פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר
24 באוקטובר 2013
פרוטוקולי נזק קלים מרובים כבר תאר לקולטני אור וכתוצאה מכך לנזק לגרום תגובת התחדשות רשתית בדג זברה מבוגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה משופרת, שניתן להשתמש בבעלי החיים פיגמנט ושפוגע ברוב המכריע של מוט וקולטני אור חרוט על פני כל הרשתית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשלב שני פרוטוקולים של דגנרציה רטינלית מושרית באור שתוארו בעבר, וזאת כדי לגרום נזק הן לפוטורצפטורים מסוג rods והן לאלו מסוג cones ברחבי הרשתית. הדבר מושג תחילה על ידי חשיפת דגי זברה בוגרים שהותאמו לחושך לאור UV למשך 30 דקות. השלב השני הוא העברה מיידית של הדגים שטופלו ב-UV למכלי גידול המוקפים בארבע נורות הלוגן של 250 watt, וחשיפת הדגים לאור רציף למשך עד ארבעה ימים.
השלב הסופי הוא ביצוע הרדמה והמתה (euthanasia) לדגים והוצאת הגרעינים מהעיניים לצורך ניתוח המשך. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי להראות אובדן עקבי של פוטורצפטורים מסוג rods ו-cones בכל רחבי הרשתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טיפול באור UV או טיפול במנורת הלוגן, הוא ששילוב שתי שיטות אלו מוביל לאבלציה של פוטורצפטורים מסוג rods ו-cones בכל רחבי הרשתית.
נזק לפוטורספטורים גורם לתגובת פרוליפרציה נרחבת אשר מובילה בסופו של דבר לרגנרציה של הפוטורספטורים שאיבדו. ג'ניפר תומאס, סטודנטית לתואר מתקדם במעבדתי, תדגים טכניקה זו. לתחילת הדברים, השתמשו בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר 15 סנטימטרים כשהיא הפוכה כדי שתשמש כמעמד, והדביקו אותה לשולחן המעבדה לצורך חשיפה לאור UV.
הסר את פילמנט תאורת ה-UV מהמיקרוסקופ הסטראו פלואורסצנטי. לאחר מכן, הדבק את פילמנט תאורת ה-UV מעל פטריית פטרי ההפוכה, כך שכ-2 millimeters מקצה הפילמנט יבלטו מעל פטריית הפטרי. לאחר מכן, כסה את מחצית הצדדים התחתונים ואת החלק האחורי של כוס כימית מזכוכית בנפח 250 milliliter בנייר אלומיניום, וודא שהצד המבריק של הרדיד פונה פנימה אל תוך הכוס.
בשלב הבא, מלאו את הכוס עם 100 milliliters של מים ממערכת מתקן הדגים. הניחו כוס זו בתוך כוס בנפח ארבעה ליטר. לאחר מכן, מלאו את הכוס של ארבעת הליטרים במים עד שגובה המים יהיה שווה לקו המים של 100 milliliter בכוס של 250 milliliter.
במקסימום של 10 דגים שעברו טיפול בחושך בכלי כימי של 250 milliliters, כסו את הכלי של 250 milliliters בחתיכה קטנה של נייר אלומיניום. לאחר מכן, הניחו את כל מערך הכלי בסמיכות מיידית לסיב ה-UV. הסיב צריך לגעת בדופן החיצונית של הכלי של ארבעה liters ולהפנות לכיוון החלק החשוף של הכלי של 250 milliliters.
וודאו כי כוס הבקרה בנפח 250 מיליליטר ממוקמת במרכז תחתיתה של כוס הבקרה בנפח ארבעה ליטר. לאחר מכן, מקמו מסך אטום גדול מאחורי כוס הבקרה בנפח ארבעה ליטר, באופן שיאפשר חשיפה של בעלי החיים, אך ימנע מכל צוות המעבדה לראות את קצה חוט ה-UV. לאחר מכן, הדליקו את מקור המתח של ה-UV.
כוון את הטיימר ל-30 דקות והצב שלטי אזהרה נחוצים כדי להבטיח שצוות מעבדה שאינו מודע לכך לא ייחשף בטעות לקרינת UV. לאחר 30 דקות, כבה את מקור מתח ה-UV. לאחר מכן הוצא את כלי הבקר בנפח 250 milliliter עם הדגים.
