Name: ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: למד לבטא חלבוני hemagglutinin ו-Neuraminidase פונקציונליים מוירוס H7N9 באמצעות מערכת baculovirus בתאי חרקים. שיטה זו מאפשרת ייצור אנטיגנים מתקפלים כהלכה לניסויים אימונולוגיים ופיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לפטריק ג וילסון לCR9114 נוגדן חד שבטי. אנו מודים גם ג&#39;ניפר Debeauchamp וריצ&#39;רד Webby לפלסמידים A/Anhui/1/13 המקוריים. תמיכה חלקית עבור עבודה זו סופקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות במימון תכנית פרויקט גרנט AI097092-01A1 וCEIRS (מרכזים המצוינים למחקר שפעת ומעקבים, HHSN26620070010C). FK נתמכה על ידי מלגת ארווין שרדינגר (J 3232) מקרן המדע האוסטרית (FWF).

1. לדור של רקומביננטי baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט להעברה-פלסמידים baculovirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט H7 HA ו NA ectodomain N9 (או כל גן HA או NA אחר) לתוך פלסמידים העברת pFastBac שונה (ראה מבוא). וקטורים לHA המכיל תחום trimerization C-מסוף ותג hexahistidine, כמו גם עבור NA המכיל תחום tetramerization N-מסוף ותג hexahistidine, תוארו 1,10,11,22 (איור 1) וניתן לבקש מ המחברים. הערה הסבר: ectodomains HA הביע ללא תחום trimerization יהיה מקופל בצורה לא נכונה, שמוביל לאובדן של אפיטופים נטרול קונפורמציה, במיוחד בתחום הגבעול. כמו כן, הפונקציה האנזימטית NA מסתמכת על tetramerization הראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדור של bacmids להפוך העברה-פלסמידים baculovirus המכילים גנים HA ו NA לחיידקי DH10Bac לפי שימוש ביטוי baculovirusמערכת לפי הוראות יצרן. בודד ולטהר bacmids באמצעות ערכת Midiprep על פי הוראות יצרן (איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלה של baculovirus ואימות רקומביננטי של ביטוי חלבון הערה הסבר: בשלבים הבאים צריכים להתבצע על סביבה נקיה מחיידקים בזרימה למינרית. לבצע הליך זה באופן עצמאי עבור HA ו NA (או כל גן אחר של ריבית). תאי חרקים גדלים בדרך כלל ב28 ° C ללא CO 2. תאי Sf9 עבור פרוטוקול זה גדלים בתקשורת תא חרק המלאה TNM-FH בתוספת 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס * ו0.1% פתרון F68 Pluronic, אם לא צוינו אחרת, וpassaged 01:04 פעמיים בשבוע. חמישה תאים גבוהים גדלים בתקשורת בסרום חופשי SFX וpassaged 1:15 פעמיים בשבוע. * תוספת של אנטיביוטיקה צריכה להיחשב אופציונלית לאורך כל הפרוטוקול והותאמה על פי הנהלים בשימוש בכל מעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי חרקים Sf9 6 צלחות גם בצפיפות של 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר ולתת לשבת במשך 20 דקות בחממה 28 מעלות צלזיוס (ללא CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 מיקרוגרם (conc. 0.5-2 מיקרוגרם / ul) של bacmid רקומביננטי עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, 1% העט סטרפטוקוקוס) 100 μl. מערבבים 6 μl של סוכן transfection עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, עט סטרפטוקוקוס) 100 μl. לשלב את שני כרכים, מערבב בעדינות ולתת לשבת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר (תערובת transfection). כולל חיקוי transfection אחד כשליטה (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתאי Sf9 מצופה (תאים כעת להיצמד לצלחת) ולהחליף עם 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא TNM-FH מכיל עט סטרפטוקוקוס (1%). הוסף את הכרך השלם של תערובת transfection (מצעד 1.2.2) ולטלטל את צלחת 6 היטב בקפידה במשך 5 שניות. