Name: זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב דרוזופילה ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: למדו לזהות אינטראקציות חלבונים במוח הבוגר של Drosophila באמצעות שיטת TAP. שיטה זו מאפשרת טיהור מורכבים חלבוניים וזיהוי שותפים מתאימים במצבים פיזיולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים EUROSARF ששלח לנו פלסמידים ביטוי השמרים TAP. אנו מודים גם למערכת עזרה מLabadens ריאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NINDS (R01NS070962) לCW

1. צור כטב&quot;מ-מתויג TAP זבובים טרנסגניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור pUAST-מתויג TAP בונה DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט באיזה צד (N-או C-סופית) של חלבון פיתיון תג TAP יש התמזגו, המבוסס על המבנה / התפקוד של החלבון. ראה דיון לפרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone אזור קידוד cDNA של הגן של עניין לאתרים המרובים שיבוט (MCS) של וקטורי pUAST-NTAP או pUAST-CTAP ליצור transgenes כטב&quot;מ-TAP N-או C-מסוף מתויג, בהתאמה. ראה איור 1 עבור מפות מפורטות ואתרי הגבלה שמישים ומסגרות קריאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כטב&quot;מ-מתויג TAP זבובים מהונדסים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור זבובים מהונדסים הבאים פרוטוקולים סטנדרטיים באמצעות P-תיווך אלמנט ההחדרה 11. מספר שירותי הזרקה הוא זמינים באופן מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות נהג GAL4 עצבי (כלומר BG380-GAL4) לכל שורה מהונדס בודדת ולקבוע את רמות ביטוי החלבוןכל שורה על ידי כתם מערבי (עם נוגדני Anti-Peroxidase Peroxidase) ו / או immunostaining (עם נוגדן אנטי TAP). באופן כללי, קו מהונדס עם רמת ביטוי חלבון שהוא קרוב לחלבון אנדוגני מומלץ לנהלים ברז. ראה דיון לפרטים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PerformGAL4/UAS-based ניסויי הצלה כדי לאשר את הפונקציונליות של transgenes מתויג TAP אם מוטציות פסד של פונקציה של גנים של עניין זמינות. בחר transgene שיכול באופן משמעותי להציל את פנוטיפים מוטציה לניסויי TAP הבאים. </li></ol></li></ol> 2. הכן דוגמאות לנוהל TAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מניית זבוב שנושא שני נהג עצבי GAL4 (למשל BG380-Gal4) וtransgene מתויג TAP נבחר על מנת להקל על ההתרחבות של דגימות לטוס. לאסוף progenies F1 של נהג GAL4 וצלב כטב&quot;מ-transgene במקרים נדירים שבם השילוב הנ&quot;ל גורם לחסרון הישרדות וצמיחה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות בקנה מידה קטנות ולייעל את מצב תמוגה לsolubilizing החלבון מתויג TAP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות סדרה של מאגרי תמוגה באמצעות שילוב של חומרי ניקוי nonionic NP-40 (0.1-1%), NaDOC (0.1-1%) וטריטון X-100 (0.05-.5%). ראה טבלת 1 ודיון לקבלת מידע נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי משטח CO2, השתמש # 5 מלקחיים לנתח 20 ראשים בוגרים מtransgene TAP להביע זבובים ולאסוף אותם בצינור 1.5 מיליליטר לבדוק כל תנאי מאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ תמוגה בדיקות 100 ul לצינור וhomogenize הראשים ידי מלטף את מעלה ומטה עם העלי פלסטיק, ולאחר מכן להוסיף עוד חיץ בדיקות 100 ul. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין lysate הראש ב21,500 XG עבור 10 דקות (4 מעלות צלזיוס), ולהפריד את supernatant וגלולה לאחר צנטריפוגה. הוסף 25 חיץ טעינת ul 2x SDS לגלולה וחיץ טעינה 10 ul 4x SDS ל30 ul של supernatant בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים שתי דגימות למשך 5 דקות ולנתח אותם בצד על ידיבצד באמצעות SDS-PAGE ולאחר מכן כתם מערבי עם נוגדן PAP. לקבוע את המסיסות על ידי היחס בין רמות TAP-החלבון בsupernatant לעומת גלולה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם בקנה מידה גדולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב ולאסוף זבובים בוגרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את מניית neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene בבקבוקים ולהעיף את הבקבוקים כל 3 ימים עד 250 בקבוקים מצטברים משמשים לאיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבוגר ישן לאסוף 1-3 ימים עף לתוך 50 צינורות חרוטי מיליליטר, לשים את הצינור בחנקן נוזלי באופן מיידי להקפאה עמוקה את הזבובים. אחסן את הזבובים ב-80 ° C במקפיא. שים לב שהנפח של הזבובים לא יעלה על 2/3 מצינור 50 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ראשים לטוס (לבצע שלב זה על גבי קרח יבש אבקה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מסננות prechilled ומכתש ועלי מ-80 ° C במקפיא ולשים אותם על קרח יבש, באופן