Name: הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למדו שיטת שמרים דו-היברידית לזיהוי אינטראקציות בין קולטן PXR לקטוקונזול. השיטה מאפשרת איתור מוטציות המעניקות עמידות לתרופה ומסייעת בפיתוח תרופות מכוונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי CA127231 ופרס דיימון רניון קרן החוקר קליני (CI 1502) (לSM). ברצוננו להודות לפרופסור זדנק דבוז&#39;ק מPalacky אוניברסיטת אולומוץ, צ&#39;כיה לתובנה מועילות שלו לדיון בניידות של טכניקה זו למוסד וסטנדרטיזציה של פרוטוקול שלהם.

1. בניית PXR וSRC-1 Fusions בוקטורי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההגברה PCR של אדם PXR LBD (107-434 חומצות אמינו) וSRC-1 אורך אנוש מלא (1-1,401 חומצות אמינו). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פלסמיד pSG5-hPXR 8 כתבנית PXR LBD, השתמש פלסמיד pCMX-src1 כSRC-1 תבניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו PCR Supermix, תבניות ה-DNA ופריימרים (ראה חומרים), לשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.25 מיקרוגרם / תבנית ה-DNA μl μl 1, זוגות פריימר 10 מ&quot;מ 2 μl כל אחד, PCR Supermix 45 μl ולהוסיף H 2 O להביא נפח כולל 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ה-PCR במחזור אחד של 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 20 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ו72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן מחזור של 72 ° C אחד עבור 10 דקות להארכה. בדקו מוצרי ה-PCR בריצה על 1% agarose ג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוצרי ה-PCR שיבוט לתוך וקטורי Y2H. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-PCR מ1% agarose ג&#39;ל. Digest PXR, LBD, PCR, וY2H וקטור pSH2-1 עםBamHI וסאלי; לעכל SRC-1-PCR וpGADNOT וקטור Y2H עם NotΙ וSalΙ. כדי לעשות זאת, להוסיף DNA 1 מיקרוגרם, 3 μl חיץ תגובת 10x, אנזימי הגבלת μl 1, ולבסוף H 2 O להביא נפח הכולל עד 30 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים דגימות עיכול ב37 אמבט מים C ° במשך שעה 1. בדוק עיכול על ידי הפעלה על 1% agarose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר דגימות עיכול מ1% agarose ג&#39;ל, ולקשור מתעכלים מוצרי ה-PCR ווקטורי Y2H ולהפוך לתאים המוסמכים DH5α. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק המושבות ולבודד את ה-DNA פלסמיד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ה-DNA פלסמיד pSH2-1-PXR ידי עיכול BamHI / סאלי, לזהות פלסמיד דנ&quot;א pGADNOT-SRC-1 על ידי עיכול NotI / סאלי. ודא שכל פלסמיד דנ&quot;א החיובי על ידי רצף. </li></ol> 2. מבחני דו היברידי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן זן השמרים לתוך 5 YPAD מיליליטר ו דגירה במשך הלילה על ידי תסיסה מתמדת (220 סל&quot;ד ב30 מעלות צלזיוס). הערה: זן שמר האפייה היה CTY10-5D(MAT TRP ade2 1-901 LEU2-3, 112 his3-200 ga l4 - gal80 - URA3 :: LexA-lacZ) המכיל גן GAL1-lacZ משולב עם LexA מפעיל 10. כדי להשיג תאי שמרי קיימא עמידים לketoconazole, אבל אלה שלא נשאו שינויי טרנספורטר כגורם להתנגדות azole 18-20, זנים חדשים של שמרי CTY10-5D התקבלו על ידי ERG3 הראשון מחיקה (Δ erg3) ולאחר מכן החדרת מחיקה נוספת ב ERG11 (erg3 Δ / Δ erg11) גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרטי הבנייה תוארו בכתב יד שפורסם בעבר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (בבוקר), לחסן שמרים (1:20) ב5 YAPD מיליליטר דגירה להשיג OD 600 ~ 0.2 ידי תסיסה מתמדת (220 סל&quot;ד ב30 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב 2,000 סל&quot;ד בmicrocentrifuge למשך 2 דקות וזורקים supernatant. לאחר מכן לשטוף את פלהפעמיים עם מים autoclaved ופעם אחת עם 0.1 M LiAc לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, להשליך