Name: נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: למד שיטות לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה באמצעות מבחן סגירת פצע ומבחן Transwell. שיטות אלו מסייעות לחוקרים להבין מנגנוני תנועת תאים בסרטן ואימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למייק מיילס, סם סונדרס ו-C.W. אלטון משירותי המולטימדיה והטכנולוגיה של ECU על הסיוע בהפקת וידאו. אנו מכירים בתמיכת המענק מהמרכז הביוטכנולוגי של צפון קרוליינה, שחקני גולף נגד סרטן, קרן התרומות של האחים ברודי, איגוד הלב האמריקאי וקרן המחקר והחינוך לסרטן ECU/Vidant (L.V.Y. ו-M.J.R).

1. Assay סגירת פצע תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מצלחת תרבית הרקמה באמצעות 0.25% פתרון טריפסין-EDTA. גלולה תאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה, לשאוב supernatant, מחדש תאים להשעות תקשורת והתרבות. פלייט המספר המתאים של תאים בצלחת 6 היטב למפגש 100% ב24 שעות. הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות כדי לקבוע את הזמן ואת מספר התאים כדי להשיג מפגש 100% בשל סוג התא ואת גודל בשימוש גם (לדוגמא, 1 x 10 6 B16F10 תאים מלנומה הם זורעים בטוב של צלחת 6 היטב 24 שעות לפני דור הפצע). לחלופין, ניתן להשתמש ב12 גם צלחות או 24 גם. הערה: אם זמין, יכולים להיות שנזרעו תאים לתוך תרבות-Insert (מLLC ibidi) על צלחת רקמת תרבות מטופלים עושה את הפצע מראש להק. תרבות-Insert יכול להגן על פני השטח של צלחת תרבית רקמה מנזק על ידי קצה פיפטה. אם תרבות-Insert משמש צעד השמט1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) להשתמש קצה פיפטה 200 μl ללחוץ בחוזקה נגד העליון של הצלחת בתרבית רקמה ובמהירות להפוך את פצע אנכי למטה דרך monolayer התא. קצה פיפטה בגדלים שונה ניתן להשתמש כדי להפוך את גודל הפצע שהוא רצוי. אל תשתמש בכוח מופרז נגד צלחת תרבית הרקמה עם קצה פיפטה כפי שהוא עלול לגרום נזק לפני השטח. אם הפצע הוא להק מראש, ניתן להשמיט את הצעד הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב תקשורת ופסולת תא. לאט לאט להוסיף מספיק תקשורת ותרבות על הקיר גם כדי לכסות את תחתית היטב ולהימנע מניתוק תאים נוספים. בעקבות הדור והבדיקה של הפצע צריכה לקחת תמונה ראשונית. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחממה שנקבעה בטמפרטורה המתאימה וCO הריכוז 2 (בדרך כלל 37 ° C ו 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במספר נקודות זמן, למשל כל 3 שעות, להסיר את הצלחת מincubatאו ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לצלם תמונה תמונת מצב ולבדוק לסגירת פצעים. אם מיקרוסקופיה הזמן לשגות זמינה, לקחת תמונה כל מספר X של דקות (בדרך כלל מתחיל עם כל 5 דקות) לכל משך זמן בטמפרטורה ו2 תא מבוקר CO. בהתאם לסוג התא, זמן סגירת פצע עשוי להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את התוצאות של תמונות תמונה, למדוד את המרחק בצד אחד של הפצע האחר באמצעות סרגל קנה מידה. לנתח וסגירת פצע באופן ברור בהווה לאורך זמן באמצעות עלילת פיזור או גרף עמודות, למשל איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את תמונות הזמן לשגות, לייבא את התמונות לתוך תוכנת ImageJ (זמינה באופן חופשי בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/) לעשות וידאו. כדי לעשות ImageJ הפתוח, לחץ על קובץ, יבוא, ותמונה ברצף. מצא את הקובץ עם תמונות; לחץ על התמונה הראשונה בקובץ. לשמור וידאו על ידי בחירת קובץ, שמירה בשם וAVI. תאים נודדים בודדים אפשר לראות לCharacterize תנועה כיוונית. יתר על כן, מאפיינים מורפולוגיים כגון היווצרות lamellipodia והכחשת קצה נגררת ניתן ללמוד גם כן (איור 2 ווידאו נוסף). </li></ol> 2. נדידת תאי Transwell ופלישת Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) לנתק את התאים מן צלחת תרבית רקמה באמצעות חיץ אינו אנזימטית התנערות תא או 0.25% פתרון טריפסין-EDTA, תאי גלולה ידי צנטריפוגה, ולשאוב את התקשורת הקיימת עוזבת את תאי pelleted. Re-להשעות תאים בתרבית תאי תקשורת חופשית בסרום המכילה BSA 0.1% (אלבומין בסרום שור). הערה: בהתאם לשורת התאים נחקר 0.25% טריפסין-EDTA עלול להשפיע על נדידת תאים ופלישה בשל המחשוף של קולטנים שונים על פני תא 17. שים לב: מספר התאים למ&quot;ל תלוי