Name: פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למד פרוטוקול משופר לגרימת נזק קל לרשתית בדגי זברה מבוגרים באמצעות חשיפה לאור UV ותאורה רציפה. שיטה זו מאפשרת פגיעה בצברים ובמקלות עצבית לחקירת מנגנוני התחדשות רטינליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לXixia ואו לגידול דגים מעולים ותמיכה טכנית. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי R21EY019401 (RT) וP30EY04068 (RT), והזנק כספים לRT, כולל מענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון לאוניברסיטה ויין סטייט, מחלקת העיניים. JT נתמכה על ידי תומס ג ראמבל מסופקת על ידי בית הספר למוסמכים ויין סטייט מלגה.

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת השימוש בבעלי החיים בבית הספר לאוניברסיטה ויין סטייט לרפואה. 1. עיבוד אפל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה ~ 10 דגים בוגרים בקן או פיגמנט ממערכת הדיור הרגיל למתחם חשוך. אם זמין, השתמש במתחם אפל שבנוי לתוך מודול דיור דג הזברה, אשר מאפשר זרימת מים רגילה באמצעות הטנק. (אם מערכת כזו אינה זמינה, למקם את האקווריום במתחם חשוך לגמרי, והקפד לאוורר את הדגים עם חמצן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הדגים בחושך במשך 10 ימים. כשמאכילים את החיות או הוספת דגים חדשים לתיבה הכהה, הקפד להעביר מהר ככל האפשר, כדי למנוע חשיפת הדג לתקופה ארוכה של אור. </li></ol> 2. חשיפה לאור UV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את כוח למקור UV הוא כבוי. הסר את נימה אור UV מstereomicroscope ניאון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הפוך15 ס&quot;מ קוטר זכוכית צלחת פטרי (או משהו בגובה 2 ס&quot;מ דומה) כמעמד לנימת UV. קלטת צלחת פטרי לספסל המעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת חוט להט אור UV לחלק עליון של צלחת פטרי ההפוכה. מסדרים כך ש~ 2 מ&quot;מ של סוף שנתי ה סככות נימה צלחת פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג כוס זכוכית 250 מ&quot;ל. לכסות חצי מהחלק התחתון, צדדים, וחלק אחורי של הכוס עם נייר אלומיניום, כדי לוודא שצד &quot;המבריק&quot; של רדיד פרצופים הפנימי של הכוס. אם הכוס הוא סיים את לימודיו, לכסות את המחצית המנוסחת של הכוס בנייר כסף, והשאיר את המחצית ברורה של הכוס חשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את כוס 250 מ&quot;ל עם 100 מיליליטר מים ממערכת מתקן הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כוס 250 מ&quot;ל בכוס ליטר 4. מלא את כוס L 4 עם מים עד למפלס המים הוא גם עם קו המים 100 מ&quot;ל בכוס 250 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מקסימום של 10 בעלי חיים שטופלו בחושך לכוס 250 מ&quot;ל. לכסות את כוס 250 מ&quot;ל עם חתיכה קטנה של אלומיניוםנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המנגנון כולו כוס מייד בסמוך לחוט להט UV. החוט צריך להיות נוגע ללב מחוץ לכוס L 4 ומול החלק החשוף של כוס 250 מ&quot;ל. ודא כי כוס 250 מ&quot;ל מרוכזת בחלק התחתון של כוס L 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם מסך גדול, אטום מאחורי כוס 4L, המאפשר לבעלי החיים שנחשפו, אך למנוע כל אנשי מעבדה מלראות את קצה חוט UV. אזהרה: ודא שהמחסום הזה הוא במקום לפני הפעלת כוח למקור קרינת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור כוח UV. הגדרת טיימר למשך 30 דקות. הנח כל מה תוויות אזהרה הדרושות כדי להבטיח כי אנשי מעבדה תמימים לא לחשוף את עצמם בטעות לקרינת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, לכבות את מקור כוח UV. הסר את כוס 250 מ&quot;ל עם הדגים. הערה: אם סבבים רבים של חשיפה לקרינת UV נדרשים, תנו את מקור כוח להתקרר (~ 20 דקות) לפני שחוזר על פרוטוקול החשיפה. הקפד להחליף tהוא 100 מיליליטר מים עם מים טריים למערכת כל חשיפה. המים בכוס L 4 לא צריכים להיות מוחלפים. </li></ol> 3. חשיפה לאור מנורת הלוגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדג מכוס 250 מ&quot;ל לתוך האקווריום אקריליק ברור 1.8 ליטר. מלא את המכל לסימן הצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את אזור טיפול אור מנורת ההלוגן. השג ארבע 250 מנורות הלוגן W שירות מחנות לחומרי בניין מקומי. , מול שתי מנורות באותו הכיוון לארגן מלבד 29 ס&quot;מ במרכז. מסדרים את שתי מנורות האחרות באופן דומה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הסט השני של מנורות, כך שהם עומדים בפני את הסט הראשון של מנורות, והשאירו ~ 73 ס&quot;מ בין שני הסטים של מנורות. זה יוצר אזור טיפול אור בצורת מלבן של 29 ס&quot;מ על 73. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מאוורר קטן מחנות לחומרי בניין מקומי. הנח את המאוורר במרחק שווה בין שני הסטים של מנורות, ממש מחוץ לאזור טיפול אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני טנקים 1.8 ליטר מלאים במים במרכזאזור טיפול אור, במרחק שווה בין שני הסטים של מנורות. המרחק בין המנורות והקיר החיצוני של הטנק צריך להיות ~ 29 ס&quot;מ. הערה: גם אם טיפול 10 דגים רק בטנק אחד 1.8 ליטר, השתמש בהסדר זה. שני הטנקים יש צורך לשמור על טמפרטורת המים של כל טנק בטווח המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח aerator חמצן בכל המכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל טנק עם מכסי אקריליק ברורים, והשאיר את פער ~ 2 ס&quot;מ בקצה הקרוב ביותר למאוורר. מסדרים את המאוורר כך שהוא יפוצץ את האוויר לתוך הפער הזה. הנח מדחום באחד או שני הטנקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כוח האורות, המאוורר, וaerators. לשמור על טיפול באור לתקופה של עד 4 ימים. הדגים לא צריכים להיות מוזנים במהלך טיפול האור, כמו זה ישפיע על איכות מים ותוצאה במתח יותר לבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב אחר רמת טמפרטורה ומים על בסיס יומי. לשמור על הטמפרטורה ב30-33 ° C. במידת צורך, להתאים את המהירות ו / או מרחק בין הטנקים וli אוהדghts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה את כל המכל עם מים מערכת כנדרש, בדרך כלל מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תמיד בדג זברה מבוגר בריא (בדרך כלל 6-9 חודשים של גיל) כדי לשמור על שיעור הישרדות של כמעט 100%. עם זאת, אם דגים נמצאו מתים במכל, להסיר אותו מייד ולהחליף את המים בכל רחבי הטנק. </li></ol></li></ol> 4. אוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר תחילת טיפול אור ההלוגן להסיר את הדגים מאזור הטיפול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מקבע פורמלדהיד האתנולית טרי (1 פורמלדהיד 37% חלק, 9 חלקים 100% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים דג הזברה עם מנת יתר של חומר הרדמה של 2-phenoxyethanol (0.4 מ&quot;ג / ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את דג הזברה מורדמים למגבת נייר. Enucleate העין באמצעות מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את עיני enucleated במקבע וחנות O / N ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect העיניים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העיניים ב5% סוכרוז 1x PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, ואז להחליף עם1x 5% סוכרוז PBS טרי במשך שעה 2. בשלב הבא, לשטוף את העיניים ב30% סוכרוז 1x PBS O / N ב 4 ° C. לשטוף את העיניים ב1:1 (חלקים שווים) של מדיום הקפאת רקמות ו30% סוכרוז 1x PBS O / N ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע את העיניים ב% מדיום הקפאת רקמה 100 ולאחסן ב -80 ° C. אוריינט את העיניים כדי שcryosectioning של הרקמה מתבצע על ציר הגב / הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection רקמות ומניחים על שקופיות זכוכית. שקופיות חמות לשעה 2 ב 55 ° C. שקופיות חנות ב -80 ° C או לבצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית על רקמה מחולק ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי 40,51. </li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מראים כי שילוב של חשיפה לקרינת UV קצרה עם תוצאות חשיפה לאור בהירות מתמשכות באובדן photoreceptor נרחב ותגובת התחדשות חזקה. בהשוואה לשיטות LIRD הבודדות, בשילוב שיטה זו גם בפרוטוקול היעיל ביותר לפגוע בשתי מוטות קונוסים בשני החצאים של הרשתית. חשוב מכך, טיפול זה הוא יעיל בבעלי החיים פיגמנט כמו גם בעלי חיים לבקנים. למרות שאנו מספקים ראיות לכך שאת תוצאות הפרוטוקול בשילוב בניזק נרחב יותר ועקבי בהשוואה לש...