supernatant ולהוסיף את ריאגנטים הבאים לתא גלולה: 240 μl PEG 3,500 50% w / v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 מ&quot;ג / ssDNA זרע סלמון מבושל מיליליטר, H 2 O 34 μl. מערבולת לערבב, להוסיף 1 מיקרוגרם הפש-PXR ו-DNA pGADNOT-SRC-1 1 מיקרוגרם ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את התערובת לפוליסטירן צינור עגול תחתון, להתסיס את השינוי, לערבב (220 סל&quot;ד ב30 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות. העבר את הצינור ל42 אמבט המים C ° דגירה במשך 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב2,000 סל&quot;ד במשך 2 דקות ולהסיר את supernatant. לשטוף גלולה פעם אחת עם מים autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים סטריליים 100 μl פיפטה לתוך הצינור, מחדש להשעות את התאים על ידי אצבע עדינה הקשה וpipetting, אז צלחת על גבי צלחות של -His/-Leu נשירה בינונית (גיבוש לליטר אחד -His/-Leu נשירה בינוני: 20 דקסטרוז גרם, 1.7 YNB גרם, CSM-His/-Leu 0.67 גרם, אמוניום סולפט 5 גרם, אגר 1.5%) וincubate ב30 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים לבודד transformants. </li></ol> 3. Assay סינון X-gal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים קרום ניטרוצלולוזה לגודל של חלק מצלחת פטרי. תווית קרום ניטרוצלולוזה כדי לסמן את הכיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קרום ניטרוצלולוזה premarked על שמרי מושבות, לוודא כי הקרום נמצא במגע עם פני השטח של מדיום הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הקרום, למקם אותו בצד מושבה על נייר סינון 3 מ&quot;מ, ולמקם את הקרום ונייר הסינון ב -80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון X-gal. הוסף 50 μl 20 מ&quot;ג / מיליליטר X-gal ו -15 μl β-mercaptoethanol עד 5 מיליליטר של Z-חיץ (חיץ L 1 מכיל 16.1 גרם Na 2 HPO 4 7H 2 O, 2 PO 4 H 2 O, גרם 0.75 5.5 אא g KCl, 0.25 גרם MgSO 4 • 7H 2 O). אם Z הצפת נשמרה על 4 מעלות צלזיוס, להביא אותו לטמפרטורת חדר לפני הוספת חומרים כימיים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני עיגולים של נייר סינון 3 מ&quot;מבצלחת פטרי ולהשרות אותם עם 5 מיליליטר פתרון X-gal. מסננים חיץ עודף מצלחת פטרי והנח את קרום ניטרוצלולוזה עם הצד עד המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה, להבטיח כי הממברנה היא מגע מלא עם נייר הסינון והוא רטוב לגמרי. עטוף את צלחת פטרי בנייר כסף ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ללילה. </li></ol> 4. Assay β-gal הנוזלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול שמרים במדיום נוזלי -His/-Leu נשירה לOD 600 0.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מיליליטר העברת 1 לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge ו צנטריפוגות ב 3,000 סל&quot;ד במשך 2 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של Z הצפת לresuspend את הכדור, צנטריפוגות ב 3,000 סל&quot;ד שוב למשך 2 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של Z הצפת עם 2ME לresuspend התא גלולה, לערבב ולאחר מכן להוסיף 50 כלורופורם μl ו20 μl SDS .0.1%. במרץ מערבולת המדגם עבור 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של ONPG פתרון (1 מ&quot;ג / מיליליטר בbuf Zfer). לכוון את השעון, דגירה על 30 מעלות צלזיוס ארוכות מספיק כדי לאפשר את הצבע הצהוב כדי לפתח ולב כולל זמן תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1 M Na 2 CO 3 כדי לעצור את התגובה ולקבוע את הספיגה ב 420 ננומטר. הריק הוא פתרון 700 μl ONPG תוספת 500 μl 1 M Na 2 CO 3. </li></ol> חישוב יחידות מילר כדלקמן: מילר יחידות = (Å420 * 1,000) / (A600 * דקות מיליליטר *) Å420: יחידות הספיגה ב 420 ננומטר; A600: יחידות הספיגה ב 600 ננומטר; דקות: זמן התגובה בדקות; מיליליטר: נפח התגובה במ&quot;ל