בגודל של התאים. ייתכן שתהיינה צורך בבדיקות נוספות כדי למצוא את צפיפות זריעה שהפרהVides את התוצאות הטובות ביותר. בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר הוא נקודת התחלה טובה עבור רוב סוגי תאים בעת השימוש ב24 גם transwell להוסיף. יש מגוון של גדלי transwell הכנס ואת מספר התאים הוסיפו צריכה להיות מותאם לבהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של פתרון תא פלייט 100 μl על גבי קרום המסנן בכנס transwell והדגירה של 10 דקות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים להתיישב. הערה: הגודל הנקבובית המסוים של קרום transwell משמש תלוי בגודל הבודד של התאים במדגם. לדוגמא, אם התאים הם קטנים מדי שהם יכולים לעבור דרך הנקבוביות ללא הצורך כדי להקל על הגירה או אם הם גדולים מדי הם עשויים שלא להתאים דרך הנקבוביות. ישנם כמה מוסיף transwell עם גודל נקבובית שנעים בין 3 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, ו8 מיקרומטר עבור מבחני נדידת תאים. מוסיף transwell זמינים מסחרי מחברות כמו קורנינג. שים לב: מ &#39;transwellassay igration ניתן לשנות בקלות לבצע את assay פלישת תא. כדי לעשות זאת, להוסיף חומרים (ECM) מטריצה ​​תאית על גבי קרום transwell ולאחר מכן להוסיף את התאים על גבי ECM. לדוגמא, Matrigel מופשר ומעובה על קרח, ולאחר מכן 30-50 μl של Matrigel מתווסף 24 גם transwell להוסיף והתגבש בחממה 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות כדי ליצור שכבת ג&#39;ל דקה. פתרון תא מתווסף על גבי ציפוי Matrigel כדי לדמות פלישה באמצעות מטריקס. שים לב: יש הבדלים ברורים בין נדידת תאי transwell ומבחני פלישת תא transwell. Assay נדידת תאי transwell מודד את יכולת chemotactic של תאים כלפי הכימותרפיה attractant. Assay פלישת תא transwell, לעומת זאת, מודד שני chemotaxis תא ואת הפלישה של תאים באמצעות מטריצה ​​תאית, תהליך שהוא נמצא בדרך כלל בהתפשטות גרורה סרטנית או התפתחות עוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, מאוד carefully להוסיף 600 μl של הכימותרפיה attractant הרצויה לתוך החלק התחתון של התא התחתון בצלחת 24 גם. הוסף את הכימותרפיה attractant מבלי להזיז את הכנס transwell ולמנוע יצירת בועות. ודא את נוזל הכימותרפיה attractant בבאר התחתונה במגע עם הקרום בבאר העליונה כדי ליצור שיפוע chemotactic. זמן דגירה תלוי בסוג התא והכימותרפיה attractant בשימוש. הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות נוספות על מנת לקבוע את תקופת הדגירה. הערה: תאים חסיד, התאים נדדו יצרפו לצד השני של הקרום 1,8 האחר. כימות של תאים נדדו יכולה להתבצע בעקבות צעדי 2.4-2.8 (שלבים 2.4-2.8 לא צריכה להתבצע בסביבת סטרילית). לתאים שאינם חסיד, התאים נדדו יירד לתקשורת בתא התחתון. מספר התאים נדדו ניתן לספור באמצעות hemocytometer או זרימת cytometer 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תוסף transwell מהצלחת. השתמש המוליך כותנה שקצה כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר בזהירות את התקשורת ותאים הנותרים שלא היגר מהחלק העליון של הקרום ללא פגיעה בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600-1,000 μl של 70% אתנול לתוך באר של צלחת 24 גם. במקום להכניס transwell לתוך אתנול 70% ל10 דקות כדי לאפשר קיבוע תא. הסר transwell להכניס מצלחת 24 היטב ולהשתמש במוליך כותנה שקצה כדי להסיר אתנול שנותר מהחלק העליון של הקרום. לאפשר קרום transwell לייבוש (בדרך כלל 10-15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600-1,000 μl של .0.2% סגולים גביש לתוך באר של צלחת 24 גם ולמקם את הקרום לתוכו מכתימה. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות סגולה גביש מהחלק העליון של הקרום עם קצה פיפטה או המוליך כותנה שקצהו. בזהירות רבה, כדי למנוע כביסה את התאים קבועים, טובל את הקרום למים מזוקקים כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר את גלאים גביש העודפיםלא. לאפשר קרום transwell לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו מתחת מיקרוסקופ הפוכה ולספור את מספר התאים בשדות מבט שונים כדי לקבל סכום ממוצע של תאים שהגרו דרך הממברנה לכיוון הכימותרפיה attractant ומחוברים בחלקו התחתון של הקרום (איור 3). </li></ol>