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 שעות (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף wi תקשורתתקשורת ה טרי מלאה TNM-FH (מכיל 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס ו0.1% F68 Pluronic). דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 ימים. בדקו מדי פעם תאים תחת מיקרוסקופ. תאים נגועים מופיעים בדרך כלל גדולים יותר, עגול יותר, מוגדלים גרעינים, ולהתחיל לנתק (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר של תאים ואישור של ביטוי חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי הודעה 6 ימים transfection ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. Supernatant מכיל baculovirus רקומביננטי - זה ישמש להפקת מייד מניות עובדות, או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את ביטוי חלבון לאסוף כדורים וגלולים ב500 μl של PBS. מערבבים 50 μl של ההשעיה עם 50 μl של חיץ טעינה-SDS (המכיל סוכן צמצום). הפעל SDS-PAGE ולבצע ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי hexahistidine כדי לאשר ביטוי גנים. כוללים תאים ממדומיםtransfection כפקדים שליליים (איור 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מניות עובדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 5 x 10 5 Sf9 תאים / 2 סנטימטר בבקבוק סנטימטר T175 2 ולתת לשבת במשך 20 דקות לאפשר להם לצרף למנה. החלף תקשורת TNM-FH להשלים עם תקשורת TNM-FH המכילה 3% FBS (1% העט סטרפטוקוקוס, 0.1% F68 Pluronic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים עם של supernatant ההצלה 100 μl. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO 2 למשך 6 ימים ולבדוק מדי פעם אם תאים מקבלים נגועים (כמתואר בשלב 1.2.5.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב2,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולאסוף supernatant. זהו עכשיו מניית P2 שלך. מלאי זה יכול להיות מאוחסן ללא הגבלת זמן ב 4 ° C. חזור על תהליך ההדבקה באמצעות של מניית P2 100 μl להדביק תאים. המניה שנוצרה נקראת P3 או מניות עובדות, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או להשתמש בם ישירות לביטוי חלבון. מניית P3 מכילה בדרך כלל 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 פלאק ויצר יחידות / מיליליטר. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. ביטוי חלבון וטיהור הערה הסבר: תאי Sf9 לתמוך בצמיחה של baculovirus טוב מאוד. עם זאת, היכולת שלהם להפריש כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי היא מוגבלת. לכן אנו משתמשים בקו אחר חרקים תא, חמישה תאים גבוהים, לביטוי של חלבונים רקומביננטיים מופרשים. תאים אלה אינם תומכים בשכפול baculovirus לכותרות גבוהות מאוד 13 אבל יש להם יכולת הפרשה גבוהה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדל חמישה תאים גבוהים לגדול חמישה תאים גבוהים במדיום תרבית תאי חרקים SFX בס&quot;מ T175 2 צלוחיות. מעבר בכל יום אחר 1:3. לתרבות 200 ביטוי מיליליטר תצטרך לגדול 5 צלוחיות ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירת והדבקה של חמישה תאים גבוהים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק חמישה תאים גבוהים מ -5 ס&quot;מ T175 2 צלוחיות על ידי הקשה על צלוחיות עם היד שלך. לאסוף suspe התאnsion ולהעביר לתוך צינורות 50 צנטריפוגה מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב1,200 XG במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant באמצעות אחסון ולאחד את כדורים על ידי resuspending ב15 מיליליטר של מניית P3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשבת במשך 15 דקות במכסת מנוע הזרימה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 מיליליטר של מדיום תרבות Hyclone SFX לתוך בקבוק נקי, סטרילי 1,000 מיליליטר ייקר (ללא buffles, אטום עם רדיד אלומיניום לפני מעוקר, לא צריך היה בשימוש במשך תרבויות חיידקים לפני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה P3/cell לתוך הבקבוק שייקר. לאטום עם רדיד אלומיניום סטרילי ובקבוק העברה לתוך שייקר. לנער ב70 סל&quot;ד ב28 מעלות צלזיוס במשך 72-96 שעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצירת חלבון רקומביננטי מsupernatants ביטוי תא גבוה חמש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72-96 supernatants שעות שלאחר זיהום העברת התרבות ל500 דליי מיליליטר צנטריפוגה. ספין ב5,500 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בינתיים לשטוף את צלוחיות שייקר 3x עם מים מזוקקים