ניוון רשתית הנגרמת אור (LIRD) משמש בדרך כלל בשני מכרסמים ודג זברה לניזק מוט וקולטניים אור חרוט. בדג זברה מבוגר, ניוון photoreceptor מפעיל תאי גלייה מולר להזין מחדש את מחזור התא ולייצר אבות חולפים-הגברה. אבות אלה ממשיכים להתרבות כפי שהם נודדים לאזור הפגוע, שבו הם בסופו להצמיח קולטניים אור חדש. נכון לעכשיו, ישנן שתי פרדיגמות LIRD-בשימוש נרחב, כל אחד מהם התוצאות בדרגות שונות של אובדן photoreceptor והבדלים מקבילים בתגובת ההתחדשות. ככלים יותר גנטיים ותרופתיים זמינים כדי לבדוק את תפקידם של גנים בודדים של ריבית במהלך רגנרציה, יש צורך בפיתוח פרדיגמה LIRD חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול LIRD שגורם לאובדן נרחב ועקבי של שני קולטניים אור מוט וחרוט שביש לנו שילוב השימוש בשתי טכניקות LIRD הוקמו בעבר. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לשימוש בבעלי החיים פיגמנט, אשר מבטל את הצורך בשמירה על קווים מהונדסים של עניין על רקע בקן ללימודי LIRD.

<table><tbody><tr><td>מקור אור UV</td><td>צלחת</td> פטרי מזכוכית Leica <td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>(150 x 20 מ"מ)</td><td>סיגמא-אולדריץ'/פיירקס</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל זכוכית</td><td>סיגמא-אולדריץ'/פיירקס</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4 ליטר זכוכית</td><td>סיגמא-אולדריץ'/פיירקס</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישר</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>הלוגן 250 וואט מנורות</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ליטר מיכלי אקריליק שקופים</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ליטר מכסי מיכל אקריליק שקופים</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>מאוורר</td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>מאוורר</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>מדחום</td><td>קול-פארמר</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>כפוף מלקחיים (5/45)</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

ניוון רשתית הנגרמת אור (LIRD) משמש בדרך כלל בשני מכרסמים ודג זברה לניזק מוט וקולטניים אור חרוט. בדג זברה מבוגר, ניוון photoreceptor מפעיל תאי גלייה מולר להזין מחדש את מחזור התא ולייצר אבות חולפים-הגברה. אבות אלה ממשיכים להתרבות כפי שהם נודדים לאזור הפגוע, שבו הם בסופו להצמיח קולטניים אור חדש. נכון לעכשיו, ישנן שתי פרדיגמות LIRD-בשימוש נרחב, כל אחד מהם התוצאות בדרגות שונות של אובדן photoreceptor והבדלים מקבילים בתגובת ההתחדשות. ככלים יותר גנטיים ותרופתיים זמינים כדי לבדוק את תפקידם של גנים בודדים של ריבית במהלך רגנרציה, יש צורך בפיתוח פרדיגמה LIRD חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול LIRD שגורם לאובדן נרחב ועקבי של שני קולטניים אור מוט וחרוט שביש לנו שילוב השימוש בשתי טכניקות LIRD הוקמו בעבר. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לשימוש בבעלי החיים פיגמנט, אשר מבטל את הצורך בשמירה על קווים מהונדסים של עניין על רקע בקן ללימודי LIRD.