<ol><li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+to+apoptotic+%26%2334%3Bfind-me%26%2334%3B+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Migration to apoptotic &#34;find-me&#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li>
<li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li>
<li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li>
<li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li>
<li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li>
<li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+determinants+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%22%5BJournal%5D)">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li>
<li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li>
<li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+new+insights+into+cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li>
<li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li>
<li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

נדידת תאים היא היבט חשוב ללמוד בחקר סרטן וזה יכול להיות מיושם גם ללימודי ריפוי התפתחותיים, חיסוניים ופצע. תרבית התאים בסופו של assay סגר ומבחני נדידת תאי transwell והפלישה לחשוף מידע מפורט של התנהגויות נדידת תאים ויכולים לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תא הגירה 1,2,10,14. המחקר שלנו השתמש במבחני תנועתיות תא אלה כדי לקבוע את מהירות הגירה ופלישת היכולות של שורת תאים מלנומה B16F10. Assay סגירת ...

תנועתיות היא תכונה חיונית של תאי חיים. נדידת תאים מעורבת בתפיסה של חיים, התפתחות עוברית, תגובה חיסונית, ורבים תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן ודלקת 1-9. לכן, שיטות ללמוד התנהגות נדידה סלולרי הן כלי מחקר שימושיים מאוד עבור מגוון רחב של תחומים במדעים ביו ושדות, ביולוגיה, הנדסה גנטיות, קשורים. המחקר של נדידת תאים בחקר הסרטן הוא עניין מיוחד כגורם העיקרי למוות בחולי סרטן קשור להתקדמות גרורתי. על מנת שהסרטן להתפשט ולהפיץ בכל הגוף, תאים סרטניים חייבים לנדוד ולפלוש דרך מטריצה ​​תאית (ECM), intravasate למחזור דם, לצרף לאתר מרוחק, ובסופו extravasate כדי ליצור מוקדים רחוקים 1,10-12. שיטות ביולוגיות שונות עשויות להיות מועסקות על מנת ללמוד את האירועים הללו בפירוט. פצע סגר תרבית התאיםמבחני ד הגירת transwell והפלישה נמצאים בשימוש נרחב בקהילה המדעית 1,10. בדיקות אלה יכולות לספק את הנתונים הדרושים שעשויות לאפשר הבנה של אופן שגם סוג תא מסוים באופן ספונטני יכול להעביר או להגיב להכימותרפיה attractant וdirectionally להגר אליה. כמה פנוטיפים נודדים כבר תיארו. תאים עשויים לנדוד בצורת תא בודדת כגון ראתה בmesenchymal או תנועה כמו אמבואידית-או על ידי תנועה רב תאית שכותרת הגירה קולקטיבית או תא הזרמה 13. השיטה של ​​תנועה המשמשת בתאי ניעתי ניתן לראות בקלות באמצעות assay סגירת פצע תרבית תאים. בין הדרכים הרבות ללמוד נדידת תאים, assay סגירת פצע התא הוא אחד הפשוט ביותר. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את יכולת הנדידה של המוני תא כולו. כאשר נלקחו צעד נוסף ניתן להשתמש בו כדי לצפות במאפיינים המורפולוגיים של התאים בודדים במהלך הנדידה 14. בעקבות הניתוח של סגירת פצע פנוטיפים רבים עשויים להתגלות. מדידת המרחק הסגור לאורך זמן בהשוואה לשליטה עשויה לחשוף שינויי הגירה ספציפיים או הפנוטיפ נודד לקוי שהיה ידוע קודם לכן. יתר על כן, היווצרות אחת lamellipodium התא, הכחשה זנב, ותנועה כיוונית עשויות לתת רמזים למה שעלול להיפגע או משופר בתאים של עניין 14. הגירת transwell ומבחני פלישה ניתן להשתמש כדי לנתח את היכולת של תאים בודדים להגיב directionally להכימותרפיה משיכה שונות בין אם הם כמוקינים, גורמי גדילה, שומנים, או נוקלאוטידים 4,5,8,15,16. היא עשויה גם להעריך את יכולת נדידת ההפרש נובעת מביטוי היתר של קולטן 1,14. גם מבחני אלה יכולים לשמש כדי לזהות ולאפיין את הרגולטורים המרכזיים של נדידת תאים כמו משפחת Rho של GTPases הקטן 2. בעקבות קצר אלה בקלות ובaccesבדיקות sible, במצב של נדידת תאים ואת היכולת של תא לפלוש לתוך מטריצת 3-D יכולים גם להיות נחושות.

<table><tbody><tr><td>דולבקו s שונה Eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>אלבומין סרום בקר 100106</td><td></td><td></td>תאומים</tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצץ פוספט (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>סגול קריסטל</td><td>סיגמא</td><td>C0775-100G</td><td>מומס במים ב-0.2%</td></tr> <tr><td>מאגר ניתוק תאים</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>מכסה המנוע לבטיחות ביולוגית SterilGARD</td><td>The Baker Company, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>דגם # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl מיקרוסקופ הפוך</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td></td><td>דגם # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>353046</td><td>המספר הקטלוגי משתנה בהתאם לסוג צלחת התרבות</td></tr><tr><td>הכנס קורנינג טרנסוול</td><td>פישר</td><td>07-200-150</td><td>המספר הקטלוגי משתנה בהתאם לגודל הנקבוביות של הממברנה</td></tr></tbody></table>

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

הגירה היא תכונה מרכזית של תאים חיים וקריטית להתפתחות תקינה, תגובה חיסונית ותהליכי מחלה כגון גרורות סרטניות ודלקת. שיטות לבחינת נדידת תאים שימושיות מאוד וחשובות למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי כגון ביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה, ביולוגיה של כלי הדם, ביולוגיה של התא וביולוגיה התפתחותית. כאן אנו משתמשים בנדידה ופלישה של תאי גידול כדוגמה ומתארים שתי בדיקות קשורות כדי להמחיש את השיטות הנפוצות והנגישות למדידת תהליכים אלה. השיטה הראשונה היא בדיקת סגירת פצע תרבית תאים שבה נוצרת שריטה על חד-שכבת תא קונפלואנט. ניתן לכמת את מהירות סגירת הפצע ונדידת התאים על ידי צילום תמונות במיקרוסקופ הפוך רגיל בכמה מרווחי זמן. ניתן לתעד התנהגות נדידת תאים מפורטת יותר באמצעות מערכת המיקרוסקופיה של זמן-lapse. השיטה השנייה המתוארת במאמר זה היא בדיקת נדידת תאים ופלישה טרנסוול המודדת את יכולת התנועתיות והפולשניות של התאים לעבר שיפוע מושך כימותרפיה. מטרתנו היא לתאר את השיטות הללו בצורה נגישה ביותר כך שניתן יהיה לבצע את ההליכים בהצלחה במעבדות מחקר אפילו רק עם הגדרה בסיסית של ביולוגיה של התא.