פעמיים(DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 3 מיליליטר תרחיף Ni-שרף לתוך צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של PBS (אחד זקוק לתרבות מיליליטר 200). לנער היטב ולהסתובב ב3,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. למזוג את PBS ולשמור את הכדור. מערבבים את supernatant תא החרק עם גלולה Ni-השרף ולהעביר לתוך צלוחיות שייקר כבר נשטפו. לדגור על C ° 4 ל2-4 שעות, ואילו רועד (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 10 עמודת פוליפרופילן מיליליטר במהדק בעמדת תמיכה. הסר את שני כובעים, ולמקם את כוס מתחת לעמודה לאסוף זרימה דרך (פסולת). קח הבקבוק שייקר מתוך ייקרתי ולהתחיל להעביר את תערובת supernatant / תרחיף על הטור, זה יהיה לשמור על Ni-השרף ורק את supernatant יזרום דרך. להעביר את כל הנפח מעל העמודה (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את 4x השרף עם 15 מיליליטר של חיץ כביסה (50 מ&quot;מ Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, imidazole 20 מ&quot;מ, pH 8). בואו כל ניקוז הכביסה החיץמהעמודה ולסגור אותו עם הכובע (צד תחתון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של חיץ elution (50 מ&quot;מ Na 2 HCO 3, 300 mM NaCl, 300 imidazole מ&quot;מ, pH 8) ולתת לשבת במשך 5 דקות. פתח עמודה ולאסוף את eluate. חזור על פעולה 3 פעמים נוספות (עם סך של 8 מיליליטר של חיץ elution). Eluate המכיל ריכוזים גבוהים של חלבון בדרך כלל תערוכות קצף כאשר מזועזע (איור 7). שמור eluate על קרח רטוב בכל הזדמנות אפשרית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילופי חיץ וריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחידות Prespin 15 מיליליטר אולטרה צנטריפוגה (30 kDa חתוכים לHA / NA, אך עשויות להשתנות בהתאם לגודל החלבון מטוהר) עם PBS (pH 7.4-7.6) ב3,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. זורק לזרום וeluate עומס על טור הספין. מלא עם 5 מיליליטר של קור סטרילי, קרח PBS וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת פריקה דרך שוב, למלא עם 15 מיליליטר של PBS הקר כקרח וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C. חזור על פעולה זו proceדורה עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את טור הספין מתוך צנטריפוגה ולאסוף להתרכז החיץ החליף (בדרך כלל 200 μl). זה מרוכז מאוד חלבון רקומביננטי. יש לשטוף את טור הספין עם 400 μl של קרח הקר סטרילי PBS ולהוסיף את זה לתרכיז. שמור את התרכיז על קרח בכל העת. </li></ol></li></ol> 3. אפיון ובקרת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת ריכוז חלבון קח aliquot של התרכיז ולמדוד אותו על ידי שימוש בשיטת כימות החלבון שלך של בחירה. הגדר ריכוז חלבון עד 1 מ&quot;ג / מיליליטר על ידי הוספת PBS ולהקפיא aliquots קטנים ל-80 ° C. מחזורי הפשרת הקפאה יפגעו במבנה החלבון ויכולים להוביל לצבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS-PAGE והכתמת Coomassie הפעל 500 ng של החלבון שלך על SDS-PAGE ולבצע מכתים Coomassie. עבור מכתים מהיר ונוח להשתמש מגיב Coomassie בשילוב עם פרוטוקול מיקרוגל. חלבוני HA מופיעים בדרך כלל ב64kDa אילו חלבוני NA צריכים לרוץ בגודל של כ 56 kDa (8A דמויות ו-B). באמצעות הפרוטוקול תאר אתה לא צריך לראות את כל מוצרים פגומים. אם השפלה מתרחשת זה בדרך כלל סימן לזיהום שמרים / פטריות בביטוי. במקרה זה לחזור על התהליך ולוודא כדי לשמור על הכל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מערבי / ELISA על מנת לאמת את זהות חלבון אנו ממליצים לעשות כדי כתם מערבי או assay ELISA עם נוגדנים ספציפיים. באופן אידיאלי, מבחני ELISA מבוצעים עם נוגדן אשר נקשר לאפיטופים קונפורמציה (נוגדני גבעול אנטי HA למשל 1). באמצעות נוגדן כזה הקיפול הנכון של החלבון יכול להיות אישר (איור 8C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת NA פעילות קיפול נכון של NA הנגיפי גם יכול להיקבע על ידי מדידת פעילות NA. אנו ממליצים לבצע בדיקה זו באמצעות assay NA * STAR זמין המסחרית (פשוט בצעו את הנחיות המשתמש). </li></ol>

