ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק RNA באיכות גבוהה מנוירונים מוטוריים של חוט השדרה ללא זיהום של RNA מתאים לתאים שכנים. זאת על ידי הפקה, חלוקה והטמעה של חוט השדרה במצע להטמעה בהקפאה (cryo embedding medium) והקפאה בטמפרטורה של 160- מעלות צלזיוס. השלב השני הוא ביצוע חיתוך בהקפאה (cryo section) של חוט השדרה על שקופיות עם ממברנת Pen בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

בשלב הבא, שוטפים את השקופיות ב-70% ethanol וצובעים אותן ב-Azure B ב-70% ethanol. השלב הסופי הוא ביצוע מיקרו-דיסקציה באמצעות לייזר (laser capture micro dissection) של גופי התאים של נוירונים מוטוריים שזוהו, אל תוך תמיסת ליזיס של guine thiocyanate. לבסוף, מכינים RNA כולל מהליזאטים המשולבים ובודקים אותו כדי לחשוף הבדלים בשעתוק RNA כללי או ספציפי בנוירונים של חיות מוטנטיות לעומת חיות מסוג פרא (wild type).

מיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (Laser capture microdissection) מאפשרת השגת גופי תאי של נוירונים מוטוריים מחתכי חוט השדרה ללא זיהום על ידי תאי גליא (glia) ושסוגי תאים אחרים הנמצאים במספר רב יותר. דבר זה מאפשר להכין RNA ולהשוות בין התעתוק בנוירונים מבעל חיים חולה לבין נוירונים מבעל חיים בריא. ההיבט המאתגר ביותר בפיתוח פרוצדורה זו היה מציאת שיטת צביעה שתאפשר לנו לזהות נוירונים מוטוריים בחתכי חוט השדרה, תוך שמירה על רמות גבוהות של שלמות ה-RNA ויכולת המיצוי שלו, הן לפני הלכידה בלייזר והן במהלכה.

מצאנו שצביעת חתכים ב-Azure B וב-70% ethanol עמדה בקריטריונים אלו כאשר היא שולבה עם איסוף של גופי התאים שבוצלו ישירות לתוך Guanidine Thiocyanate lysis Buffer, מה שהוכיח כי הפרוצדורה היא יעילה. ואן פאדיה, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו, ממליץ לתוצאות מיטביות לוודא שכל הציוד נוקה עם תמיסה לדה-קונטמינציה של RNA, ולאחריה 70% ethanol נקי מ-RNA. לאחר ההדרה והפרפוזייה הטרנס-קרדיאלית, בודד בזהירות את חוט השדרה. שטוף את חוט השדרה למשך 10 שניות ב-RNAs.

שטפו במים כדי להסיר שאריות דם והניחו את הרקמה על שקופית זכוכית נקייה מ-RNases בעדינות רבה אך במהירות. לאחר מכן, חלקו את חבל השדרה לרוחב בעזרת להב תער נקי לתשעה עד עשרה חלקים. מקמו את החלקים בתוך תבנית הקפאה (cryo mold) מלאה ב-OCT וסדרו אותם בצורה אנכית באמצעות מחט נקייה.

הנח את התבנית במגש רדוד המכיל methyl butane שקולל מראש בחנקן נוזלי. כדי למנוע פירוק של RNA, הנח את המגש באמבט חנקן נוזלי, על מנת להקפיא במהירות את חלקי חוט השדרה.

יש לאחסן את הבלוק הטבול ב-OCT בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים לפני החיתוך. כאשר הבלוק מוכן לחיתוך, יש להניח אותו בתוך קריוסטט מקורר. יש להכין חתכים בעובי של 20 מיקרון, כאשר כל חתך מכיל תשעה עד 10 חתכים רוחביים של חוט השדרה.

הנח את החתכים על ממברנה ללא RNA. השאר את זכוכיות המיקרון בטמפרטורת החדר בתחילה כדי להבטיח שהחתכים יידבקו. מיד לאחר מכן, הקפא מחדש את החתך על משטח של 20- מעלות צלזיוס בתוך הקריוסטט.

שמרו את השקופיות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשימוש על גבי מתקן נקי. שישה מבחנות קוניות של 50 מיליליטר מלאות באתנול 70% נטול RNase. העומק צריך להיות מספיק כדי לכסות את כל החתכים על השקופית כאשר השקופית טבולה.

בשלב הבא, הניחו תמיסת Azure B בריכוז 1% על אותו מתקן. כדי למזער את הזמן בין החלפת התמיסות במהלך השטיפה או הצביעה, החזיקו שלושה או ארבעה ניגוני מעבדה לפני המתקן כדי לנקז תמיסה עודפת במהירות. כאשר תהיו מוכנים, הוציאו את השקופיות מהמקפיא בטמפרטורה של 80- °C והניחו אותן על קרח יבש; הפשירה כל שקופית על ידי הנחתה על כף יד עם כפפה.

הסר את רוב הלחות והעיבוי מהסלייד על ידי ניגוב עם נייר ניגוב למעבדה, תוך הקפדה לא לגעת בחתכים. הנח את הסלייד על חומר מייבש מסוג silica gel טרי בתוך צלחת פטרי למשך 30 עד 40 שניות לייבוש מלא. לאחר הייבוש, טבול את הסלייד במבחנה הראשונה של ethanol 70% נקי, נטול RNA.

השרו את השקופית למשך 30 שניות ולאחר מכן שטפו את ה-OCT על ידי טבילה למעלה ולמטה במשך 45 שניות עד דקה אחת. לאחר מכן, הוציאו את השקופית מהתמיסה וסננו את עודפי הנוזל על נייר סופג למעבדה. חזרו על תהליך זה על ידי טבילת השקופית במבחנה השנייה של 70% ethanol.