בנוהל זה, העבירו את הדגים מכלי הביקר בנפח 250 milliliter לאקווריום אקרילי שקוף בנפח 1.8 liter. לאחר מכן, מלאו את המיכל עד לסימון הגלישה כדי להכין את אזור הטיפול בתאורת נורות הלוגן. מקמו שתי נורות הלוגן של 250W באותו כיוון ובמרחק של 29 centimeters מהמיכל.
לאחר מכן, מקמו את שתי המנורות האחרות באופן דומה בצד הנגדי, כך שיישאר מרחק של כ-73 סנטימטרים בין שתי קבוצות המנורות. לאחר מכן, מקמו את המאוורר במרחק שווה בין שתי קבוצות המנורות, ממש מחוץ לאזור הטיפול באור. לאחר מכן, מקמו שני מיכלים של 1.8 ליטר מלאים במים במרכז אזור הטיפול באור, במרחק שווה בין שתי קבוצות המנורות.
לאחר מכן, מקמו מאוורר חמצן בכל מיכל. כסו כל מיכל במכסי אקריליק שקופים, תוך השארת מרווח של שני סנטימטרים בקצה הקרוב ביותר למאוורר. סדרו את המאוורר כך שינשוף אוויר לתוך מרווח זה, ומקמו מדחום באחד מהמיכלים או בשניהם.
בשלב הבא, הפעילו את אספקת החשמל לתאורה, למאוורר ולמאווררי המים. המשיכו בטיפול באור למשך עד ארבעה ימים. אין להאכיל את הדגים במהלך הטיפול באור, שכן הדבר ישפיע על איכות המים ויוביל לעקה מוגברת של בעלי החיים.
יש לנטר את הטמפרטורה ואת מפלס המים על בסיס יומי ולשמור על טמפרטורה של 30 עד 33 °C. במידת הצורך, יש לכוונן את מהירות המאוורר ואת המרחק בין המכלים לנורות. כמו כן, יש למלא כל מכל במי מערכת מדי יום.
48 שעות לאחר תחילת הטיפול באור הלוגן, הוציאו את הדגים מאזור הטיפול. לאחר מכן, הכינו Formal ethanol טרי כחומר מקבע, והקלי את דגי הזברה באמצעות מינון יתר של חומר הרדמה מסוג Tricaine methanesulfonate (MS-222). לאחר מכן, העבירו את דגי הזברה שהוקלו למגבת נייר, ובצעו אנוקלציה (הוצאת העין) בעזרת פינצטה מעוקלת.
השאירו את העיניים עם הגרעינים ואת המקבע למשך לילה בטמפרטורה של 4°C בתוך מקפיא (cryo). הגנו על העיניים. שטפו אותן ב-5% sucrose ב-1XPBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, החליפו את התמיסה ב-5% sucrose ב-1X PBS טריים והשאירו את העיניים למשך שעתיים. לאחר שעתיים, שטפו את העיניים ב-30% sucrose ב-1X PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את העיניים בתמיסה של יחס אחד-לאחד של מדיום הקפאת רקמה ו-30% sucrose ב-1X PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הטמיעו את העיניים בתווך הקפאה לרקמות בריכוז 100% כאשר הן מכוונות לאורך הציר הגבי-בטני. לאחר מכן, אחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני ביצוע חיתוך קריוסטטי לרקמה. כעת בצעו חיתוך קריוסטטי לרקמה והניחו אותה על למסות זכוכית.
לאחר מכן, חממו את השקופיות למשך שעתיים ב-55 °C. לאחר מכן, אחסנו את השקופיות ב-80 °C- או בצעו מיד אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית ודמיינו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. איור זה מציג את השינויים בתגובת הפרוליפרציה בעקבות פרדיגמות שונות של נזק מאור.
להלן חתכי רשתית מדג zebrafish אלבינו בוגר, שעברו סימון אימונו-היסטוכימי עם PCNA כדי להראות שגשוג תאים (מסומן באדום) בחצאים הגביים והבטניים של הרשתית בעקבות פרדיגמות שונות של נזק מאור בנקודת הזמן אפס שעות. השגשוג היה חסר בשכבה ה-interclear ב-48 HLT. תאי אב בודדים נצפו ב-INL לאורך הרשתית הגבית ובחלק קטן מהרשתית הבטנית.