<ol><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603(2012).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock%2C+ecuador%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li>
<li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li>
<li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li>
<li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li>
<li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li>
<li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichoplusia+ni+cells+%28High+Five%29+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles%3A+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li>
<li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cells+for+antibody+production%3A+evaluation+of+an+efficient+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li>
<li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A%2FBrisbane%2F59%2F07+and+B%2FFlorida%2F04%2F06+when+produced+in+various+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li>
<li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li>
<li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+%28FluBlok%29+against+influenza+in+healthy+adults%3A+a+randomized%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li>
<li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li>
<li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+%28H7N9%29+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li>
<li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li>
<li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+A+virus+%28H7N7%29+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li>
<li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

למרות שהביטוי של חלבוני HA ו NA נגיף שפעת בתאי חרקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus הוא ישר קדימה, בדרך כלל, יש כמה נקודות חשובים שיש לשקול. זה חשוב, כפי שציין בהקדמה, שectodomains של HA ו NA באים לידי ביטוי בשילוב עם תחומים trimerization או tetramerization, בהתאמה. תחומים אלה מבטיחים קיפול נכון של המולקולות בדרך כלל נעזרות בתחום הטרנסממברני, שאינו נוכח אם רק ectodomain באו לידי ביטוי. לדוגמא, הביטוי של ectodomain HA ללא תחום trimerization מוביל לoligomerization והתערערות אפיטופי...

כתגובה ראשונה להופעתה האחרונה של זן רומן H7N9 שפעת וירוס בסין, רכשנו פלסמידים הנושאים את רצפי הגנום לhemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA) הגנים של שני הבידודים הראשונים. שימוש בפלסמידים אלה היינו יכול לבנות במהירות וקטורי ביטוי baculoviral לייצור של HA רקומביננטי ו NA בתאי חרקים. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו והוכיחה מרכזי לרבים מהפרויקטים של המחקר המתמשך שלנו 1-8. תאי חרקים יכולים לקפל בצורה נכונה ושלאחר translationally לשנות חלבונים מורכבים. שינויים אלה כוללים glycosylation N צמוד, וזה חשוב עבור רבים גליקופרוטאינים נגיפיים. ככזה, אין זה מפתיע כי מערכת baculovirus היא די הוקמו להבעת פני השטח אנטיגנים נגיף שפעת. למעשה, רבים של מבני גבישי HA ו NA היה לפתור באמצעות חלבוני תא הביע חרקים 9-11. יתרון נוסף שלמערכת נמצאת בתשואות גבוהה החלבון אמין שלה של עד 30 מ&quot;ג של תרבית תאי HA / L (המבוססת על הניסיון שלנו עם יותר מ -50 חלבונים שונים HA) - תוצאה של ביטוי זיהום בנגיף מונע מאמרגן polyhedrin החזק. הסרת הטרנסממברני וendodomain של חלבוני HA ו NA מאפשרת ביטוי של גרסאות secretable, מסיסה של החלבונים ובכך מאוד מקל על תהליך הטיהור. בנוסף, ectodomains אלה hexahistidine מתויג ולכן יכול להיות מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה באמצעות Ni 2 + שרף. תחומים הטרנסממברני של חלבוני HA ו NA לתרום לhomotrimer והיווצרות homotetramer, בהתאמה. על מנת לשמר oligomerizations אלה, אנו להוסיף תחום trimerization טרמינל C-לHA-, ותחום tetramerization N-המסוף לNA הבונה (איור 1). יש לנו הראינו בוודאות כי תחום כגון trimerization מייצב פונקציונליות, ותוצאותrved אפיטופים קונפורמציה על גבעול תחום של 1 HA. Tetramerization הנכון של NA עשוי גם לתרום לתיקון מתקפל וNA פונקציה 10. ניתן לבקש רצפים ווקטורי baculo העברת מחסה תחומים trimerization או tetramerization מהמחברים או ממעבדות אחרות בתחום, 9,10,12. נושא חשוב נוסף לביטוי של חלבונים מופרשים בתאי חרקים הוא הבחירה של שורת התאים תקין. בעוד frugiperda Spodoptera נגזר תאי Sf9 לתמוך שכפול baculovirus טוב מאוד ומשמשים בדרך כלל להצלת וירוס והתפשטות, יש להם היכולת להפריש כמויות גדולות של חלבון מוגבל. Trichoplusia ni נגזר BTI-TN-5B1-4 תאים (הידוע בהכינוי גבוה חמש) יש יכולת הפרשה גבוהה יותר ונמצא שורת התאים של בחירה לביטוי בפרוטוקול זה 13,14. יתר על כן, כדאי להפחית או אפילו להסיר את סרום שור העובר (FBS) מתרבויות ביטוי. לפיכך, אנו משתמשים במדיה עם מופחת (3%) תוכן FBS לגידול המניות עובדות וירוס, ואנו מבצעים את ביטוי החלבון בתקשורת חופשית בסרום. חלבוני HA ו NA רקומביננטי משמשים עבור רבים טכניקות החיסוניות. אולי אחד הנפוץ ביותר הוא במבחני ELISA למדידת המרה בסרום על חיסון בבני אדם או בעלי חיים 4,6,7,15. יש וNAS משמשים גם במבחני ELISPOT כשתי מולקולות של גירוי וריאגנטים לזיהוי תאי מפרישי נוגדנים 16. השימוש בם כפיתיונות מולקולריים מאפשר במיוחד כדי למיין עבור plasmablasts או סוגים אחרים של B-תאים שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבודד נוגדנים (טיפוליים) חד שבטיים (מבז). מולקולות HA ו NA רקומביננטי משמשות עוד באפיון של בז אלה 8. דוגמאות אחרות כוללות ללמוד את יציבות pH או סגוליות של קולט הביע ידי מבודד וירוס שונה, או אנזימטי NA ספציפי כמותית הערכהפעילות או התנגדות למעכבים. יתר על כן, רקומביננטי, HA מטוהר יכול לשמש כדי לתקנן תוכן HA של חיסוני נגיף שפעת מומתים. חשוב לציין, RHA (ובמידה מסוימת NA) מועמדי חיסון נמצאים כעת נבדקו במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים בבני אדם עם חיסון מועמד אחד שמורשה על ידי ה-FDA בשנת 2013 2,17-19. היתרון של חיסונים אלה רומן הוא כי, בשל האופי רקומביננטי של חלבונים אלו, ניתן למנוע את תהליך העבודה האינטנסיבית של יצירת של וירוסי reassortant צמיחה גבוהים. אולי אפילו יותר רלוונטי היא העובדה שתשואת HA שלהם היא גבוהה ולשעתק מזן לזן. כמו כן, מאחר חיסונים אלה מיוצרים במערכת חופשית ביצה, הם אינם מכילים חומרים מזהמים חלבון זה הם בעייתיים עבור אנשים עם אלרגיות לביצה. כאן בחרנו להביע את חלבוני HA ו NA משני בידודים של נגיף הרומן הסיני H7N9 השפעת, / Anhui/1/13 וA/Shanghai/1/13 20,21. אלו הן דוגמאות בזמן, אבל הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לביטוי של כל שפעת וחלבונים B HA או NA וניתן להתאים להביע כל חלבונים נגיפיים או סלולריים מופרשים אחרים. ניתן לשכפל חלבונים הטרנסממברני trimeric או tetrameric לקלטות ביטוי המשמשות לHA ו NA, בהתאמה. עם זאת, חלבונים תאיים מופרשים המסיסים ביותר, כמו האינטרפרונים לדוגמא, לא צריכים תחום נוסף לייצוב ויכולים לבוא לידי ביטוי אך ורק עם תג hexahistidine C-מסוף.