אידיאלי בתוך דלי קרח גדול. סטאק שתי הנפות מבחן סטנדרטיות בארה&quot;ב עם מס &#39;25 על העליון דואר ומס &#39;40 בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הזבובים הקפואים החוצה ושחרר אותם בחנקן נוזלי ולשמור על הזבובים שביש ל10 דקות בערך. מערבולת או לנער את הצינורות במרץ כדי לשבור את הראש, ברגליים, וכנפיים מהגופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת למסננת העליונה, ולאחר מכן ללחוץ הנפות נמרצות תוך החזקת שני מסננות יחד. לאחר סינון, הגופים יישארו במסננת העליונה, לעוף ראשים יישמרו על המסננת התחתונה, ורגליים, כנפיים, ופסולת אחרת ייפלו על הקרח היבש. להפריד בין שתי הנפות ובזהירות להעביר את הראשים לטוס מרגמה הקרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize ראשי הזבוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי קרח יבש, לטחון את הראשים עם המכתש והעלי לחלקיקי אבק, ולאחר מכן להעביר את האבקה למטחנת רקמת Dounce זכוכית מיליליטר 15 שprechilled על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשקל של המטחנה לפני ואחרי דגימת הראש נמזגה לתוכה, ולאחר מכן לחשב כמה samp הראשle שוקל. כולל של 6-15 גרם של ראשי זבוב יהיה מספיק עבור כל ניסוי TAP התאמה בהתאם לרמות הביטוי של החלבון. הוסף 15 מיליליטר של חיץ המגון קר כקרח (מאגר תמוגה מותאם בשלב 2.2) לאבקה ולאחר מכן שבץ עם העלי הסיקול הגדול עד שהוא קל לעלי ללכת למעלה ולמטה. שמור את המטחנה מזכוכית על קרח בכל העת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את supernatant לTAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את homogenate לצינור צנטריפוגות במהירות גבוהה וספין ל20 דקות ב ~ 50,000 XG (4 ° C). מעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות במהירות גבוהה חדש וחזור צנטריפוגה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור ultracentrifuge ולבצע 40 דקות ~ 250,000 ספין XG כדי לנקות את supernatant נוסף. Supernatant מוכן להליכי טיהור זיקת טנדם לאחר ultracentrifugation. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. טיהור TAP </p&gt; הסעיפים הבאים נגזרו מברז המעבדה Seraphin protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור זיקת חרוז IgG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוז sepharose IgG תוך הדגימות נמצאים centrifuged. שטוף 400 μl 3x חרוז IgG בצינור פלקון 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר חיץ כביסה IgG קר. לכל שטיפה, לטלטל את הצינור בעדינות במשך 2 דקות, ולאחר מכן ספין למטה חרוזים XG ב 1000 לעוד 2 דקות. בסוף לשטוף השלישי, להסיר את החיץ ולהשאיר רק את חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את supernatant פינה (~ 15 מיליליטר) לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל חרוזים IgG. דגירה חרוזים ותמהיל lysate המוח ב4 º C על nutator במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עמודת מיקרו נקייה וריקה עם -15 מיליליטר נפח כולל בחדר הקר. טען את תערובת חרוז IgG ידי בהתמדה לשפוך את התערובת לתוך הטור; מנסה לא מלכודת כלבועות אוויר בתוך העמודה. לאפשר חרוזים להתיישב בעמודה והחיץ כדי לנקז באיטיות על ידי זרימת כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה ביסודיות עם 10 מיליליטר של חיץ הכביסה IgG הקר אחרי כל lysate המוח זרם דרך עמודת IgG התיישבה. חזור על 2x לשטוף. שים לב: לא לתת יבש חרוז באוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מחשוף TEV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את העמודה שוב עם 10 חיץ מחשוף מיליליטר TEV. צעד זה מכין את חרוז IgG שsequestrates מורכב פיתיון למחשוף TEV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממש לפני שהטיפה האחרונה של חיץ TEV עומדת לטפטף החוצה, לשים כובע בחלק התחתון של העמודה כדי לחסום את הזרימה, להוסיף 1.3 חיץ מיליליטר TEV מכיל 130 יחידות של אנזים TEV לעמודה, ולאחר מכן באופן מאובטח מכסה את החלק העליון של העמודה. ודא שהעמודה אטומה היטב בשני הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העמודה ב18 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 כדי לאפשר לאנזים TEV לדבוק פפטיד באתר TEV ולשחרר WHI החלבון המורכבle השאיר מאחוריו את החלבון פפטיד תחום חייב חרוזים sepharose IgG. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע טיהור זיקת חרוז Calmodulin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוזים Calmodulin תוך חרוזים IgG מודגרת עם אנזים TEV. שטוף 200 חרוזים Calmodulin μl ב15 מיליליטר 3x צינור פלקון, בכל פעם עם 10 מיליליטר של Calmodulin הקר מחייב חיץ. לכל שטיפה, נער בעדינות את הצינור למשך 2 דקות על nutator, ולאחר מכן לסובב את חרוזים ב1,000 XG במשך 2 דקות. בסוף לשטוף השלישי, להוציא את כל החיץ ולהשאיר רק את חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה TEV (צעד 3.2.3), להחזיר את טור IgG חזרה לחדר הקר ולהגדיר ישר אותו. בואו חרוזים להסתפק 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה העליון ולאחר מכן את המכסה התחתון, ולאחר מכן לאסוף את מוצר מחשוף מיליליטר TEV 1.3 בצינור פלקון 15 מיליליטר. בואו החיץ לנקז לחלוטין. הוספת חיץ 200 TEV μl נוסף לעמודה לדחוף את הנפח המת של הטור, לאסוף את fנמוך באותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 4.5 מיליליטר של Calmodulin מחייב חיץ ו4.5 μl 1 M CaCl 2 למוצר מחשוף 1.5 מיליליטר TEV נאסף לעיל. CaCl 2 משמש כדי לכיל EDTA במאגר TEV. מעביר את תערובת 6 מיליליטר לשפופרת המכילה חרוזים Calmodulin ולסובב את הצינור ב 4 º C על nutator במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים עוד עמודת מיקרו נקייה וריקה עם כ -10 מיליליטר נפח כולל בחדר הקר. טען את תערובת חרוז Calmodulin לעמודה ולאפשר לו לרוקן על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הפתרון זרם דרך עמודת Calmodulin התיישבה, לשטוף את העמודה שתי פעמים, כל אחד עם 10 מיליליטר של Calmodulin הקר מחייב חיץ. שים לב: לא להפריע חרוזים Calmodulin ולנסות לשמור את פני השטח של חרוזים שטוחים ככל האפשר בזמן הכביסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המורכב פיתיון מעמודת Calmodulin. מייד לאחר כביסה, elute עמודת Calmodulin עם חמישה שברים של 200 μl Calmodu הקרמאגר elution לין. לכל שבר, בעדינות להוסיף 200 μl של חיץ elution לעמודה ולאסוף את eluate עם 1.5 מיליליטר צינור Eppendorf מסומן. חזור על 4x זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את החלבון המורכב ידי-SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן מכל אחד מחמשת שברים (כ 30 μl) ולהוסיף חיץ טעינת SDS. מרתיחים את הדגימות למשך 5 דקות ולטעון את הדגימות Side-by-צד עם סמנים מולקולריים חלבון בשיפוע (4-15%) ג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות פתרו באופן מלא בג&#39;ל, להפסיק אלקטרופורזה ולהכתים את הג&#39;ל עם כל הליכים המבוססים על ה-G-250 רגישים colloidal Coomassie מכתים כגון &#39;כסף כחול &quot;מכתים 13. צביעת כסף היא אופציונלית, אך לא עדיפה משום שהיא אינה תואמת באופן מלא עם ניתוח ספקטרומטריית מסה שלאחר מכן. אחסן את שאר eluate במקפיא -80 ° C לניתוח נוסף כגון ספקטרומטריית מסה לחשיפת הזהות המולקולרית של החלבון המורכב המטוהרים. Seדיון בדואר. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Forler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+complex+purification+method+for+functional+proteomics+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.</a> Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+technology%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification technology: an overview.</a> Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).</li>
<li>Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+proteomics%3A+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+method%3A+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+a+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ubiquitin-mediated+pathways+in+regulating+synaptic+development%2C+axonal+degeneration+and+regeneration%3A+insights+from+fly+and+worm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm.</a> J. Physiol. , (2013).</li>
<li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+spatial%2C+structural%2C+and+temporal+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li>
<li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda%2FDLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16(2007).</li>
<li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li>
<li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+the+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li>
<li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li>
<li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטת טיהור זיקת טנדם (TAP) מציעה פרוטוקול טיהור כפול המאפשר בידוד והעשרה של קומפלקסי חלבונים באמצעות שני צעדי טיהור זיקה עצמאיים. העיצוב של תג TAP אינו מוגבל למה שמוצג בפרוטוקול זה, תחומים אחרים חלבון מחייב ומוטיבים חלים גם אם תנאי חיץ מותאמים בהתאם. דוגמא טובה לתגי TAP אחרים היא תג GS-TAP, שילוב של חלבון G ומוטיב מחייב streptavidin, שעוצב על ידי קבוצת ג&#39;וליו של Superti-Furga שמטרתה מורכבת חלבון טיהור בשורות תאי יונקים בתרבית 18. GS-TAP מאוחר יותר הותאם לחקור את האי...

