפוס עובר. יישרו את פיפטת התמיכה ואת העובר ביחס למחט ההזרקה תחת הגדלה של 400x. העבירו את פיפטת ההזרקה דרך העובר.הקפידו להימנע מהגרעין. לאחר חדירת ממבנה הפלזמה, לחצו על דוושת הרגל כדי להזריק את ה-mRNA. לאחר ההזרקה, שלפו את המחט ושחררו את העובר. חזרו על התהליך עבור כל שאר העוברים.לאחר השלמת ההזרקה של כולם, שטפו את העוברים שלוש פעמים במצע תרבית עוברי למשך 30 שניות לכל שטיפה. לאחר מכן, הדגרירו את העוברים בטמפרטורה של 38.5 °C באוויר המכיל 5% carbon dioxide למשך שעה עד שעתיים לפני העברתם למקבלת הסינכרון.ארנבת נקבה. כדי לגדל את העוברים עד לשלב הבלסטוציסט, האינקובטור חייב להכיל אוויר מלחח. בחרו ארנבת NZW נקבה בת 5 עד 12 חודשים, הבריאה במצב בריאותי טוב ושמשקלה ארבעה עד חמישה קילוגרמים.הכיני אותה כבעל החיים המקבל על ידי מתן גונדוטורופין, הורמון משחרר (gonadotropin-releasing hormone), בהזרקה תוך-שרירית. 16 עד 24 שעות לאחר הזרקת ההורמון, הרדימי את הארנבת באמצעות קטמין ו/או איזופלורן (isoflurane) במצב של אידוי. כאשר הארנבת תהיה חסרת הכרה לחלוטין, היא לא תגיב ברפלקסים של כף הרגל.כאשר לוחצים על כרית כף הרגל לפני הניתוח, יש להגן על העיניים באמצעות משחה אופתלמית ולהכין את הבטן. במהלך הניתוח, יש לתעד את הסימנים החיוניים של הארנב. מדי 15 דקות התחל בביצוע חתך של כ-2.5 סנטימטרים דרך העור ולאחר מכן לאורך שכבת השריר.הוציאו החוצה כל שחלה יחד עם קרן הרחם המחוברת אליה, תוך כדי החזקת שחלה בין האגודל לאצבע המורה. העבירו את העוברים לתוךו של הצינור המביא את הביצה (oviduct) באמצעות פיפטה סטרילית שהוכנסה בזהירות. בדרך כלל, 10 עד 25 עוברים מתוך כל 30 עוברים שהוזרקו הם בריאים, וניתן להעביר את כולם למקלטת אחת.השלימו את הניתוח על ידי סגירת שכבת השריר באמצעות תפר ספיג מצופה. תפרו את העור באמצעות תפר ספיג תת-עורי (subcuticular) או באמצעות תפרי עור פשוטים וקטועים שאינם ספיגים. לאחר מכן, שמרו על חום גופו של בעל החיים ועקבו אחריו עד להתעוררותו.הושגה רקומבינציה. בתחילה תוכננו 16 זוגות של ZFN. רצף השיבוש המיועד של סט אחד ממוקם באקסון שתיים של שלושה סטים של OC.ערכות אחת, שתיים ושלוש נבחרה ונבדקה באמצעות בדיקת MEL reporter בשמרים כדי לקבוע את פעילות ה-ZFN; לערכה אחת היה ציון ZFN הגבוה ב-224.2% מאלו של ערכות שתיים ושלוש, וגבוה משמעותית מסף הבחירה, העומד על 50% מהבקרה החיובית הפנימית. לפיכך, נבחרה ערכה אחת לניסויי תיקוף in vitro, ו-mRNA של ערכה אחת הוזרק במיקרו-הזרקה ל-35 עוברים של ארנב.שיעור ה-BL של הקבוצה שהוזרקו במיקרו-הזרקה היה נמוך יותר בהשוואה לאלו שלא עברו מיקרו-הזרקה, מה שמעיד על פגיעה קלה בכושר ההתפתחותי. 18 עוברים מקבוצת המיקרו-הזרקה התפתחו לשלב ה-BL ביום החמישי, מתוכם רצפו 16. השכיחות של ארבע מוטציות באתר המטרה הייתה גבוהה בהרבה מסף הבחירה, מה שמעיד על כך שזוג ה-ZFN הראשון היה יעיל. בסך הכל 145 עוברים.עוברים שהוזרקו במיקרו-הזרקה עם סט אחד של mRNA של ZFN הועברו לשבע ארנבות רקפטיביות בהריון מדמה. עוברים ששטפו אותם ללא מיקרו-הזרקה של ZFN הועברו לרקפטיביות כקבוצת ביקורת לאחר 30 ימי הריון. 21 גורים נולדו בקבוצה שעברה מיקרו-הזרקה.ריצוף PCR זיהה חמישה מקרים כנוק-אאוטים (knockouts) חיוביים. האינדלים (indels) באתר המטרה כללו שתי הכנסות ושלוש מחיקות. ניתוח ביואינפורמטיקה שימש לזיהוי מטרות שגויות (off targets) פוטנציאליות של ZFN עם שבעה אי-התאמות או פחות לרצף של קבוצה אחת; זוהה רק אתר מטרה שגויה אפשרי אחד, ו-PCR לא זיהה אירועים באתר זה באף אחת מבעלי המייסדים.צפו בסרטון זה. עליכם להיות בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים ארנבות knockout באמצעות מיקרו-הזרקה של גרעין Zinc Finger.לאחר השליטה באיסוף עוברים, ניתן לבצע מיקרו-הזרקה והעברה תוך ארבע שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי חומר ההזרקה הוא RNA, הדורש זהירות יתרה. לאחר הליך זה, תבוצע פנוטיפיקה כדי להבין את הכללים הביולוגיים של הגנים הממוקדים.