<table><tbody><tr><td>שם החומר/ציוד</td><td>מספר קטלוגי</td><td>של החברה</td><td>הערות/תיאור</td></tr><tr><td>מערכת ביטוי Baculovirus Bac-to-Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>עקוב אחר הוראות היצרן</td></tr><tr><td>TNM-FH מדיום חרקים</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II מגיב</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Agarose Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon מסננים אולטרה צנטריגואליים Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>עט Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>עמודי פוליפרופילן (5 מ"ל)</td> <td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>יעילות מקסימלית DH10Bac חיידקים</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure מסנן פלסמיד ערכת Midiprep</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>למאגרי שטיפה ושטיפה</td></tr><tr><td>תאי</td><td>Sf9 ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five cells</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וneuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן h7n9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

מערכת ביטוי baculovirus היא כלי רב עוצמה לביטוי של חלבונים רקומביננטיים. כאן אנו משתמשים בו כדי לייצר גרסאות בצורה נכונה מקופלות ומסוכרות של שפעת גליקופרוטאינים משטח וירוס - hemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA). כדוגמא, בחרנו חלבוני HA ו NA לידי ביטוי על ידי נגיף H7N9 הרומן שהתפתח לאחרונה בסין. עם זאת הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לחלבוני HA ו NA לידי ביטוי בכל שפעת אחרת וזני B וירוס. חלבונים רקומביננטיים HA (RHA) וNA (RNA) הם חומרים כימיים חשובים למבחנים חיסוניים כגון ELISPOT וELISA, וגם בשימוש רחב לסטנדרטיזציה חיסון, גילוי נוגדנים, בידוד ואפיון. יתר על כן, ניתן להשתמש במולקולות NA רקומביננטי למסך למעכבי מולקולה קטנות ושימושיים לאפיון של הפונקציה האנזימטית של NA, כמו גם רגישותו לתרופות אנטי. חלבוני HA רקומביננטי גם being נבדק כחיסונים ניסיוניים במודלים של בעלי חיים, וחיסון המבוסס על HA רקומביננטי היה מורשה לאחרונה על ידי ה-FDA לשימוש בבני אדם. השיטה שאנו מתארים כאן כדי לייצר את המולקולות הללו היא ישר קדימה ויכולה להקל על מחקר במעבדות שפעת, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבונים במהירות ובעלות נמוכה. למרות שכאן אנחנו מתמקדים בגליקופרוטאינים משטח וירוס שפעת, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר חלבונים נגיפיים משטח וסלולריים אחרים.