הגדרת מסלולים או רשתות המולקולריים שמתווכים תהליך ביולוגי מסוים היא אחת המטרות האולטימטיבית של מחקר ביו. גנטיקאים טוסו הסתמכו רבים על גנטיקה קדימה, במיוחד מתקנים מסכי גנטיים (שניהם משפר והמסכים המדכאים), כדי לזהות גורמים שפועלים יחד, במקביל, או במעלה הזרם או במורד הזרם של גן של עניין. עם זאת, מסכי גנטיקה קדימה לעתים קרובות פעמים לא מצליחים לזהות את הגנים חיוניים אשר, כאשר מוטציה, לגרום הקטלניות בשלבי התפתחות מוקדמים, או גנים עם יתירות פונקציונלית ופיצוי אובדנה של פונקציה היחידה לגרום למומים עדינים שקשה להבקיע. דרך אחת להתגבר על קושי זה היא מסך עבור אינטראקציות בין חלבונים ישירים. במשך יותר מעשור, רשימה הולכת וגדלה של שיטות ביוכימיות, כולל שמרי שני היברידיות, להציג הפאג, cross-linking הכימי, Co-IP, טנדם זיקה טיהור (TAP), וכו &#39;. היה בשימוש כדי לחקור חלבוןחלבון אינטראקציות. כל אחת מהגישות הללו יש סט של נקודות חוזק וחולשה בכל הקשור לרגישות וסגוליות משלו. ביניהם, את שיטת TAP מאפשרת זיהוי של אינטראקציה פיזית בתנאים כמעט פיסיולוגיים, שומרת על ייחוד ועקביות 2 וכוללת את היכולת להרחיב לתפוקה גבוהה ניתוח 3,4. שיטת TAP פותחה בשמרים במקור על ידי עמיתי Rigautand 1. בשיטה זו, חלבון של העניין בא לידי ביטוי עם תג TAP. תג TAP מטפח שני תחומים עצמאיים מחייב זיקה: חלבון תחום שנקשר לנוגדנים ומחייב רישום calmodulin. שני תחומים מופרדים על ידי אתר מחשוף TEV (וירוס Etch טבק). שילוב כזה מאפשר לשני סיבובים עצמאיים של purifications זיקה כדי להפחית במידה מספקת איגודים ספציפיים ולהעשיר איגודים ספציפיים 1. למשל זה, שיטת TAP היא metho חזק מאודד לזהות באינטראקציות vivo של חלבון נתון, אם כי ביתר את חלבון אקסוגני יכול לעשות את זה יותר נוטה לקשר עם חלבונים שעושים בדרך כלל אינו מורכב עם עמיתו אנדוגני שלה. מאז הפיתוח שלה, שיטת TAP כבר מיושמת במערכות רבות אחרות, כוללים תאים המבוסס על תרבות מערכות 5,6 ובמערכות מודל vivo אחרות 6-9. כאן אנו מתארים את העיבוד של שיטת TAP בדרוזופילה. אנחנו מייצרים ראשון וקטורי pUAST-NTAP וpUAST-CTAP כדי להקל על שיבוט והיתוך של תג TAP לאו N-או C-המסוף של הגן של עניין. -מתויג TAP כטב&quot;מ transgene לאחר מכן בא לידי ביטוי במערכת העצבים בשליטתו של נהג GAL4 עצבי 10. בשלב הבא, מספר גדול של ראשי זבוב בוגרים ייאסף, שבו יש תכולה גבוהה של תאים עצביים וקלים להיפרד מחלקי גוף אחרים לאחר הקפאה המבוסס על הבדלים בגודל. הראשים הבוגרים ב הומוגני ופינהcentrifugations y הרציף, ואת supernatant כפוף להליך TAP המתואר להלן.