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
<li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+%27Jekyll+and+Hyde%27+Nature+of+PXR%3A+The+Case+for+Discovering+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
<li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Rev%22%5BJournal%5D)">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li>
<li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li>
<li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22TiPS%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li>
<li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li>
<li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li>
<li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li>
<li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+%28steroid+and+xenobiotic+receptor%29+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li>
<li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+agents%3A+mode+of+action%2C+mechanisms+of+resistance%2C+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li>
<li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+multidrug+resistance+pump%2C+Pdr5p%2C+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li>
<li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+cellular%2C+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li>
<li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+peptides%2C+proteins%2C+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li>
<li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ב assay Y2H שונה שלנו, זיהינו שאריות חשובות לאינטראקציות ketoconazole על PXR 6. מאז SRC-1 הוא coactivator (ושובט לתוך וקטור pGADNot), אנחנו גם בדקנו האם SRC-1 יכול להפעיל ביטוי lacZ כאשר משובט למערכת הווקטור הפשה והאם זה הייתי משנה את פרופיל ההפעלה ו / או להשפיע על הדליפות של assay שני היברידי השמרים. שימוש בפלסמידים מחדש ביצענו מבחני שני היברידיים בשמרי Δ Δ / erg11 erg3. כמו בעבר, אנו מראים כי ביטוי lacZ (מושבות כחולות) הוא גם מושרה בerg3 שמרי Δ Δ מתח...

Assay השמרים שני ההיברידי (Y2H) נעשה שימוש נרחב כדי לגלות אינטראקציות בין חלבונים ולאחרונה לגילוי של מולקולות קטנות, רומן המשבשות קומפלקסי חלבונים אינטראקציה 7, 8, 9, 10, 11. עם זאת, הגישות קונבנציונליות של assay זה, המשמש לגילוי סמים או &quot;להיטים&quot;, אינן מאפשרות זיהוי של שאריות allosteric אינטראקציה של תרכובות כימיקלים בתוך משטחי חלבונים, שכאשר שינו עדיין אינטראקציה ולאפשר לחקירה של השאריות שינו 11 . ואכן, שיטה (ים) כזה, אם אפשרי לפתח, תאפשר מערכת שמרים צייתנית להערכת תפוקה גבוהה של שאריות האינטראקציה allosteric קריטיות לשיבוש אינטראקציה בין חלבונים. בהקשר של גילוי תרופות, הדרך הישירה ביותר להקים אינטראקציה של תרכובות עם חלבונים תהיה כרוכה בקביעה מבנית (למשל התגבשות של קומפלקס חלבון מעכב). שיטות אלה הן בהצטיינותbersome, להשתמש במשאבים משוכללים וזה לא אפשרי מבחינה טכנית לבצע מחקרים מבניים על כל חלבון. מערכות הקרנת סמים גנטיות צייתניות הוקמו בחיידקים 1, 2 ומערכות מודל אחרות כמו שתי ההיברידי של יונקים. עם זאת, מערכות אלו זקוקות לאופטימיזציה ומערכות חלופיות כמו Y2H עדיין נבדקו ביותר בגילוי תרופות. ישנן מגבלות הכוללות רגישות ואמינות של אינטראקציות בשימוש בשיטות ייחודיות 13 עניים, לעומת זאת, assay Y2H אחד יכול להיות שונה כדי לענות על שאלות ספציפיות בנוגע לשאריות אינטראקציה. בתחום מחקר קולטן גרעיני, Y2H נעשה שימוש כדי להגדיר את חלבוני אינטראקציה 14, לעומת זאת, אינטראקציות חלבון אלה רק לעתים נדירות נעשו שימוש כדי להגדיר את האופי שבו ligands / יריבים אינטראקציה עם מתחמי קולטן חלבונים גרעיניים. לפיכך, המעבדה שלנו התמקדה מאמצים בהגדרת שיטה, במיוחד לחלבוני הקולטן שאינםנוח בקלות לproteomic שיטות מבוססות, שיחשוף ליגנד רומן / אנטגוניסט אינטראקציה שאריות באמצעות פלטפורמת גילוי Y2H מבוססת הפוכה. בהתבסס על הממצא הקודם שלנו שketoconazole משבש PXR וactivator SRC-1, פיתחנו רומן הפוך מערכת Y2H שיאפשר לנו להגדיר ולחקור את שאריות ketoconazole האינטראקציה בPXR 6. השיטה שלנו מבוססת על המאפיינים של חלבון GAL4 שמרים שמורכבת מתחומים להפרדה אחראים להפעלת ה-DNA מחייבת ותעתיק. חלבון PXR LBD מבוטא היתוך לתחום LexA-DNA מחייב (DNA-BD), תוך שיתוף מפעילי אורך המלא SRC-1 (coactivator קולטן סטרואידים 1) חלבונים באים לידי ביטוי כהתכה לתחום הפעלת GAL4 (AD ). אינטראקציה בין PXR וחלבונים היתוך SRC-1 מובילה להפעלת תעתיק של אתרי GAL4 מחייבים המכילים גן כתב β-Lac Z המשתלב בשמרים genomדואר. Ketoconazole, אנטגוניסט PXR, משבש PXR ואינטראקציה SRC-1 15, 16, 17 ואנחנו יכולים לזהות את האינטראקציה של PXR וSRC-1 בנוכחותו או היעדריו של ketoconazole לאחר צביעת מושבות במסננים לפעילות X-gal. עיקרון Y2H מודגם באיור 1 והליך הניסוי מסוכם באיור 2.