מולקולות HA מA/Shanghai/1/13 וA/Anhui/1/13 הביעו היטב עם תשואות של כ 20 תרבות מ&quot;ג / ליטר. מולקולות NA של שני הזנים הראו רמות ביטוי מתונות החל מתרבות מ&quot;ג / ליטר 0.2 לA/Shanghai/1/13 ל0.7 מ&quot;ג / ליטר לA/Anhui/1/13. היו כל ארבע הכנות החלבון מעט מאוד כדי לא זיהומים (8A דמויות ו-B) עם יש להיות של טוהר גבוה יותר מאשר NAS אשר יכול להיות מוסברת על ידי רמת הביטוי. A/Shanghai/1/13 HA נותח נוסף באמצעות ELISA עם אדם הגבעול-reactive מנטרל הרחב מב CR9114 23.<...

כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר גליקופרוטאין מטוהר של שפעת, המגלוטינין ונוראמינידאז מקופלים כהלכה לצורך בדיקות אימונולוגיות וניסויי חיסון. זה מושג על ידי שיבוט ראשון של הגנים הנושאים שפעת של BMid רקומביננטי, ולאחר מכן יצירת נגיפי באולה רקומביננטיים. השלב השני הוא להשתמש בנגיפי הבאולה הרקומביננטיים הללו כדי לבטא חלבוני המגלוטינין ונוראמינידאז בתאי חרקים.לאחר מכן, החלבונים הרקומביננטיים מטוהרים מתרבית התאים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה. השלב האחרון הוא לאפיין את החלבונים הללו כדי להבטיח איכות טובה ופונקציונליות ביולוגית. בסופו של דבר, החלבונים הרקומביננטיים משמשים לחקירת תגובות חיסוניות לגליקופרוטאינים על פני השטח של נגיף השפעת.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ביטוי חיידקי של HA אחד, למשל, הוא שהאנטיגנים המטוהרים מקופלים מתקנים ונשארים פעילים גם מבחינה ביולוגית, בניגוד לשימוש בתכשירי וירוס שלם לבדיקות אימונולוגיות. ריאגנטים אלה מאפשרים למדוד תגובות חיסוניות כנגד חלבוני המגלוטינין ושאינם נויראמינידאז. רק התחל פרוטוקול זה עם יצירת נגיף באולה רקומביננטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט העובד באופן אספטי בצלחת מכסה מנוע זרימה למינרית, SF תשעה תאי חרקים בשש לוחות באר בצפיפות של 200,000 תאים לסנטימטר מרובע.ובואו נשב 20 דקות באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס ללא CO2. לאחר מכן מערבבים שני מיקרוגרם של גב רקומביננטי באמצע עם 100 מיקרוליטר של Trico Leia ברך פורמולה בינונית HINK או TNM fh. לאחר מכן מערבבים שישה מיקרוליטר של חומר הטרנספקציה עם 100 מיקרוליטר של מדיום חרקים TNM FH.ערבבו את שני הכרכים, ערבבו בעדינות ותנו לתערובת הטרנספקציה לשבת במשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר כלול טרנספקציה מדומה אחת כבקרה, המכילה את מגיב הטרנספקציה אך ללא DNA. הסר את ה-SNAT מתשעת תאי ה-SF המצופים והחלף בשני מיליליטר של מדיום TNM FH נטול סרום המכיל תמיסת סטרפטומיצין 1% פניצילין.הוסף את הנפח המלא של תערובת הטרנספקציה לתאים ונדנד את צלחת שש הבארות בזהירות למשך חמש שניות. דגירה באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס ללא CO2 למשך שש שעות. החלף את המדיה במדיה TNM FH מלאה טרייה לפני הדגירה של הצלחת באותם תנאים למשך שישה ימים.בדוק את התאים מדי פעם במיקרוסקופ. תאים נגועים בדרך כלל נראים גדולים יותר. לעגולים יש גרעינים מוגדלים ומתחילים להתנתק.קצור תאים שישה ימים לאחר הטרנספקציה על ידי צנטריפוגה ב -2000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסופרנטנט מכיל את נגיף הבאולה הרקומביננטי וישמש לייצור מלאי פעיל באופן מיידי, או שניתן לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך שנים. בדוק את ביטוי החלבון באמצעות דף SDS וכתם מערבי והכן את מלאי העבודה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.תאי SF תשעה תומכים היטב בצמיחה של נגיף מקולרי. עם זאת, יכולתם להפריש כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי מוגבלת. לכן אנו משתמשים בקו תאי חרקים אחר.חמישה תאים גבוהים לביטוי חלבונים רקומביננטיים המופרשים. תאים אלה אינם תומכים בצמיחה של נגיף הבלו לטיטר גבוה, אך יש להם יכולת הפרשה גבוהה מאוד. לגדל חמישה תאים גבוהים במדיום תרבית תאי חרקים SFX במעבר צלוחיות T 175 סנטימטר רבוע כל יומיים.פיצול ביניהם ביחס של אחד לשלושה. גדל חמש צלוחיות משולבות לתרבית ביטוי של 200 מיליליטר כדי לקצור ולהדביק את חמשת התאים הגבוהים. ראשית, נתק חמישה תאים גבוהים על ידי הקשה על הצלוחיות.