פרוטוקול טיפול האור עד כה תאר היה בהשוואה לכל שיטה פרטנית של LIRD. בבעלי חיים לבקנים מבוגרים חשוכים שטופלו (איורים 3-5), בטיפולים באור הבודדים שהסתיימה באובדן משמעותי של מוט (איור 3) וקונוס (איור 4) קולטני אור. עם זאת, שני הטיפולים בודדים נפגעו בעיקר קולטניים אור במחצית הגב של הרשתית, ומשאיר את רשתית הגחון מוגנת יחסית מהטיפולים באור (איורים 3 ו -4). בנוסף, בהשוואה לטיפול באור ההלוגן, אור ...

פרוטוקולי נזק קלים מרובים כבר תאר לקולטני אור וכתוצאה מכך לנזק לגרום תגובת התחדשות רשתית בדג זברה מבוגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה משופרת, שניתן להשתמש בבעלי החיים פיגמנט ושפוגע ברוב המכריע של מוט וקולטני אור חרוט על פני כל הרשתית.

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשלב שני פרוטוקולים של דגנרציה רטינלית מושרית באור שתוארו בעבר, וזאת כדי לגרום נזק הן לפוטורצפטורים מסוג rods והן לאלו מסוג cones ברחבי הרשתית. הדבר מושג תחילה על ידי חשיפת דגי זברה בוגרים שהותאמו לחושך לאור UV למשך 30 דקות. השלב השני הוא העברה מיידית של הדגים שטופלו ב-UV למכלי גידול המוקפים בארבע נורות הלוגן של 250 watt, וחשיפת הדגים לאור רציף למשך עד ארבעה ימים.השלב הסופי הוא ביצוע הרדמה והמתה (euthanasia) לדגים והוצאת הגרעינים מהעיניים לצורך ניתוח המשך. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי להראות אובדן עקבי של פוטורצפטורים מסוג rods ו-cones בכל רחבי הרשתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טיפול באור UV או טיפול במנורת הלוגן, הוא ששילוב שתי שיטות אלו מוביל לאבלציה של פוטורצפטורים מסוג rods ו-cones בכל רחבי הרשתית.נזק לפוטורספטורים גורם לתגובת פרוליפרציה נרחבת אשר מובילה בסופו של דבר לרגנרציה של הפוטורספטורים שאיבדו. ג'ניפר תומאס, סטודנטית לתואר מתקדם במעבדתי, תדגים טכניקה זו. לתחילת הדברים, השתמשו בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר 15 סנטימטרים כשהיא הפוכה כדי שתשמש כמעמד, והדביקו אותה לשולחן המעבדה לצורך חשיפה לאור UV.הסר את פילמנט תאורת ה-UV מהמיקרוסקופ הסטראו פלואורסצנטי. לאחר מכן, הדבק את פילמנט תאורת ה-UV מעל פטריית פטרי ההפוכה, כך שכ-2 millimeters מקצה הפילמנט יבלטו מעל פטריית הפטרי. לאחר מכן, כסה את מחצית הצדדים התחתונים ואת החלק האחורי של כוס כימית מזכוכית בנפח 250 milliliter בנייר אלומיניום, וודא שהצד המבריק של הרדיד פונה פנימה אל תוך הכוס.בשלב הבא, מלאו את הכוס עם 100 milliliters של מים ממערכת מתקן הדגים. הניחו כוס זו בתוך כוס בנפח ארבעה ליטר. לאחר מכן, מלאו את הכוס של ארבעת הליטרים במים עד שגובה המים יהיה שווה לקו המים של 100 milliliter בכוס של 250 milliliter.במקסימום של 10 דגים שעברו טיפול בחושך בכלי כימי של 250 milliliters, כסו את הכלי של 250 milliliters בחתיכה קטנה של נייר אלומיניום. לאחר מכן, הניחו את כל מערך הכלי בסמיכות מיידית לסיב ה-UV. הסיב צריך לגעת בדופן החיצונית של הכלי של ארבעה liters ולהפנות לכיוון החלק החשוף של הכלי של 250 milliliters.וודאו כי כוס הבקרה בנפח 250 מיליליטר ממוקמת במרכז תחתיתה של כוס הבקרה בנפח ארבעה ליטר. לאחר מכן, מקמו מסך אטום גדול מאחורי כוס הבקרה בנפח ארבעה ליטר, באופן שיאפשר חשיפה של בעלי החיים, אך ימנע מכל צוות המעבדה לראות את קצה חוט ה-UV. לאחר מכן, הדליקו את מקור המתח של ה-UV.כוון את הטיימר ל-30 דקות והצב שלטי אזהרה נחוצים כדי להבטיח שצוות מעבדה שאינו מודע לכך לא ייחשף בטעות לקרינת UV. לאחר 30 דקות, כבה את מקור מתח ה-UV. לאחר מכן הוצא את כלי הבקר בנפח 250 milliliter עם הדגים.בנוהל זה, העבירו את הדגים מכלי הביקר בנפח 250 milliliter לאקווריום אקרילי שקוף בנפח 1.8 liter. לאחר מכן, מלאו את המיכל עד לסימון הגלישה כדי להכין את אזור הטיפול בתאורת נורות הלוגן. מקמו שתי נורות הלוגן של 250W באותו כיוון ובמרחק של 29 centimeters מהמיכל.לאחר מכן, מקמו את שתי המנורות האחרות באופן דומה בצד הנגדי, כך שיישאר מרחק של כ-73 סנטימטרים בין שתי קבוצות המנורות. לאחר מכן, מקמו את המאוורר במרחק שווה בין שתי קבוצות המנורות, ממש מחוץ לאזור הטיפול באור. לאחר מכן, מקמו שני מיכלים של 1.8 ליטר מלאים במים במרכז אזור הטיפול באור, במרחק שווה בין שתי קבוצות המנורות.