מסננת <table><tbody><tr><td>בדיקה סטנדרטית בארה"ב מס' 25</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>04-881-18</td><td></td></tr> מסננת <tr><td>בדיקה סטנדרטית בארה"ב מס' 40</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>04-881-21</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מטחנות רקמות Kontes Dounce 15 מ"ל</td><td>קימבל צ'ייס</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>IgG חרוזי ספרד</td><td>Pharmacia</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0.7 ס"מ x 20 ס"מ</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4721</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0.5 ס"מ x 15 ס"מ</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4716</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי קלמודולין</td><td>סטרטגן</td><td>214303</td><td></td></tr><tr><td>קורס טיט ועלי</td><td>CoorsTek</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (tap)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

מסכי גנטיים שנערכו באמצעות דרוזופילה melanogaster (זבוב פירות) יש תגליות אבן דרך רבות בהתקדמות של מדעים ביולוגיים. עם זאת, השימוש במסכים ביוכימי שמטרתה להרחיב את הידע שנצבר מניתוח גנטי שנחקר רק לאחרונה. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור החלבון המורכב שמקורביו עם כל חלבון של עניין מראשי זבוב בוגרים. שיטה זו מנצלת את מערכת דרוזופילה Gal4/UAS לבטא חלבון פיתיון התמזגו עם תג טנדם זיקה הטיהור (TAP) בנוירונים זבוב in vivo, ולאחר מכן מיישמת את שני סבבים של טיהור באמצעות הליך TAP דומה לזה שהוקם במקור בשנת שמרי 1 כדי לטהר את החלבון מורכב אינטראקציה. בסופו של הליך זה, תערובת של קומפלקסי חלבונים מרובים מתקבלת אשר מולקולרי זהויות יכולים להיקבע על ידי ספקטרומטריית מסה. אימות של חלבוני המועמד תיהנה מresource וקלות ביצוע מחקרי אובדן של פונקציה בזבובים. ניתן ליישם גישות דומות לרקמות זבוב אחרות. אנו מאמינים כי השילוב של מניפולציות גנטיות וגישת proteomic זה במערכת מודל זבוב בעל פוטנציאל אדיר להתמודדות עם בעיות יסוד בתחום הנוירוביולוגיה ומעבר.