ב-48 HPUV, עמודי תאי פרוגניטור היו נוכחים ברשתית הגבית (dorsal retina), בעוד שתאי פרוגניטור בודדים בלבד היו נוכחים בחלק קטן של הרשתית הבטנית (ventral retina). ב-UV פלוס 48, עמודי תאי פרוגניטור גדולים היו נוכחים לאורך הרשתית הגבית והבטנית.
איור זה מציג אובדן של פוטורצפטורים מסוג פיתריים (rod) וקונוס (cone) בדגי זברה עם פיגמנטציה בעקבות פרדיגמות שונות של נזק מאור. כאן מוצגים חתכי רשתית שנצבעו ב-Pro three כדי להראות את הגרעינים בכחול, וסומנו אימונולוגית ב-zpr R three כדי להראות מקטעים חיצוניים של פיתריים במגנטה, או ב-zpr R one כדי להראות קונוסים כפולים בזהב, לאחר כל אחת מפרדיגמות הנזק מאור. ירידות משמעותיות במספר הגרעינים של פוטורצפטורים פיתריים נצפו ברשתית הדורסלית ב-48 HLT וברשתית הדורסלית והונטרלית ב-UV plus 48 HLT.
אף על פי שהגרעינים היו היפרוטרופיים ברשתית הגבית ב-48 HPUV, לא נצפו ירידות משמעותיות במספר גרעיני האצטרונות הכפולות ב-48 HLT או ב-48 HPUV. ירידות משמעותיות במספר הגרעינים נצפו ברשתית הגבית והבטנית ב-UB פלוס שמונה H lt. שילוב של פרוצדורה זו עם שיטות אחרות, כגון מעכבים פרמקולוגיים ספציפיים לגנים או השתקת חלבונים in vivo, עשוי לחשוף את תפקידם של גנים בודדים בניוון הפוטורצפטורים ובתגובת ההתחדשות העוקבת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה משופרת להשראה של דגנרציה רשתית בדגי זברפיש בוגרים על ידי פגיעה הן בפוטורצפטורים מסוג פיתול (rod) והן בפוטורצפטורים מסוג กรטף (cone). הטכניקה משלבת חשיפה לאור UV עם טיפול באור רציף כדי להשיג אובדן נרחב של פוטורצפטורים ברחבי הרשתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- התחדשות רשתית
- ביולוגיה של פוטורצפטורים
רקע
- פוטורצפטורים (קולטני אור) הם חיוניים לראייה, ופגיעה בהם עלולה להוביל לליקוי ראייה משמעותי.
- דגי זברה הם מודל בעל ערך לחקר התחדשות הרשתית בשל יכולות ההתחדשות שלהם.
- לשיטות קיימות להשראת נזק לרשתית יש מגבלות ביעילותן.
- מחקר זה נועד לשפר את השיטות להשגת אבלציה יעילה יותר של פוטורצפטורים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להשראת דגנרציה רשתית בדגי זהבר (zebrafish).
- הבטחת נזק הן לפוטורצפטורים מסוג פלס (rod) והן למסוג กรטס (cone).
- סיוע בניתוח המשך של מנגנוני התחדשות הרשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגי זברה בוגרים שהותאמו לחושך נחשפים לאור UV למשך 30 דקות.
- לאחר מכן, הדגים מועברים למכלי זכוכית עם נורות הלוגן לחשיפה רצופה לאור למשך עד ארבעה ימים.
- לאחר החשיפה, הדגים מושמדים והעיניים מופקות לצורך אנליזה.
- מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה משמשת להערכת אובדן הפטורצפטורים.
תוצאות עיקריות
- נצפתה אובדן עקבי הן של פוטורספטורייתי ה rods והן של ה cones ברחבי הרשתית.
- שיטת החשיפה המשולבת לאור הוכחה כיעילה יותר מפרוטוקולים קודמים.
- טכניקה זו מאפשרת ניתוח מקיף של דגנרציה ורגנרציה של הרשתית.
- התוצאות תומכות בשימוש בשיטה זו למחקרי עתיד בביולוגיה של הרשתית.
מסקנות
- הפרוטוקול המשופר גורם לנזק מוצלח לשני סוגי הפטורצפטורים.