לאחר מכן, מקמו מאוורר חמצן בכל מיכל. כסו כל מיכל במכסי אקריליק שקופים, תוך השארת מרווח של שני סנטימטרים בקצה הקרוב ביותר למאוורר. סדרו את המאוורר כך שינשוף אוויר לתוך מרווח זה, ומקמו מדחום באחד מהמיכלים או בשניהם.בשלב הבא, הפעילו את אספקת החשמל לתאורה, למאוורר ולמאווררי המים. המשיכו בטיפול באור למשך עד ארבעה ימים. אין להאכיל את הדגים במהלך הטיפול באור, שכן הדבר ישפיע על איכות המים ויוביל לעקה מוגברת של בעלי החיים.יש לנטר את הטמפרטורה ואת מפלס המים על בסיס יומי ולשמור על טמפרטורה של 30 עד 33 °C. במידת הצורך, יש לכוונן את מהירות המאוורר ואת המרחק בין המכלים לנורות. כמו כן, יש למלא כל מכל במי מערכת מדי יום.48 שעות לאחר תחילת הטיפול באור הלוגן, הוציאו את הדגים מאזור הטיפול. לאחר מכן, הכינו Formal ethanol טרי כחומר מקבע, והקלי את דגי הזברה באמצעות מינון יתר של חומר הרדמה מסוג Tricaine methanesulfonate (MS-222). לאחר מכן, העבירו את דגי הזברה שהוקלו למגבת נייר, ובצעו אנוקלציה (הוצאת העין) בעזרת פינצטה מעוקלת.השאירו את העיניים עם הגרעינים ואת המקבע למשך לילה בטמפרטורה של 4°C בתוך מקפיא (cryo). הגנו על העיניים. שטפו אותן ב-5% sucrose ב-1XPBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, החליפו את התמיסה ב-5% sucrose ב-1X PBS טריים והשאירו את העיניים למשך שעתיים. לאחר שעתיים, שטפו את העיניים ב-30% sucrose ב-1X PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את העיניים בתמיסה של יחס אחד-לאחד של מדיום הקפאת רקמה ו-30% sucrose ב-1X PBS למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הטמיעו את העיניים בתווך הקפאה לרקמות בריכוז 100% כאשר הן מכוונות לאורך הציר הגבי-בטני. לאחר מכן, אחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני ביצוע חיתוך קריוסטטי לרקמה. כעת בצעו חיתוך קריוסטטי לרקמה והניחו אותה על למסות זכוכית.לאחר מכן, חממו את השקופיות למשך שעתיים ב-55 °C. לאחר מכן, אחסנו את השקופיות ב-80 °C- או בצעו מיד אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית ודמיינו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. איור זה מציג את השינויים בתגובת הפרוליפרציה בעקבות פרדיגמות שונות של נזק מאור.להלן חתכי רשתית מדג zebrafish אלבינו בוגר, שעברו סימון אימונו-היסטוכימי עם PCNA כדי להראות שגשוג תאים (מסומן באדום) בחצאים הגביים והבטניים של הרשתית בעקבות פרדיגמות שונות של נזק מאור בנקודת הזמן אפס שעות. השגשוג היה חסר בשכבה ה-interclear ב-48 HLT. תאי אב בודדים נצפו ב-INL לאורך הרשתית הגבית ובחלק קטן מהרשתית הבטנית.ב-48 HPUV, עמודי תאי פרוגניטור היו נוכחים ברשתית הגבית (dorsal retina), בעוד שתאי פרוגניטור בודדים בלבד היו נוכחים בחלק קטן של הרשתית הבטנית (ventral retina). ב-UV פלוס 48, עמודי תאי פרוגניטור גדולים היו נוכחים לאורך הרשתית הגבית והבטנית.איור זה מציג אובדן של פוטורצפטורים מסוג פיתריים (rod) וקונוס (cone) בדגי זברה עם פיגמנטציה בעקבות פרדיגמות שונות של נזק מאור. כאן מוצגים חתכי רשתית שנצבעו ב-Pro three כדי להראות את הגרעינים בכחול, וסומנו אימונולוגית ב-zpr R three כדי להראות מקטעים חיצוניים של פיתריים במגנטה, או ב-zpr R one כדי להראות קונוסים כפולים בזהב, לאחר כל אחת מפרדיגמות הנזק מאור. ירידות משמעותיות במספר הגרעינים של פוטורצפטורים פיתריים נצפו ברשתית הדורסלית ב-48 HLT וברשתית הדורסלית והונטרלית ב-UV plus 48 HLT.אף על פי שהגרעינים היו היפרוטרופיים ברשתית הגבית ב-48 HPUV, לא נצפו ירידות משמעותיות במספר גרעיני האצטרונות הכפולות ב-48 HLT או ב-48 HPUV. ירידות משמעותיות במספר הגרעינים נצפו ברשתית הגבית והבטנית ב-UB פלוס שמונה H lt. שילוב של פרוצדורה זו עם שיטות אחרות, כגון מעכבים פרמקולוגיים ספציפיים לגנים או השתקת חלבונים in vivo, עשוי לחשוף את תפקידם של גנים בודדים בניוון הפוטורצפטורים ובתגובת ההתחדשות העוקבת.