Assay פצע הסגר וassay נדידת תאי transwell מוצג כאן בוצעו באמצעות תאים מלנומה B16F10 העכבר כמודל למערכת. ב assay סגירת פצע, B16F10 תאי זרע בצלחת תרבית רקמת 6 היטב ומבוגר כדי מפגש 100% ב24 שעות. פצע של רחב כ 700 מיקרומטר נוצר באמצעות פיפטה קצה וסגירת הפצע (נדידת תאים) נרשם באמצעות מיקרוסקופיה הזמן לשגות. לחלופין, סגירת פצע יכולה להיות גם למדה על ידי לקיחת תמונות תמונת מצב בנקודות זמן שונה, אם מיקרוסקופיה זמן לשגות אינה זמינה 1. ארבעה תמונות מסדרת הזמן לשגות ב 0, 4, 8, ונק...

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

נדידת תאים היא תהליך דינמי ביותר. היא חשובה למספר תפקודים פיזיולוגיים כגון התפתחות עוברית תקינה, התגובה החיסונית, וכן לתהליכי מחלה, לדוגמה, גרורות של סרטן ודלקות.חקר נדידת תאים חשוב עבור מגוון רחב של מדעי הביו-רפואה, כגון ביולוגיה של הסרטן, אימונולוגיה, ביולוגיה של התא וביולוגיה התפתחותית. ניתן לחלק את נדידת התאים לארבעה שלבים נפרדים מבחינה מכנית: התארכות, יצירת הידבקותים חדשים, התכווצות גוף התא, ולבסוף, ניתוק הזנב. כאן נתאר שתי שיטות פשוטות לחקר קפדני של הטבע הדינמי של נדידת תאים in vitro.השיטה הראשונה היא בדיקת סגירת פצע בתרבית תאים. בדיקה זו נפוצה מאוד ונגישה למעבדות בעלות הציוד הבסיסי ביותר. בדיקת סגירת פצע בתרבית תאים היא בדיקה שבה, באמצעות קצה של פ pipette ושריטות שנוצרות על שכבה חד-שכבתית (monolayer) של תאים בצפיפות (confluent), השכבה התאית תסגור עם הזמן את הפצע שנוצר קודם לכן.ניתן לחקור את הדינמיקה של נדידת תאים בפירוט באמצעות צילום time ops או באמצעות תמונות רגעיות (snapshot). ניתן למדוד את המרחק ולחשב לאורך זמן את המהירות שבה נעו התאים. שיטה שנייה קשורה, בדיקת נדידה ופולשנות של תאים ב-transwell, היא גם נגישה מאוד למעקב אחר זריעת תאים על ממברנת transwell.ידוע גם בשם תא בויידן (Boyden chamber). באמצעותו ניתן למדוד את יכולות הנדידה שלהם לעבר מפל של חומרים מושכי-כימיים (chemo attractant). שני ההליכים הניסיוניים הנגישים הללו הם בעלי ערך רב בתחומי מחקר רבים.פרק שני, תא גידול תרביות תאים, בדיקה. שלום, שמי קלווין ג'סטיס. אני סטודנט לתואר מתקדם במעבדתו של ד"ר Yang מהמחלקה לאונקולוגיה בבית הספר לרפואה ברודי של אוניברסיטת East Carolina.והיום אדגים שני הליכים למדידת יכולות נדידה ופלישה של תאים in vitro. נתחיל כעת בהכנת תרבית התאים. המבחן: התאים ששימשו בהכנת תרבית התאים.ניתן לגדל את הבדיקה בצלחות תרבית רקמה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות לתרבית תאים. כדי להתחיל, יש לשאוב את מצע הגדילה ששימש לגידול התאים, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן להוסיף לצלחת שני מיליליטר של 0.25%tripsin EDTA ולהכניסה לאינקובטור למשך שלוש דקות. הוצא את הצלחת מהאינקובטור והוסף שלושה מיליליטר של DMM מועשר ב-10%FES.