- ניתן להשתמש בשיטה זו במחקרים שונים הקשורים להתחדשות הרשתית.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון גישות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה נותן מענה לאתגר מרכזי במחקר של התחדשות הרשתית על ידי הפיכתו של תהליך השבב (ablation) של פוטורצפטורים מסוג מוט וקונוס בדגי זהב בוגרים לעקבי, מודל בעל רלוונטיות תרגומית גבוהה למחלות רשתית אנושיות. השילוב של אור UV ואור הלוגן משפר את הביטחון החזוי במחקרים מכניסטיים על ידי הפחתת השונות בהיקף הניוון, ובכך תומך בתיקוף יעדים ובחקירת מסלולים אמינים יותר. הדבר ממצב את השיטה ככלי בר-הרחבה להפחתת סיכונים במאמצי גילוי מוקדמים של אסטרטגיות לתיקון פוטורצפטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי השראה של אובדן פוטורצפטורים נרחב וניתן לשחזור, לצורך חקר מנגנוני רגנרציה.
- ערך תפעולי: מספק פרדיגמה סטנדרטית של דגנרציה התומכת בכימות עקבי של תגובת תאי פרוגניטורים בין ניסויים שונים.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) על ידי הבטחה ששני הנתיבים, של הפיתוניים (rods) והקונוסים (cones), מושפעים באופן אחיד.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מדד כמותי של דגנרציה-רגנרציה התואם לבדיקות של שגשוג (proliferation) וסממני פטורצפטורים המבוססות על אימונופלואורסצנציה.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרמטרי חשיפה לאור מוגדרים (30 min UV + עד 4 ימים של הלוגן) הישימים עבור זני אלבינו וזנים עם פיגמנטציה.
- יכולת הרחבה: מבטל את הצורך בקווים טרנסגניים של אלבינו, ובכך מאפשר שימוש ברקעים של מודלי מחלה או גיוון גנטי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין השראת דגנרציה לתוצאות רגנרציה מדידות, ובכך תומך בהערכה פרה-קלינית של תרכובות בעלות פוטנציאל רגנרטיבי.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר שילוב עם מעכבים ספציפיים לגנים או השתקה גנטית (knockdowns) כדי לנתח את תפקידם של גנים בודדים בתהליכי דגנרציה ותיקון.
- ביטחון ניבוי: מאפשר ניתוח של ת proliferation של תאי פרוגניטור ושל התגבשות מחדש של פטורצפטורים באופן תלוי מינון וזמן לצורך אופטימיזציה של מולקולות מובילות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומשמשת כמודל פגיעה סטנדרטי להבניית מחקרי רגנרציה לפני מאמצי סריקת תרכובות או תיקוף מטרות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי נתיבים של דגנרציה של פטורצפטורים והפעלה של תאי פרוגניטור על ידי גליה.
- סריקה: מייצר פלטים כמותיים (למשל, פרוגניטורים PCNA+, אובדן סממני פטורצפטורים) להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה של מידת הדגנרציה וקינטיקת הרגנרציה בין תנאים שונים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מידול תהליכי אובדן ותיקון של פטורצפטורים הרלוונטיים לבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דגנרציה הניתנת לשימוש חוזר ורלוונטית למספר פרויקטים המכוונים לתיקון הרשתית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי ביצוע אבלציה עקבית של כל הפטורצפטורים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות חשיפה סטנדרטית לאור ובקרות סביבתיות (טמפרטורה, איכות מים, האכלה).
- ערך אסטרטגי: מגביר את מהימנות קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי מזעור רעש ביולוגי במדדי הרגנרציה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על יעילות הרגנרציה במערכת מתוקפת הרלוונטית למחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול דגי זברה, בפרוטוקולי בטיחות של אור ובעיבוד רקמות עבור חיתוך קריוגני.
- נדרש מקור אור UV, נורות הלוגן, מיכלים בבקרה תרמית ותשתית למיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה.
- נדרשת סטנדרטיזציה של הסתגלות לחושך, משך החשיפה לאור וניטור סביבתי בין הצוותים.
- יש להתחשב ברגישות לאור הספציפית למין בעת התאמה למודלים אחרים.
- מוגבל על ידי הצורך בהסתגלות לחושך והקמה של ציוד ייעודי, אם כי נתמך על ידי הנחיות פרוצדורליות מפורטות.