a-novel-light-damage-paradigm-for-use-retinal-regeneration-studies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

סרטון זה מדגים הליך לגרימת ניוון רשתית בדגי זברה בוגרים באמצעות פגיעה בלייזר. הלייזר מכוון לתאים קולטי אור ברשתית, וגורם למוות תאי ולתהליך ניווני. נזק זה מפעיל תאי גליה מולר (MG), מה שמוביל להתמיינותם לאבות תאי גזע המסייעים בהתחדשות הרשתית.

מידול ניוון והתחדשות הרשתית בדגי זברה באמצעות פגיעת לייזר מוקדית

אנו מציגים שיטה יעילה לתאי גנגליון רשתית (RGCs) בדג זברה בוגר.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

במסמך זה אנו מדגימים כימות של דה ברשתית והתחדשות והשפעתה על תפקוד ראייה באמצעות -nitrosourea N -methyl- N בדג הזברה המבוגר. מספרי קולטי אור אובדן של חדות ראייה והירידה היו במעקב על ידי התפשטות בשכבת הגרעין הפנימית. התחדשות מורפולוגית ופונקציונלית מלאה התרחשה 30 ימים לאחר הטיפול הראשוני.

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

למד פרוטוקול משופר לגרימת נזק קל לרשתית בדגי זברה מבוגרים באמצעות חשיפה לאור UV ותאורה רציפה. שיטה זו מאפשרת פגיעה בצברים ובמקלות עצבית לחקירת מנגנוני התחדשות רטינליים.

פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר

גלה סרטונים נוספים