ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשחזר RNA באיכות גבוהה מנוירונים מוטוריים של חוט השדרה ללא זיהום על ידי RNA מתאים שכנים. זה מושג על ידי שחזור, חלוקה והטמעה ראשונית של הכבל במדיום הטבעה קריו והקפאה בטמפרטורה שלילית של 160 מעלות צלזיוס. השלב השני הוא לחתוך את הכבל על קרום העט בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השקופיות נשטפות ב-70% אתנול ומוכתמות ב-Azure B ב-70% אתנול. השלב האחרון הוא לכידת לייזר מיקרו דיסקציה של גופי תאי נוירונים מוטוריים מזוהים לתוך מאגר ליזה של גינה תיוציאנט. בסופו של דבר, סך ה-RNA מוכן מהליזטים המשולבים ונבדק כדי לחשוף הבדלים בשעתוק RNA כללי או ספציפי בתאי עצב של בעלי חיים מוטנטיים לעומת חיות בר.

מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר מאפשרת התאוששות של גופי תאי נוירונים מוטוריים מקטעי חוט השדרה ללא זיהום על ידי סקאליה וסוגי תאים אחרים. מתן הזדמנות להכין RNA ולהשוות שעתוק בין נוירונים מחיה חולה לחיה רגילה. ההיבט הקשה ביותר בפיתוח הליך זה היה מציאת שיטת צביעה שתאפשר לנו לזהות נוירונים מוטוריים בקטעי חוט השדרה תוך שמירה על רמות גבוהות של שלמות RNA ויכולת מיצוי, הן לפני והן במהלך לכידת לייזר.

מצאנו כי קטעי צביעה בתכלת B ו-70% אתנול עמדו בקריטריונים אלה בשילוב עם איסוף גופי התאים המנותחים ישירות לתוך מאגר הליזיס של גינה תיוציאנט המדגים את ההליך הוא ואן פאדיה, פוסט-דוקטורנט במעבדתנו לקבלת התוצאות הטובות ביותר. ודא שכל הציוד מנוקה עם תמיסת טיהור RNA ואחריה אתנול 70% ללא RNA לאחר המתת חסד וזלוף טרנס קרדיאלי בודד בזהירות את חוט השדרה. שטפו את הכבל למשך 10 שניות ב-RNA.

מים חופשיים כדי לשטוף את כל שאריות הדם ולהניח אותם על מגלשת זכוכית נטולת RNA בעדינות רבה אך במהירות. לאחר מכן, חלקו את חוט השדרה לרוחב בעזרת סכין גילוח נקי לתשע עד 10 חלקים. מקם את החלקים בתבנית קריו מלאה ב-OCT ויישר אותם אנכית באמצעות מחט נקייה.

מניחים את התבנית במגש רדוד המכיל שני מתיל בוטאן מצננים מראש עם חנקן נוזלי. כדי למנוע פירוק RNA, הנח את המגש באמבט חנקן נוזלי. כדי להקפיא במהירות את חלקי חוט השדרה.

אחסן את הבלוק המוטבע OCT בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שישה חודשים לפני החיתוך. כאשר הוא מוכן למצב חתך, ה-OCT הטמיע בלוק בקריוסטט מקורר. מייצרים פרוסות של 20 מיקרון שכל אחת מכילה תשעה עד 10 חתכים של חוט השדרה.

הנח את החלקים על קרום העט החופשי של RNA. שתי שקופיות מיקרון נשמרו בתחילה בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שהחלקים יידבקו. ובכן, הקפיאו מיד את החלק על משטח שלילי של 20 מעלות צלזיוס בתוך הקריוסטט.

שמור את השקופיות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש בטווח מתלים נקי. שישה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר מלאים ב-RNA ללא אתנול 70%. העומק צריך להיות מספיק כדי לכסות את כל החלקים במגלשה כאשר המגלשה שקועה.

במקום הבא פתרון 1% Azure B באותו ארון תקשורת. כדי למזער את הזמן בין החלפת תמיסות במהלך כביסה או צביעה, שמור שלושה או ארבעה מגבוני מעבדה מול המתלה כדי לנקז תמיסה נוספת במהירות. כשהוא מוכן, הוציאו את השקופיות מהמקפיא השלילי של 80 מעלות צלזיוס והניחו אותן על קרח יבש והפשירו שקופית אחת על ידי הנחתה על כף יד עטויה כפפה.

הסר את רוב הלחות והעיבוי על המגלשה על ידי ניגובה במגבון מעבדה, היזהר לא לגעת בחלקים. שים את השקופית על חומר ייבוש סיליקה ג'ל טרי בצלחת פטרי למשך 30 עד 40 שניות לייבוש מלא. כשהוא יבש, טבלו את השקופית בצינור הראשון של RNAs, שחררו 70% אתנול.

השרו את השקופית למשך 30 שניות ולאחר מכן שטפו את ה-OCT על ידי טבילה למעלה ולמטה למשך 45 שניות עד דקה. לאחר מכן, הוציאו את השקופית מהתמיסה ורוקנו את עודפי הנוזלים על מגבוני מעבדה. חזור על תהליך זה על ידי טבילת השקופית בצינור השני של 70% אתנול.

