ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר גליקופרוטאין מטוהר של שפעת, המגלוטינין ונוראמינידאז מקופלים כהלכה לצורך בדיקות אימונולוגיות וניסויי חיסון. זה מושג על ידי שיבוט ראשון של הגנים הנושאים שפעת של BMid רקומביננטי, ולאחר מכן יצירת נגיפי באולה רקומביננטיים. השלב השני הוא להשתמש בנגיפי הבאולה הרקומביננטיים הללו כדי לבטא חלבוני המגלוטינין ונוראמינידאז בתאי חרקים.

לאחר מכן, החלבונים הרקומביננטיים מטוהרים מתרבית התאים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה. השלב האחרון הוא לאפיין את החלבונים הללו כדי להבטיח איכות טובה ופונקציונליות ביולוגית. בסופו של דבר, החלבונים הרקומביננטיים משמשים לחקירת תגובות חיסוניות לגליקופרוטאינים על פני השטח של נגיף השפעת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ביטוי חיידקי של HA אחד, למשל, הוא שהאנטיגנים המטוהרים מקופלים מתקנים ונשארים פעילים גם מבחינה ביולוגית, בניגוד לשימוש בתכשירי וירוס שלם לבדיקות אימונולוגיות. ריאגנטים אלה מאפשרים למדוד תגובות חיסוניות כנגד חלבוני המגלוטינין ושאינם נויראמינידאז. רק התחל פרוטוקול זה עם יצירת נגיף באולה רקומביננטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט העובד באופן אספטי בצלחת מכסה מנוע זרימה למינרית, SF תשעה תאי חרקים בשש לוחות באר בצפיפות של 200,000 תאים לסנטימטר מרובע.

ובואו נשב 20 דקות באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס ללא CO2. לאחר מכן מערבבים שני מיקרוגרם של גב רקומביננטי באמצע עם 100 מיקרוליטר של Trico Leia ברך פורמולה בינונית HINK או TNM fh. לאחר מכן מערבבים שישה מיקרוליטר של חומר הטרנספקציה עם 100 מיקרוליטר של מדיום חרקים TNM FH.

ערבבו את שני הכרכים, ערבבו בעדינות ותנו לתערובת הטרנספקציה לשבת במשך 20 דקות. בטמפרטורת החדר כלול טרנספקציה מדומה אחת כבקרה, המכילה את מגיב הטרנספקציה אך ללא DNA. הסר את ה-SNAT מתשעת תאי ה-SF המצופים והחלף בשני מיליליטר של מדיום TNM FH נטול סרום המכיל תמיסת סטרפטומיצין 1% פניצילין.

הוסף את הנפח המלא של תערובת הטרנספקציה לתאים ונדנד את צלחת שש הבארות בזהירות למשך חמש שניות. דגירה באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס ללא CO2 למשך שש שעות. החלף את המדיה במדיה TNM FH מלאה טרייה לפני הדגירה של הצלחת באותם תנאים למשך שישה ימים.

בדוק את התאים מדי פעם במיקרוסקופ. תאים נגועים בדרך כלל נראים גדולים יותר. לעגולים יש גרעינים מוגדלים ומתחילים להתנתק.

קצור תאים שישה ימים לאחר הטרנספקציה על ידי צנטריפוגה ב -2000 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסופרנטנט מכיל את נגיף הבאולה הרקומביננטי וישמש לייצור מלאי פעיל באופן מיידי, או שניתן לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך שנים. בדוק את ביטוי החלבון באמצעות דף SDS וכתם מערבי והכן את מלאי העבודה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

תאי SF תשעה תומכים היטב בצמיחה של נגיף מקולרי. עם זאת, יכולתם להפריש כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי מוגבלת. לכן אנו משתמשים בקו תאי חרקים אחר.

חמישה תאים גבוהים לביטוי חלבונים רקומביננטיים המופרשים. תאים אלה אינם תומכים בצמיחה של נגיף הבלו לטיטר גבוה, אך יש להם יכולת הפרשה גבוהה מאוד. לגדל חמישה תאים גבוהים במדיום תרבית תאי חרקים SFX במעבר צלוחיות T 175 סנטימטר רבוע כל יומיים.

פיצול ביניהם ביחס של אחד לשלושה. גדל חמש צלוחיות משולבות לתרבית ביטוי של 200 מיליליטר כדי לקצור ולהדביק את חמשת התאים הגבוהים. ראשית, נתק חמישה תאים גבוהים על ידי הקשה על הצלוחיות.

אוספים את תרחיף התאים ומעבירים לצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר. סובב את הצינורות בחום של 1200 גרם למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט על ידי סילוק ואחד את הכדורים על ידי החייאה, והשעיה אותם ב -15 מיליליטר של מלאי P שלוש.

הניחו לתאים לשבת במשך 15 דקות במכסה המנוע. העבירו 200 מיליליטר של מדיום תרבית SFX משובט גבוה לבקבוק שייקר סטרילי נקי של 1000 מיליליטר. לאחר מכן העבירו את מתלה ה-P בעל שלושה תאים לאטם בקבוק השייקר עם רדיד אלומיניום סטרילי לפני ניעור ב-70 סל"ד ו-28 מעלות צלזיוס למשך 72 עד 96 שעות.