<table><tbody><tr><td>זן שמרים CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td>שמרי <td>המעבדה</td><td></td> שלנו <td>CTY10-5d הושלכו פעמיים ERG3 ו-ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) גנים6.</td></tr><tr><td>YPD Growth Medium BD</td><td>Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) ללא חומצות אמינו ואמוניום סולפט</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Blend</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-Nitrophenyl &Beta;-D-Galactopyranoside).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>מרק לוריא (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>DNA זרע סלמון סוניקטיבי מבושל (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Ketoconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% תמיסת PEG-3350, סיגמא-אולדריץ</td><td></td>' <td>P-3640</td><td></td>מעוקר מסנן</tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה</td><td>Whatman</td><td></td> 10402091 <td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת פטרי</td><td>פישר</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATCATGTCC-3'המעבדה</td><td></td><td></td> שלנו <td>PXR LBD קדימה פריימר עבור pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'המעבדה</td><td></td><td></td> שלנו <td>PXR LBD פריימר הפוך עבור pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGACAGTTCATCC -3'המעבדה</td><td></td><td></td> שלנו <td>SRC-1 פריימר קדימה עבור pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -</td><td>3'המעבדה</td><td></td> שלנו <td>SRC-1 פריימר הפוך עבור pGADNOT</td></tr><tr><td>פלטינום PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>המעבדה שלנו</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>המעבדה שלנו</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>המעבדה שלנו</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

כרגולטור קריטי של חילוף חומרים בסמים ודלקת, pregnane X קולטן (PXR), ממלא תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה מחלה המקשר את חילוף החומרים ודלקת (למשל steatosis כבד) 1,2. חל התקדמות רבה בזיהוי של ligands אגוניסט לPXR, לעומת זאת, יש תיאורים מוגבלים של יריבים כמו סמים ואתרי הקישור שלהם על PXR 3,4,5. מכשול קריטי היה חוסר היכולת לטהר את יעילות החלבון באורך מלא ללימודים מבניים עם יריבים למרות שPXR שוכפל ומאופיין ב1998. המעבדה שלנו שפותחה על שמרי תפוקה גבוהה רומן מבוסס assay שני ההיברידי להגדיר אנטגוניסט, ketoconazole של, מחייב שאריות על PXR 6. השיטה שלנו כרוכה ביצירת ספריות מוטאציות שתצלנה את ההשפעה של מוטציות בודדות על פני השטח AF-2 של PXR הצפוי לקיים אינטראקציה עם ketoconazole. הצלה או &quot;רווח של הפונקציה&quot; הערוץמוטציות nd יכולים להתבצע כך שמסקנות לגבי האינטראקציה הגנטית של ketoconazole ושאריות המשטח (ים) בPXR הן ריאלי. לכן, פיתחנו תפוקה גבוהה של שני היברידי שמרי מסך של מוטציות PXR אינטראקציה עם coactivator, SRC-1. שימוש בגישה זו, שבה את השמרים שונה כדי להתאים את המחקר של התרופה נגד פטריות, ketoconazole, אנחנו יכולים להפגין מוטציות ספציפיות על PXR מועשרת בשיבוטים מסוגלים להיקשר ketoconazole. לפי היגיון הפוך, אנו מגיעים למסקנה שהשאריות המקוריות הן שאריות אינטראקציה ישירות עם ketoconazole. assay זה מייצג רומן, assay הגנטי הצייתן למסך לאתרי קישור אנטגוניסט על משטחי קולטן גרעיני. assay זה יכול להיות מיושם על כל תרופה ללא קשר לפוטנציאל ציטוטוקסיות שלה לשמרים, כמו גם לחלבון תאי (ים) שלא ניתן ללמוד באמצעות ביולוגיה מבנית סטנדרטית או שיטות proteomic מבוססות. החסרונות פוטנציאליים כוללים פרשנות של נתונים (שיטות משלימות שימושי), רליאהה בשיטה אחת Y2H, מומחיות בטיפול בשמרים או ביצוע מבחני שני היברידי שמרים, וassay אופטימיזציה.