הסיר את המצע מהצלחת והעבר אותו לשפופרת קונוית של 15 מיליליטר. צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1500 RPMs. לאחר הצנטריפוגה, השהה מחדש את התאים בשני מיליליטר של DMM מועשר ב-10%FES.לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות ההמו-סייטומטר (hemo cytometer). בסיום הספירה, זרעו מספר תאים שיגיעו למצב של התלכדות (confluence) תוך 24 שעות. הכניסו את הצלחת לאינקובטור למשך 24 שעות כדי לאפשר היצמדות והתפשטות של התאים.הוצא את הפיתח מהאינקובטור ובחן אותו תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהשכבה במישור היא 100%confluent. לאחר מכן, בתוך תא הבטיחות הביולוגית, השתמש בקצה פ pipette בזהירות מבלי לפגוע במיכל תרבית הרקמה, וצור פצע מהחלק העליון של הבאר לחלק התחתון. לאחר יצירת הפצע באמצעות קצה ה-pipette, שאב את המצע ושטוף בעדינות עם 2 milliliters של מצע גידול.במקרה זה, השתמש ב-DMEM מועשר ב-10% FES כדי לשטוף שאריות קיימות, ושוב, שאב את המצע. לבסוף, הוסף שני מיליליטרים של מצע גידול ובמידה וזמין, הכנס את הפלטה לתא עם בקרת טמפרטורה ו-CO2 מתחת למיקרוסקופ. במקרה זה קיימת יכולת צילום time-lapse.פונקציית ה-time-lapse אינה זמינה. צלם תמונה ראשונית של מיקום הסימון ושל הבאר והכנס את הפלטה לאינקובטור. אם צילום time-lapse זמין, הגדר את יכולות ה-time-lapse במיקרוסקופ.נקבע את זמן הצילום המהיר (time lapse) ל-16 שעות. לאחר 16 שעות, כאשר נלקחת תמונה בכל חמש דקות, ניתן להוציא את הצלחת מהתא ולשמור את התמונות שנרכשו במהלך הניסוי על התקן זיכרון נייד (flash drive). הכניסו את ה-USB למחשב ופתחו את תוכנת Image J.לחצו על file. ייבאו רצף תמונות. אתרו את התמונות שצולמו במהלך הניסוי.לחצו על הקובץ הראשון ולחצו על פתיחה. לאחר מכן יופיעו אפשרויות הרצף. בחרו את התמונה הראשונה ברשימת התמונות שלכם והזינו את המרווחים הדרושים עבור הסרטון.כעת תופיעו בפניכם אפשרויות הקריאה של ה-VI. בחרו את האפשרות המתאימה ביותר לניסוי שלכם ולחצו עליה. כעת תוכנת Image J תפיק סרטון; כדי לשמור את הסרטון, לחצו על file, ולאחר מכן על save as ובחרו ב-AVI או בכל אפשרות אחרת שעשויה להתאים לניסוי שלכם.ניתן לנתח את הסרטון במחקר התאים כדי לבחון מאפייני נדידה שעשויים להיות רלוונטיים. מאפיינים אפשריים למחקר הם התארכות של La Malo Podal, התכווצות גוף התא והיפרדות הזנב. בהיעדר צילום בשיטת time loss, ניתן להוציא את הפלטה שהוכנסה לאינקובטור למשך 12 עד 16 שעות לאחר הצילום הראשוני.יש לצלם שוב את האזור שצולם בתחילה, ויש להוסיף סרגל כיול עבור מדידות נוספות. לאחר מדידת הרוחב הראשוני של הפצע שנוצר בתמונה הראשונה, יש להמיר את הרוחב שנמדד בפיקסלים למיקרומטרים באמצעות סרגל הכיול. לאחר מכן, יש למדוד בפיקסלים את רוחב הפצע בתמונות הסופיות באותו אזור כפי שנעשה קודם לכן, ושוב, יש להמירו למיקרומטרים באמצעות סרגל הכיול.