כאן אנו מדגימים המאמץ שלנו בזיהוי חלבוני Highwire-אינטראקציה במוח הזבוב. Highwire (hiw) וhomologues החוליות וחסרי חוליות שלה הם ligases היוביקוויטין ענק המווסתים את ההתפתחות ותיקון של מערכת העצבים 14. הם חולקים מספר תחומים פונקציונליים השמורים ביותר. עם זאת, הפעולות מולקולריות שלהם הן לא לגמרי ברורות. עבודה שנעשתה בתולעת, לעוף ועכבר הוביל למודל העבודה הנוכחי שפונקציות hiw כאנזים E3 וכמו חלבון פיגומים כדי להקל על היווצרות מורכבת ubiquitination רב למקטע, המסדיר פונקציות ע...

דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לטהר חלבונים המקיימים אינטראקציה in vivo עם גן מטרה מתוך מוח של זבוב פירותים בוגר. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת זבובים טרנסגניים המבטאים את חלבון הפיתיון המסומן ב-tap ואיסוף ראשי הזבובים הבוגרים מאותם זבובים. השלב השני הוא הכנת העל-נוזל (supernatant) מליסאט של ראש הזבוב עבור הליך ה-tap, ולאחר מכן ביצוע טיהור רצופי של immunoglobin G, שבירה באמצעות TEV וטיהור של cal modlin.חמש הת elu-ציות הבאות נאספו מהשלב האחרון של הליך ה-tap יחד עם הליסאט של המוח כולו וקומפלקס החלבון. לאחר שבירה על ידי TEV, הן הופרדו באמצעות SDS page והוצגו על ידי צביעה בכסף. לבסוף, ה-elution השנית מועברת בדרך כלל לספקטרומטריית מסות לצורך זיהוי חלבונים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניסויי TAL hybrid ו-core IP, הוא שאינטראקציות החלבון-חלבון המזוהות על ידי tap מתרחשות בתנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים, דבר המסייע בשימור הספציפיות של אינטראקציות אלו. שני סבבים של שלבי טיהור מאפשרים להעשיר את הממצאים הספציפיים ולהפחית את שיעור התוצאות החיוביות השגויות. הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.לפני תחילת הליך זה, יש להרחיב את מאגר הטרנסגן neuronal GAL four UAS tap בבקבוקים ולהפוך את הבקבוקים מדי שלושה ימים עד שייעשה שימוש ב-250 בקבוקים לצורך איסוף. יש לאס

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

סרטון זה מדגים טיהור זיקה טנדם – טכניקה לטיהור קומפלקסים חלבוניים מתאים איקריוטים כדי לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון. הקומפלקס מכיל שני חלבונים המסומנים בתגי אפיטופ שונים. עם טיהור המתחם באמצעות שני שרפים בעלי זיקה לשני התגים השונים באופן רציף, נוכחותם של שני החלבונים באלוטה מאשרת את האינטראקציה בין השניים.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

MyoD הוא גורם שעתוק מיוגני בעל יכולת חזקה לגרום לטרנסדיפרנציאציה מיוגנית של קווי תאים רבים שאינם שריר מובחנים לחלוטין. המנגנונים האפיגנטיים המעורבים בטרנסדיפרנציאציה זו אינם ידועים ברובם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור זיקה כפולה ואחריה ספקטרומטריית מסה כדי לאפיין באופן ממצה שותפי MyoD.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

למדו לזהות אינטראקציות חלבונים במוח הבוגר של Drosophila באמצעות שיטת TAP. שיטה זו מאפשרת טיהור מורכבים חלבוניים וזיהוי שותפים מתאימים במצבים פיזיולוגיים.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב

גלה סרטונים נוספים