ביצענו assay כדי לראות אם אנחנו יכולים לזהות readout colorimetric של העמותה של PXR וקולטן סטרואידי coactivator-1 (SRC-1). מאז שמרים יש ייצור סטרולים משמעותי, זה כבר בעבר הראה כי ביטוי lacZ בשמרים יכול להיגרם ללא הצורך יגנד אקסוגניים נוסף. מצאנו כי ביטוי lacZ (מושבות כחולות) הוא גם מושרה בזן השמרים הפכו עם PXR וSRC-1, עם זאת, אין אינדוקציה של ביטוי LacZ (מושבות הלבנות) בשמרים הפכה עם וקטורים ריקים, PXR או SRC-1 בנפרד (איור 3). כדי לקבוע אם ketoconazole (25 מיקרומטר...

Ketoconazole נקשר ולעוינות pregnane X קולטן הפעלה (PXR). מסכי תפוקת שמרים גבוהים של מוטציות PXR להגדיר אזור ייחודי לketoconazole מחייב. שיטה גנטית המבוסס על שמרים זה מגלה אינטראקציות רצפטור הגרעיני רומן עם ligands שמקשר עם אתרי פני השטח מחייבים.

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לתאר בדיקת דו-היבריד של שמרים בסריקה רחבה (high throughput), החושפת אינטראקציות בין קולטן Pregnan X או PXR לבין המולקולה הקטנה המעכבת ketoconazole. דבר זה מושג תחילה על ידי בניית פלסמידי דו-היבריד של שמרים, האחד המבטא את דומיין קישור הליגנד של PXR אנושי והשני המבטא את קו-אקטיבטור הסטרואידים SRC1. נוכחות של ketoconazole משבשת את האינטראקציה של PXR אנושי עם SRC1, כפי שנחשף באמצעות בדיקות beta galacto נוזליות.יחד עם סריקה קולורימטרית של מושבות על מסנן, סריקת מוטציות של PXR בנוכחות קטוקונזול מאפשרת זיהוי של מוטציות ההופכות את הרספטור לחסין להשפעת התרופה, ובסופו של דבר ביטוי חלש שניתן לזיהוי באמצעות בדיקה ויזואלית ותוצאות של בדיקת בטא-גלקטוסידאז נוזלית. בדיקות SASE משמשות להדגמת שינויים בהפעלת PXR בנוכחות קטוקונזול, מה שמאפשר זיהוי של שאריות מקוריות המעורבות באינטראקציה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה במעבדתו של ד"ר Manny, שם אני משמש כעמית.כאשר עמדנו בפני נתונים מובנים חסרים על PXR, הטכניקות הביוכימיות לא אפשרו לנו לבצע זיהוי, במיוחד עבור גדלי אינטראקציה שהיו רדודים מאוד ולא ניתנים לתיקון בקלות. לצורך אפיון מבני, ובהתבסס על העיקרון של זיהוי מוטנטים של PXR העמידים לקיטון, פיתחנו גישה שתהיה ניתנת לניהול, ישימה ותוכלן להתבצע תוך ימים בשיטה של תפוקה גבוהה מאוד.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי כוח הקישור הפרמקולוגי של מולקולות קטנות לחלבונים קולטנים, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון כל חלבון בעל תפקיד פתוגני במחלה, ובמיוחד במקרים של מגבלות בגישות ביולוגיה מבנית בזיהוי ראשוני של שאריות קישור כדי להבין טוב יותר ולעצב אינטראקטורים של מולקולות קטנות למטרה. כדי להתחיל, הגבירו את דומיין קישור הליגנד של PXR אנושי ואת SRC 1 אנושי באורכו המלא כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. בדקו את תוצרי ה-PCR על ידי הרצה על ג'ל agarose בריכוז 1%.בשלב הבא, טהרו את תוצרי ה-PCR מתוך ג'ל AROS. ביצעו עיכול של תוצרי ה-PCR ובשני וקטורים היברידיים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, והניחו את דגימות העיכול במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. טהרו את הדגימות שעובדו בעיכול מתוך ג'ל אגרוז בריכוז 1%, ולאחר מכן בצעו ליגציה לתוצרי ה-PCR המעוכלים והמטוהרים ולשני הווקטורים ההיברידיים, לפני הטרנספורמציה לתאי DH5α kompetent לאחר אינקובציה לילה שלם בטמפרטורה של 37 °C.