השלב הסופי הוא חיסור הרוחב הסופי מהרוחב הראשוני כדי לקבל את הרוחב הכולל שבו נסגר הפצע במהלך פרק הזמן שהוקצב. יש לחלק את מרחק הנדידה הסופי שנמדד בזמן שהוקצב כדי לקבל את מהירות הסגירה במיקרומטרים לשעה. ניתן לחזור על שיטת הצילום במספר בארות בגדלים משתנים לצורך ניתוח כמותי יותר של נדידת תאים, פרק שלוש, בדיקת נדידה ופלישה של תאים ב-TransWell.ראשית, עליכם לגדל את התאים הרלוונטיים בצלחת לתרבית רקמה לצורך הפרוצדורה. לאחר מכן, שטפו פעם אחת ב-PBS ונתקו את התאים הרלוונטיים מהצלחת לתרבית הרקמה באמצעות באפר לפירוק תאים או טריפסין. כמו כן, אנו ממליצים לקרוא את הספרות המקצועית לגבי האופן שבו טריפסין עשוי להשפיע על התאים הנחקרים, שכן השימוש בו עלול להשפיע על התוצאות.לאחר סבב צנטריפוגה להפרדה במהירות של 1500 RPMs למשך חמש דקות, הסיר ושאב את המצע הקיים, ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-0.1%BSA. פתח את אריזת תבנית ה-Transwell והנח אותה בתוך הבאר המיועדת לגודלה הספציפי. אם אתה מבצע תחילה את בדיקת הפלישה (invasion assay) ב-Transwell, הוסף matrigel לחלק העליון של התבנית והדגר למשך 30 דקות לפני המעבר לשלב הבא.העבירו 100 µL מתמיסת התאים על גבי ממברנת ה-transwell. הדגרירו למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע. מספר התאים המועברים תלוי בסוג התא, וייתכן שיהיה צורך בניסויים נוספים לקביעת הכמות.כדי לקבוע מספר זה, השתמשו בפיפט כדי להוסיף בזהירות את המגבב הכימי (chemo attractant) הרצוי אל תחתית הבאר, מתחת לסבב (insert). השתדלו לא להוציא את הסבב. זמן האינקובציה תלוי בסוג התא.הסר את תבנית ה-transwell לאחר הדגירה והשתמש במקלון צמרon מספר פעמים ככל שנדרש כדי להסיר בעדינות את עודפי המצע והתאים שלא נדדו אל תוך הממברנה מחלקה העליון של הממברנה. היזהר לא לפגוע בממברנה. הוסף 600 עד 1000 µL של 70% ethanol לתא התחתון של תבנית ריקה.הנח את התבנית (insert) אל תוך באר המכילה 70% ethanol והדגר למשך 10 דקות כדי לאפשר קיבוע של התאים. שוב, השתמש במקלון צמרon כמספר הפעמים הדרוש כדי להסיר את ה-ethanol שנותר בתאים שלא נדדו אל תוך הממברנה מחלקה העליון של הממברנה. הוסף 600 עד 1000 microliters של 0.2% Crystal violet לבאר והנח בתוכה את התבנית לצביעת התאים.דגרו למשך 10 דקות. הסירו בדרך כלל את עודפי צבע הקריסטל ויולט (crystal violet) מחלקו העליון של הממברנה. לאחר מכן, טבלו את הממברנה במים מזוקקים מספר הפעמים הדרוש כדי להסיר את שאריות הקריסטל ויולט, תוך הקפדה רבה להימנע משטיפה של תאים שנדדו.יש להניח לממברנה להתייבש כדי לצפות בתאים באמצעות מיקרוסקופ. ניתן להסיר את הממברנה בזהירות בעזרת סקלפל ולהניח אותה על זכוכית כיסוי, או שניתן לצפות בתאים כאשר התבתי (inserts) עדיין נמצאים בבאר. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, יש לצלם מספר שדות ראייה.