אוספים את תרחיף התאים ומעבירים לצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר. סובב את הצינורות בחום של 1200 גרם למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק ואחד את הכדורים על ידי החייאה, והשעיה אותם ב -15 מיליליטר של מלאי P שלוש.הניחו לתאים לשבת במשך 15 דקות במכסה המנוע. העבירו 200 מיליליטר של מדיום תרבית SFX משובט גבוה לבקבוק שייקר סטרילי נקי של 1000 מיליליטר. לאחר מכן העבירו את מתלה ה-P בעל שלושה תאים לאטם בקבוק השייקר עם רדיד אלומיניום סטרילי לפני ניעור ב-70 סל"ד ו-28 מעלות צלזיוס למשך 72 עד 96 שעות.לקצור חלבון רקומביננטי מסופרנטנטים בעלי ביטוי גבוה של חמישה תאים ב-72 עד 96 שעות לאחר ההדבקה. העבירו את חומרי העל של התרבות לדלי צנטריפוגה של 500 מיליליטר. סובב בחום של 5, 500 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בינתיים יש לשטוף את בקבוק השייקר שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים. הפיפטה הבאה. שלושה מיליליטר של תמיסת שרף ניקל לתוך צינור של 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר PBS לכל 200 מיליליטר תרבית.יש לנער היטב לפני הסיבוב במשך 10 דקות בחום של 3000 גרם ובטמפרטורת החדר לאחר צנטריפוגה. רוקנים את ה-PBS ושומרים את הגלולה. מערבבים את תאי החרקים עם כדור שרף הניקל ומעבירים לצלוחיות השייקר שכבר שטופות.דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות תוך כדי טלטול. לאחר מכן, הרכיב עמוד פוליפרופילן של 10 מיליליטר על מהדק למעמד תמיכה. הסר את שני המכסים והניח מתחת לעמוד כדי לאסוף את הזרימה.לאחר הדגירה של בקבוק השייקר, התחל להעביר את תערובת התרחיץ הסופרנטנטי על העמוד. הוא ישמור על שרף הניקל ורק הסופרנטנט יזרום דרכו. העבירו את כל הכרך על העמודה.שוטפים את השרף ארבע פעמים עם 15 מיליליטר מאגר כביסה. תן למאגר הכביסה להתנקז מהעמוד וסגור את הצד התחתון עם המכסה. מוסיפים שני מיליליטר של חוצץ אלוסיאני ובואו נשב חמש דקות.פתחו את העמוד ואספו את ה-eit, והשאירו אותו על קרח רטוב במידת האפשר. חזור על זה שלוש פעמים נוספות. EIT המכיל ריכוזים גבוהים של חלבון מראה בדרך כלל קצף בעת ניעור כדי להחליף את המאגר ולרכז את החלבון תחילה, יחידות צנטריפוגה אולטרה סינון של 15 מיליליטר עם PBS ב-3000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.השליכו את הזרימה וטענו את ה-EIT על עמודת הסיבוב. מלאו את העמוד בחמישה מיליליטר PBS קר קרח סטרילי לפני שתסתובבו באותם תנאים למשך 60 דקות. שחררו את הזרימה שוב, מלאו מחדש ב -15 מיליליטר PBS קר כקרח וסובבו למשך 60 דקות נוספות.חזור על הליך זה פעם נוספת, ולאחר מכן אסוף את התרכיז המוחלף במאגר המייצג את החלבון הרקומביננטי המרוכז ביותר. שמור על התרכיז על קרח כל הזמן. שוטפים את עמוד הסיבוב עם 400 מיקרוליטר PBS קר קר כקרח סטרילי ומוסיפים אותו לתרכיז.לאחר מכן ניתן לאפיין את החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חלבוני HA ו-NA שבאו לידי ביטוי על ידי זני ENUE ו-Shanghai הראו רמות ביטוי מתונות שנעו בין 0.2 מיליגרם לליטר תרבית עבור שפעת A שנאספה בשנחאי ועד 0.7 מיליגרם לליטר עבור שפעת. מולקולות שנאספו ב-enue, neuraminidase או NA של שני הזנים הראו רמות ביטוי מתונות שנעו בין 0.2 מיליגרם לליטר תרבית עבור שפעת A שנאספה בשנחאי ל-0.7 מיליגרם לליטר עבור שפעת A שנאספה ב-enue.לכל ארבעת תכשירי החלבון היו מעט מאוד זיהומים עם טוהר גבוה יותר מ-nas, מה שניתן להסביר על ידי רמת הביטוי. שפעת A שנאספה בשנחאי HA נותחה עוד באמצעות ELI SA עם הנוגדן החד-שבטי האנושי המנטרל הרחב CR 9 1 1 4. כפי שמוצג כאן בכחול, נוגדן חד שבטי זה נקשר לאפיטופ אישור רגיש בתחום המלאי ומשמש כאן כבדיקה לקיפול נכון של תחום זה.הנוגדן מראה קשירה טובה כפי שמעידה ספיגה מוגברת ב-490 ננומטר, מה שנותן ביטחון שה-HA אכן מקופל כהלכה. שני, אלייזה עם אנטי המגלוטינין מתת-סוג שבע סרום רב-שבטי של עכבר בוצע כדי לאשר את זהות החלבון שהתקבל כהמגלוטינין ממקור תת-סוג שבע. לאחר צפייה בסרטון זה, יש לך הבנה טובה כיצד לבטא נגיף שפעת רקומביננטי, המגלוטינין וחלבוני נויראמינידאז במעבדה שלך.תהליך זה עשוי להיות שימושי גם לביטוי של חלבוני קרום נגיפיים או תאיים אחרים. אני מאחל לך בהצלחה בניסויים שלך.