בחר את המושבות ובודד את ה-plasma DNA; השתמש בעיכור באמצעות אנזימי הגבלה כדי לאשש את נוכחות הווקטור והאינסרט, ואמת את כל דגימות ה-plasma DNA החיוביות באמצעות ריצוף. חפף את זן השמרים בחמישה מיליליטר של YAPD והדגר למשך לילה תחת ערבוב קבוע ב-220 RPM וב-30 degrees Celsius. למחרת בבוקר, חפף את השמרים ביחס של 1:20 בחמישה מיליליטר של YAPD והדגר עד להשגת צפיפות אופטית ב-600 nanometers של 0.2 תחת ערבוב קבוע.שקעו את התאים במהירות של 2000 RPM במיקרו-צנטריפוגה למשך שתי דקות והסילו את הנוזל העליון. לאחר מכן, שטפו את המשקע פעמיים במים שעברו אוטוקלאב ופעם אחת בליתיום אצטט בריכוז 0.1 molar. לאחר הסילוק של הנוזל העליון משטיפה האחרונה, הוסיפו למשקע התאים את ריאגנטי הטרנספורמציה המפורטים בפרוטוקול הטקסט וערבבו באמצעות וורטקס.לאחר מכן, הוסף את הווקטורים המוכנים המכילים PXR ו-SRC לפני הערבוב. שוב, העבר בפיפט את תערובת הטרנספורמציה לשפופרת פוליסטירן בעלת תחתית עגולה ונער אותה במשך 30 דקות. העבר את השפופרת למקלח מים בטמפרטורה של 42 °C והדגר למשך 30 דקות נוספות.בשלב הבא, סנטריפוג את המבחנה במהירות של 2000 RPM למשך שתי דקות לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant). שטוף את המשקע פעם אחת עם מי אוטוקלאב על ידי הוספת 100 µL של מים סטריליים למבחנה, וסספנד מחדש את התאים באמצעות טפיחות עדינות של האצבע ופיפטינג. לאחר מכן, זרע את התאים על מצע dropout ללא histidine ו-leucine והדגר בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה עד ארבעה ימים לצורך בידוד התרנספורמנטים.כדי להתחיל את בדיקת המסנן Xga, גזרו משטח ניטרוסלולוז לצורת משולש שיתאים לחלק של 10 מילימטרים של צלחת פטרי. סמנו את ממברנת הניטרוסלולוז כדי לציין את הכיוון. הניחו את ממברנת הניטרוסלולוז המסומנת על מושבות השמרים, תוך וידוא שהממברנה נמצאת במגע עם פני השטח של מצע הצלחת.הסיר את הממברנה. הנח אותה כאשר צד המושבות פונה כלפי מעלה על נייר סינון של 3 מילימטר, והנח את הממברנה ואת נייר הסינון בטמפרטורה של 80°C- למשך 15 דקות. לאחר מכן, הנח שני עיגולים של נייר סינון של 3 מילימטר בצלחת פטרי והשרה אותם ב-5 מיליליטר של תמיסת xal.שאבו את עודפי הבאפר מתוך צלחת הפטרי והניחו את ממברנת הניטרוצלולוז בצלחת כאשר הצד שבו נמצאות המושבות פונה כלפי מעלה. סגרו את המכסה תוך כדי וידוא שהממברנה נמצאת במגע מלא עם נייר הסינון ושהיא רטובה לחלוטין. עטפו את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות ועד ללילה כדי לגדל שמרים בתווך נוזלי ללא היסטידין ולאוצין עד לצפיפות אופטית של 0.7 ב-600 nm.העבירו 1 milliliter של מצע למבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 3000 RPM למשך שתי דקות. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), הוסיפו 1 milliliter של Z buffer למשקע (pellet) וסובבו שוב בצנטריפוגה. כפי שנעשה קודם לכן, הוסיפו 150 microliters של Z buffer עם tumor capto ethanol כדי לתלה מחדש את משקע התאים.לאחר מכן, הוסיפו בנערה חזקה 50 µL של כלורופורם ו-20 µL של 0.1% SDS. ערבבו את הדגימה ב-Vortex למשך 15 שניות. בשלב הבא, הוסיפו 700 µL של תמיסת ONPG, הפעילו את הטיימר והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך זמן מספיק כדי לאפשר את התפתחות הצבע הצהוב.