אם נשאר OCT סביב חתכי חוט השדרה, חזרו על השטיפה בשפופרת השלישית. לאחר ניקוז עודפי הנוזל, טבלו את השקופית בתמיסת Azure B בריכוז 1% באתנול 70% נקי מ-RNAs, למשך 30 עד 45 שניות. נקו את עודפי ה-Azure B באמצעות נייר סופג למעבדה.

בשלב זה, כל השקף יהיה כחול. טבלו את השקף במבחנה הבאה המכילה 70% ethanol והניפו אותו למעלה ולמטה במהירות, שלוש עד ארבע פעמים, כדי להסיר עודפי צבע ולהפוך את הצביעה הספציפית של הנוירונים המוטוריים לנראית. אם הפרוסות נראות צבועות כהה מאוד, חזרו על שלב הסרת הצביעה במבחנה רעננה של 70% ethanol.

אם הצביעה נראית בהירה מדי, החזירו את השקופית לתמיסת ה-Azure B למשך 32 שניות נוספות וחזרו על צביעת ה-DES. אם הצביעה משביעה רצון, הניחו לשקופית להתייבש קצרה באוויר והמשיכו לשלב הבא. לאחר צביעת ה-DES והייבוש, החומר האפור יהיה בצבע כחול בהיר והנוירונים המוטוריים שנצבעו בכחול כהה יהיו גלים למשקל.

התחילו את הנתיחה מיד לאחר הפעלת המיקרוסקופ. שחררו את מחזיק הפרובה כדי להצמיד את המכסה של פרובת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.6 מילימטר. לצורך איסוף הדגימה, הכניסו 30 µL של guanidine and thiocyanate lysis buffer לתוך המכסה וכסו את פני השטח על ידי פריסת התמיסה.

בעזרת טיפ של פיפטה, יישרו את המכסה עם החור והעדשה. באמצעות תוכנת המיקרוסקופ, השאירו את המכסה במצב סגור עד לתחילת הלכידה בלייזר. הניחו את השקופית המיובשת באוויר בצורה הפוכה על במה של המיקרוסקופ, כך שצד הממברנה פונה כלפי מטה והחתך מיושר עם החור.

כאשר הזריקה במקומה, התמקדו בחתך של חוט השדרה באמצעות עדשה של 5x ולאחר מכן עברו לעדשה של 20x לצורך הדיסקציה. ראשית, סמנו אזור דמי באמצעות עט האור והניחו ללייזר לחתוך אותו מבלי לאסוף אותו. פעולה זו משחררת את הממברנה ומאפשרת לסמן ולחתוך מספר אזורים באופן רצף.

בשלב הבא, התמקדו מחדש וזהו את הנוירונים המוטוריים באזור הקרן הבנטראלית (ventral horn). ניתן לזהות נוירונים אלו לפי מיקומם, המורפולוגיה שלהם, גודלם הגדול והצביעה הכחולה כהה עם Azure B. באמצעות עט האור, בחרו בכלי השרטוט וסמנו את השוליים של הנוירונים המוטוריים תוך יצירת קווי מתאר מלאים. השתדלו ליצור את קווי המתאר קרובים ככל האפשר לנוירון המוטורי כדי למנוע זיהום מתאים לתאים אחרים.

ניתן לסמן תאים מרובים לפני החיתוך, כיוון שהתוכנה תזכור את המיקומים; כאשר תהיו מוכנים לחיתוך, העבירו את המכסה אל מתחת למיקום החיתוך ולחצו על כפתור ההפעלה (start) כדי להתחיל את הדיסקציה של נוירוני המוטוריקה באמצעות הלייזר. אספו את כל נוירוני המוטוריקה מכל החתכים על גבי שקף אחד אל תוך המכסה של מבחנת מיקרו-צנטריפוגה אחת. לאחר השלמת האיסוף, הוציאו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה מהמחזיק על ידי פריקת המגש והוצאה עדינה של המבחנה, והמיסו לחלוטין את נוירוני המוטוריקה והבופר באמצעות פיפוט של התמיסה למעלה ולמטה.

העבירו את התמיסה לגוף המבחנה באמצעות סרכוז, הקפיאו את הדגימה באופן מיידי בקרח יבש ואחסנו אותה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לאחר צביעה ב-Azure B. הנוירונים המוטוריים מופיעים כגופי תא גדולים שנצבעו כהה. זיהוים מאושר באמצעות צביעה בנוגדני anti CHATT, והם מובחנים בקלות מתאים שכנות קטנים יותר. בדוגמה זו, גופי התא של הנוירונים המוטוריים סומנו באמצעות עט אור והמספרים הוקצו להם על ידי התוכנה.

כאן גופי התאים הוצאו באמצעות הלייזר ונפלו אל שפופרת האיסוף כאשר קווי המתאר כבויים. ניתן לראות את היקף נזקי הלייזר באזורים השכנים. מוצגים כאן תוצאות טיפוסיות של אנליזה אלקטרופורטית של שלמות ה-RNA מדגימה של כ-4,000 גופי תאי נוירונים מוטוריים של עכבר שנאספו ב-LMD.

שימו לב לשיאים הבולטים של ה-ribosomal RNA. תהליך זה, החל מצביעת הנסקיים ועד לדיסקציה של הנוירונים המוטוריים, צריך להסתיים תוך 30 דקות עבור כל החתכים על נסקייה אחת, וזאת כדי לצמצם את פירוק ה-RNA. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד במהירות רבה ככל האפשר, הן בדיסקציה הראשונית ובטמינת השפיכה, והן בשלבי הצביעה הסופיים ובמיקרודיסקציה באמצעות לייזר (laser capture microdissection) של הנוירונים המוטוריים.