אם OCT נשאר סביב חלקי חוט השדרה, חזור על השטיפה בצינור השלישי. לאחר ניקוז עודפי הנוזל, טבלו את השקופית בתמיסה של 1% Azure B ב-70% RNAs, שחררו אתנול למשך 30 עד 45 שניות. רוקנו את עודפי Azure B במגבון מעבדה.

בשלב זה, השקופית כולה תהיה כחולה. טבלו את השקופית בצינור הבא של אתנול 70% וטבלו למעלה ולמטה במהירות, שלוש עד ארבע פעמים כדי להסיר עודפי צבע וכדי להפוך את צביעת הנוירון המוטורי הספציפי לגלויה. אם החלקים נראים מוכתמים כהים מאוד, חזור על שלב הצביעה בצינור טרי של 70% אתנול.

אם הצביעה נראית בהירה מדי, החזר את השקופית לתמיסת Azure B למשך 32 שנה נוספת וחזור על הצביעה. אם הצביעה משביעת רצון, אפשר לשקופית להתייבש באוויר לזמן קצר והמשך לשלב הבא. אחרי צביעה וייבוש של DES, החומר האפור יהיה כחול בהיר, ותאי העצב המוטוריים המוכתמים בכחול עמוק יהיו גלויים בקלות.

התחל את הדיסקציה מיד לאחר הפעלת המיקרוסקופ. שחרר את מחזיק הצינור כדי לחבר את המכסה של צינור מיקרו פוגה 0.6 מילימטר. לאיסוף דגימות, הכניסו 30 מיקרוליטר של מאגר ליזה גיני ותיוציאנט לתוך המכסה וכסו את פני השטח על ידי פיזור התמיסה.

בעזרת קצה פיפטה, יישר את הכובע עם החור והמטרה. כאשר תוכנת המיקרוסקופ נשחקת, שמור את הכובע במצב מכוסה עד לתחילת לכידת הלייזר. הנח את המגלשה המיובשת באוויר הפוכה על הבמה של המיקרוסקופ כך שצד הממברנה פונה כלפי מטה והחלק מיושר עם החור.

כשהמגלשה במקומה, התמקד בקטע חוט השדרה עם המטרה חמש x ולאחר מכן עבור למטרה של 20x לדיסקציה. ראשית, סמן אזור דמה עם עט האור ואפשר ללייזר לחתוך אותו מבלי לאסוף אותו. זה מרגיע את הממברנה ומאפשר לסמן ולחתוך מספר אזורים ברצף.

לאחר מכן, התמקדו מחדש וזהו נוירונים מוטוריים באזור קרן הגחון. נוירונים אלה ניתנים לזיהוי על ידי מיקומם מורפולוגיה פרמלית, גודל גדול וצביעה כחולה כהה עם Azure B.בעזרת העט הבהיר, בחר את כלי הציור וסמן לאורך קצה הנוירונים המוטוריים תוך יצירת מתאר שלם. נסו להפוך את המתאר קרוב ככל האפשר לנוירון המוטורי כדי למנוע זיהום מתאים אחרים.

ניתן לסמן מספר תאים לפני החיתוך מכיוון שהתוכנה תזכור את המיקומים כאשר היא מוכנה לחתוך, תביא את המכסה מתחת למיקום החיתוך ותלחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל דיסקציה של נוירונים מוטוריים עם הלייזר. אסוף את כל הנוירונים המוטוריים מכל החלקים בשקופית אחת לתוך המכסה של צינור מיקרו פוגה אחד. לאחר השלמת האיסוף, הוצא את צינור המיקרו פוגה מהמחזיק על ידי פריקת המגש ועקירת הצינור בעדינות ממיס לחלוטין את הנוירונים המוטוריים והחוצץ על ידי פיפטינג התמיסה למעלה ולמטה.

העבירו את התמיסה לגוף הצינור על ידי צנטריפוגה, הקפיאו את הדגימה מיד בקרח יבש ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לאחר צביעה בתכלת B.הנוירונים המוטוריים מופיעים כגופי תאים גדולים מוכתמים כהה. הם מאושרים על ידי נוגדנים נגד CHATT, מכתימים ומתמיינים בקלות מתאים שכנים קטנים יותר. בדוגמה זו, גופי תאי הנוירונים המוטוריים תוארו בעט האור וממוספרים על ידי התוכנה.

כאן גופי התאים נחתכו עם הלייזר והוטלו לתוך צינור האיסוף כשקווי המתאר כבויים. היקף נזקי הלייזר לאזורים שכנים ניכר. תוצאות אופייניות של ניתוח אלקטרופורטי של שלמות ה-RNA של דגימה מכ-4,000 גופי תאי נוירונים מוטוריים של עכברים שנאספו על ידי LMD מוצגות כאן.

שימו לב לפסגות ה-RNA הריבוזומליות הבולטות. תהליך זה מצביעת שקופיות דרך דיסקציה של נוירונים מוטוריים צריך להסתיים תוך 30 דקות עבור כל החלקים בשקופית אחת כדי למזער את פירוק ה-RNA. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לעבוד מהר ככל האפשר, הן בדיסקציה הראשונית ובהטמעה של החוט, כמו גם בשלבים האחרונים של צביעה ולכידת לייזר של הנוירונים המוטוריים.