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

אנו מתארים שיטה ליצירת מודל אפשרי של דג זברה למחלת כליות פוליציסטית. השתמשנו בדגי Tg(wt1b:GFP) כדי לדמיין את מבנה הכליות. הפלה של wnt5a הייתה על ידי הזרקת מורפולינו. היווצרות ציסטה פרונפרית לאחר נוקדאון wnt5a נצפתה בדג הזברה הטרנסגני GFP הזה.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של Wnt5a גורם ציסטות בכליות דג הזברה

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור CRISPR/Cas9 ריבונאנאופלפרוטאין מתווך יעיל עריכת גנים בתאי מיונקים באמצעות אלקטרופורציה שפופרת.

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

מספר שיטות שימשו לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה; עם זאת, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינים ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לגבי איך לבודד ליפופרוטאינים מפלזמה באמצעות ultracentrifugation צפיפות רציפה וכיצד לנתח את apolipoproteins הן למטרות אבחון ומחקר.

בידוד וניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה על ידי Ultracentrifugation

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.

יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

היעילות של שיטת עריכת הגנום המשופרת באמצעות אספקת חומצות גרעין ביציות (I-GONAD) דומה למיקרו-הזרקה מסורתית, הדורשת איסוף זיגוטה מנקבות תורמות והעברה לנקבות פסאודו-בהריון. פרוטוקול זה מדגים את יעילותו על ידי החדרת מוטציות הנגרמות על ידי CRISPR/Cas9 ללוקוס ROSA26 בכרומוזום 6.

עריכה גנומית משופרת באמצעות חומצות גרעין ביציות מבוססת טכניקת אלקטרופורציה In Vivo ליצירת עכברי נוקאאוט

למד לייצר ארנבים נוקאאוט ל-Apolipoprotein C-III באמצעות nucleases אצבע האבץ. שיטה זו מדגימה עריכת גנים יעילה למחקר מחלות לב וכלי דם בבני אדם.

ייצור של ארנבים נוק אפוליפופרוטאין C-III באמצעות nucleases אצבע האבץ

גלה סרטונים נוספים