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מתאר את טכניקת תהודת פלסמון פני השטח, או SPR, לחקר האינטראקציה בין שתי מולקולות באמצעות שבב חיישן. השינוי בזווית התהודה ובעוצמת האור המוחזר מזוהים כפונקציה של אסוציאציה ודיסוציאציה של שתי מולקולות, וזה מספק מידע על יחסי הגומלין בין שתי המולקולות.

תהודה פלסמונית פני השטח לחקר אינטראקציות ביומולקולריות באמצעות שבב חיישן

Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

ב פרוטוקול זה, baculovirus המיוצר על ידי תרביות תאים ארעית של baculovirus פלסמיד לתאים Sf9, הגביר בתרבות ללא סרום ההשעיה. תגובת שיקוע מטוהרת על-ידי הפארין כרומטוגרפיית זיקה, עוד יותר מרוכז על-ידי ultracentrifugation. פרוטוקול זה שימושי עבור ייצור וטיהור של baculovirus עבור יישום טיפול גנטי.

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

שפעת וירוסים (IAVs) הם פתוגנים הנשימה מדבקת הגורמות מגיפה שנתית ומדי פעם גיפות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר זיהומים ויראליים בvivo באמצעות רומן רקומביננטי לוציפראז והבעת הביטוי הדו-כתבת b IAV (בירפעת). גישה זו מספקת לחוקרים כלי מצוין כדי ללמוד IAV ב-vivo.

לוציפראז-כתבת פלורסנט וירוס שפעת עבור הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

כאן אנו מתארים פרוטוקול לאריזת פסאודו-וירוס ולמדידת פעילות נטרול נוגדנים.

הכנת נגיפי שפעת העופות H5 מסוג פסאודו עם שיטת העברת סידן פוספט ומדידת פעילות נטרול נוגדנים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

למד לבטא חלבוני hemagglutinin ו-Neuraminidase פונקציונליים מוירוס H7N9 באמצעות מערכת baculovirus בתאי חרקים. שיטה זו מאפשרת ייצור אנטיגנים מתקפלים כהלכה לניסויים אימונולוגיים ופיתוח חיסונים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

גלה סרטונים נוספים