לקצור חלבון רקומביננטי מסופרנטנטים בעלי ביטוי גבוה של חמישה תאים ב-72 עד 96 שעות לאחר ההדבקה. העבירו את חומרי העל של התרבות לדלי צנטריפוגה של 500 מיליליטר. סובב בחום של 5, 500 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בינתיים יש לשטוף את בקבוק השייקר שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים. הפיפטה הבאה. שלושה מיליליטר של תמיסת שרף ניקל לתוך צינור של 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר PBS לכל 200 מיליליטר תרבית.

יש לנער היטב לפני הסיבוב במשך 10 דקות בחום של 3000 גרם ובטמפרטורת החדר לאחר צנטריפוגה. רוקנים את ה-PBS ושומרים את הגלולה. מערבבים את תאי החרקים עם כדור שרף הניקל ומעבירים לצלוחיות השייקר שכבר שטופות.

דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות תוך כדי טלטול. לאחר מכן, הרכיב עמוד פוליפרופילן של 10 מיליליטר על מהדק למעמד תמיכה. הסר את שני המכסים והניח מתחת לעמוד כדי לאסוף את הזרימה.

לאחר הדגירה של בקבוק השייקר, התחל להעביר את תערובת התרחיץ הסופרנטנטי על העמוד. הוא ישמור על שרף הניקל ורק הסופרנטנט יזרום דרכו. העבירו את כל הכרך על העמודה.

שוטפים את השרף ארבע פעמים עם 15 מיליליטר מאגר כביסה. תן למאגר הכביסה להתנקז מהעמוד וסגור את הצד התחתון עם המכסה. מוסיפים שני מיליליטר של חוצץ אלוסיאני ובואו נשב חמש דקות.

פתחו את העמוד ואספו את ה-eit, והשאירו אותו על קרח רטוב במידת האפשר. חזור על זה שלוש פעמים נוספות. EIT המכיל ריכוזים גבוהים של חלבון מראה בדרך כלל קצף בעת ניעור כדי להחליף את המאגר ולרכז את החלבון תחילה, יחידות צנטריפוגה אולטרה סינון של 15 מיליליטר עם PBS ב-3000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

השליכו את הזרימה וטענו את ה-EIT על עמודת הסיבוב. מלאו את העמוד בחמישה מיליליטר PBS קר קרח סטרילי לפני שתסתובבו באותם תנאים למשך 60 דקות. שחררו את הזרימה שוב, מלאו מחדש ב -15 מיליליטר PBS קר כקרח וסובבו למשך 60 דקות נוספות.

חזור על הליך זה פעם נוספת, ולאחר מכן אסוף את התרכיז המוחלף במאגר המייצג את החלבון הרקומביננטי המרוכז ביותר. שמור על התרכיז על קרח כל הזמן. שוטפים את עמוד הסיבוב עם 400 מיקרוליטר PBS קר קר כקרח סטרילי ומוסיפים אותו לתרכיז.

לאחר מכן ניתן לאפיין את החלבון כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חלבוני HA ו-NA שבאו לידי ביטוי על ידי זני ENUE ו-Shanghai הראו רמות ביטוי מתונות שנעו בין 0.2 מיליגרם לליטר תרבית עבור שפעת A שנאספה בשנחאי ועד 0.7 מיליגרם לליטר עבור שפעת. מולקולות שנאספו ב-enue, neuraminidase או NA של שני הזנים הראו רמות ביטוי מתונות שנעו בין 0.2 מיליגרם לליטר תרבית עבור שפעת A שנאספה בשנחאי ל-0.7 מיליגרם לליטר עבור שפעת A שנאספה ב-enue.

לכל ארבעת תכשירי החלבון היו מעט מאוד זיהומים עם טוהר גבוה יותר מ-nas, מה שניתן להסביר על ידי רמת הביטוי. שפעת A שנאספה בשנחאי HA נותחה עוד באמצעות ELI SA עם הנוגדן החד-שבטי האנושי המנטרל הרחב CR 9 1 1 4. כפי שמוצג כאן בכחול, נוגדן חד שבטי זה נקשר לאפיטופ אישור רגיש בתחום המלאי ומשמש כאן כבדיקה לקיפול נכון של תחום זה.

הנוגדן מראה קשירה טובה כפי שמעידה ספיגה מוגברת ב-490 ננומטר, מה שנותן ביטחון שה-HA אכן מקופל כהלכה. שני, אלייזה עם אנטי המגלוטינין מתת-סוג שבע סרום רב-שבטי של עכבר בוצע כדי לאשר את זהות החלבון שהתקבל כהמגלוטינין ממקור תת-סוג שבע. לאחר צפייה בסרטון זה, יש לך הבנה טובה כיצד לבטא נגיף שפעת רקומביננטי, המגלוטינין וחלבוני נויראמינידאז במעבדה שלך.

תהליך זה עשוי להיות שימושי גם לביטוי של חלבוני קרום נגיפיים או תאיים אחרים. אני מאחל לך בהצלחה בניסויים שלך.