לאחר התפתחות הצבע, רשמו את זמן התגובה הכולל. הוסיפו 500 µL של נתרבן פחמה (sodium carbonate) בריכוז 1 M כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, קבעו את הבליעה ב-420 nm.כשלב סופי, חשבו את יחידות මිලר (Miller units) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מכיוון ששמרים הם בעלי ייצור סטרילי משמעותי, ניתן להשרות ביטוי של laxy בשמרים ללא צורך בליגנד אקסוגני נוסף. בדיקת xal lift חשפה כי ביטוי laxy, כפי שנצפה באמצעות המושבות הכחולות, מושרה בזן השמרים שעבר טרנספורמציה עם PXR ו-SRC one.דבר זה נראה גם במבחן הנוזלי של בטא-גלקטוסידאז. עם זאת, לא נצפתה השראה של ביטוי lacZ בשמרים שעברו טרנספורמציה עם וקטורים ריקים של PXR לבדו או של SRC-1 לבדו. קטוקונזול משבש את האינטראקציות בין PXR ל-SRC-1 בשמרים, כיוון שכל המושבות מהמסנן השכפול היו לבנות, דבר שהוכח גם על ידי הפחתה משמעותית בפעילות הבטא-גלקטוסידאז במבחנים אנזימטיים נוזליים.כאשר ביצעו טרנספורמציות של שמרים עם S rrc one במוטנט הכפול P XR, התגלה כי המושבות שנחשפו לקטוקונזול עדיין שומרות על ביטוי laxy. תוצאה זו דומה למחקרים קודמים במעבדה זו, שהראו כי אותו PXR יכול להיות מופעל על ידי ליגנד חזק, אך הוא חסין להשפעות האנטגוניסטיות של קטוקונזול במערכי בדיקה של יונקים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הביצוע המדויק של hybrid AC והשינויים הנדרשים למחקר של שאריות קישור של מולקולות קטנות בחלבונים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשיג ספרייה מגוונת מאוד של מוטנטים של הרצפטור שלך, להגיע ליעילות טרנספורמציה טובה עבור כל 200 pluses, לפתח רפליקות כמעט זהות של המסנן במקומו עם או בלי תרופות, ולבסוף לבצע בדיקה חזותית וכימית מדויקת לזיהוי nase. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון Ian 200 a Acids protein pro as acids ו-iCal docking homologous models כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם bend uc ישימה לתאי חלבון אנושיים. ואם כן, האם ניתן ליצור מודל המגן על residues אלו כ-pharmaco עבורם.

reverse-yeast-two-hybrid-system-to-identify-mammalian-nuclear

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת כתב כי ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת קולטן-ליגנד אינטראקציות.

מערכת BW כתב ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד

אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.

זיהוי ליגנד מחייב תחום פעילות Dimerization אלפא קולטן אסטרוגן באמצעות וזמינותו שני-היברידית יונקים

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

תכנון חלבונים כרוך בבניית רצפי חומצות אמינו ושילוב מוטיבים ספציפיים ליצירת גרסאות פונקציונליות. גישה זו חיונית לפיתוח פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) כדי להילחם בפתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה. מאמר זה מציג הליך לבניית חלבונים באמצעות כלים ביואינפורמטיים שונים.

יישום של I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, שרת HADDOCK ו-HEX loria עבור De Novo ו-In Silico Design של חלבונים

למדו שיטת שמרים דו-היברידית לזיהוי אינטראקציות בין קולטן PXR לקטוקונזול. השיטה מאפשרת איתור מוטציות המעניקות עמידות לתרופה ומסייעת בפיתוח תרופות מכוונות.

הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים

גלה סרטונים נוספים