כדי לקבל ייצוג טוב של מספר התאים שהנדדו, ניתן לספור את מספר התאים באמצעות כלי הספירה של Adobe Photoshop. ניתן להזין את הנתונים שנאספו לתוך גרף עמודות לקבלת הייצוג המיטבי של התוצאות. פרק ארבע, תוצאות מייצגות.בשלב הבא, נסקור מספר תוצאות מייצגות מבדיקת תרבית תאים במעטפת (cell culture of enclosure assay) ומבדיקת נדידת תאים ב-transwell. שתי שיטות קשורות לבחינת ניידות תאים כפי שמתואר בסרטון זה; נתחיל עם בדיקת תרבית תאים במעטפת. כאן אנו מציגים תמונות מצלמה (snapshots) שצולמו בנקודות זמן של 0, 4, 8 ו-12 שעות.כפי שניתן לראות, לאחר יצירת הפצע ניתן לצלם תמונות ובמהלך הזמן ניתן למדוד את מרחק סגירת הפצע. אנו מציגים את הנתונים שלנו באמצעות תרשים פיזור ובשימוש בשיטה שנדונה קודם לכן, אנו קובעים את מהירות סגירת הפצע לאורך זמן. יתרה מכך, ניתן ללמוד בפירוט גם נדידה של תאים בודדים באמצעות צילום time-lapse.במקרה זה, אנו מבצעים זום לתאים בודדים במהלך סגירת הפצע, עוקבים אחר נדידתם לאורך זמן וצופים בתנועתם. ניתן לבחון בפירוט מאפיינים כגון התרחבות של הקצה המוביל, נסיגת זנב ותנועה כללית. כעת נסקור חלק מהתוצאות של בדיקת נדידת תאים בשיטת transwell. כאן אנו מציגים שתי תמונות שצולמו של הממברנה בעקבות בדיקת נדידת התאים ב-transwell.התמונה הראשונה מציגה את התוצאות ללא חומר משיכה כימי (chemoattractant), שבה נצפתה נדידת תאים מועטה עד לא קיימת דרך הממברנה. התמונה השנייה מציגה את התוצאות עם חומר משיכה כימי, שבה נצפתה נדידת תאים מוגברת אל הממברנה. מימין, מוצגות תוצאות הכימות של הניסוי שלנו באמצעות גרף עמודות עם פסי שגיאה המייצגים את הטעות הסטנדרטית.פרק חמש, סיכום: הנתונים שנאספו בעקבות בדיקת סגירת תרבית תאים בבדיקת נדידה או פלישה תאית רוחבית חושפים את יכולות הנדידה של תאים בסביבה דו-ממדית (2D) או בסביבה תלת-ממדית (3D). ניתן להשוות תוצאות אלו לתוצאות אחרות כדי לחשוף פוטנציאלית נתונים שלא היו ידועים בעבר, והן עשויות להשליך גם על בדיקות ביוכימיות אחרות. שתי בדיקות קשורות ונפוצות אלו הן בעלות ערך ונגישות בקלות למעבדות ביולוגיה של התא בסיסיות ביותר.אנו מודים לכם על שהצטרפתם אלינו היום ומאחלים לכם בהצלחה במאמציכם המדעיים העתידיים.

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מודלים של פלישת תאים סרטניים לתוך מטריצה ​​תלת ממדי תאיים לשקף טוב יותר...

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

מאמר וידאו זה מתאר שיטה שונה במבחנה לבחינת תפקידם של הורמונים, ציטוקינים ו/או גורמי גדילה בהנעת פלישת תאים סרטניים.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

למד שיטות לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה באמצעות מבחן סגירת פצע ומבחן Transwell. שיטות אלו מסייעות לחוקרים להבין מנגנוני תנועת תאים בסרטן ואימונולוגיה.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

גלה סרטונים נוספים