ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את הדינמיקה של גרגירי ריבונוקלאופרוטאין בתאים ראשוניים, במיוחד היווצרות גרגירי לחץ. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של תאים כמו עכבר, עוברי, פיברובלסטים או נוירונים בהיפוקמפוס מחיות מעניינות. כשלב שני, רכיב מתויג של גרגירי המתח עובר טרנספטציה כדי לאפשר הדמיה שלהם.

לאחר מכן, התאים מושרים על ידי מתח ומנוטרים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse. התוצאות שהתקבלו מראות את הדינמיקה של G שלושה BP אחד המכיל גרגירי מתח במיתוסים או נוירוני מראה והיפוקמפוס על סמך ההדמיה הישירה שלהם. שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תגובת עקה בתאים כמו נוירונים.

לדוגמה, בעכברים, הפלת RNA, איסור על חלבונים החיוניים לגרגירי לחץ, נמצאו פגמים עצביים. אז השיטה הזו יכולה לעזור להבין את המנגנונים שמאחורי התצפיות האלה. לאחר המתת חסד של עכבר בהריון E 13.5, יש לחטא את העכבר עם אתנול 90% ולהסיר את קרני הרחם מתחת למכסה מנוע סטרילי.

העבירו את הקרניים ל-37 מעלות צלזיוס DPBS והוציאו את העוברים. מעבירים את העוברים לתבנית של 100 מילימטר. הסר את עודפי הטישו ושטוף אותם עם DPBS חם.

כעת תחת מיקרוסקופ, הסר את הגפיים, האיברים הפנימיים והחלק העליון של הראש המכיל את המוח. ניתן להשתמש בקטעי הזנב או הראש לגנוטיפ. טוחנים את שאר הרקמות בכלי נפרד למשך דקה לפחות.

אין לשלב גנוטיפים אם הם אמורים להשתנות בתוך המלטה. מכסים את רקמת הטחון בטריפסין EDTA אחד ודוגרים אותה למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיום mes שלם.

כדי לעצור את התגובה, שחרר את הרקמה בעזרת פיפטה והעביר את המתלה שנוצר לצינור של 50 מיליליטר. מלאו את הצינור במדיום והניחו לתוכן להתייצב. לאחר מכן הוציא את התאים התלויים.

לאחר מכן, סובב את המתלה ב-300 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, ראוס, השעו את הגלולה בשישה מיליליטר של מדיום שלם לכל עובר. ספירה של תאים גרעיניים ברי קיימא צריכה להיות בסביבות 5 מיליון לעובר.

לאחר מכן טען צלחות של 60 מילימטר עם שלושה מיליליטר של מתלה תאים ותרבות. אותם. החלף את המדיה למחרת ואפשר לתאים לגדול לשטף. כאשר התאים עוברים תת-תרבית, רק פיברובלסטים ישרדו.

מפצלים את הלוחות המתכנסים לזכוכית של 35 מילימטר. כלים תחתונים. גדל את המנות הללו לשטף של בין 50 ל -70% והמשך עם הטרנספקציה.

לכל מנה של 35 מילימטר, יש שלושה מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר לטרנספקציה. שימוש בערכת טרנספקציה זמינה מסחרית יספיק. בדוגמה זו, וקטור המבטא את פער ה-RA.

חלבון קושר תלת תחומיים SSH עובר טרנספטציה. זהו מרכיב חשוב בגרגירי לחץ. הנוהל ישים כמובן לחקר כל וקטור מעניין בפיברובלסטים יום לפני קצירת הגור.

הכינו את הכלים המצופים ליזין פאולין התחילו באיסוף עוברים מסכרי 18.5 DPC והעברתם ל-HBSS בצלחת גדולה. אם תרצה, ניתן להחליף גורים יילודים כדי למנוע את הקרבת האם. חותכים את הראש ומסירים את המוח.

לאחר מכן קצרו את מוח הגור לכלי נקי עם HBSS תחת מיקרוסקופ. הסר את כל קרומי המוח בעזרת מלקחיים עדינים. לאחר מכן הפרד את החלקים הרצויים במוח כמו היפופוטם קמפי.

העבירו את הרקמות ל-4.5 מיליליטר של HPSS קר בצינורות של 15 מיליליטר ושמרו אותן על קרח. עכל את הרקמות על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין של 2.5%. דגרו אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות.

לאחר מכן שטפו את הטריפסין בשלוש שטיפות של HBSS והקפידו לא לאבד שום רקמה. כעת השעו מחדש את הרקמות בחצי עד מיליליטר אחד של DMM עם 10% FBS. לאחר מכן הומוגניזציה של הרקמה על ידי הזרמתה דרך הפיפטה.

לאחר מכן עברו לקצה של 200 מיקרוליטר ופיפטו את התמיסה עד שאין אגרגטים גלויים. לאחר מכן, הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר של מתלה התא לזכוכית של 35 מילימטר כלים תחתונים שהוכנו עם מדיה DMM FBS דוגרים על הכלים. לאחר שלוש שעות של תרבית, החלף את המדיה במדיה שלמה של נוירון מחמם למשך זמן התרבית שנותר.

לאחר חמישה עד 14 ימים בתרבית, העבירו את הנוירונים בשיטת סידן פוספט. 24 שעות לאחר טרנספקציה מוצלחת, גרגירי מתח יתחילו להרכיב עקב ביטוי יתר של G שלוש BP. מתח נוסף יגרום עוד יותר להרכבת גרגירי מתח, יחמם מראש את רכיבי המיקרוסקופ הקונפוקלי למשך 20 דקות לפחות, כולל חימום הבמה ל-37 מעלות צלזיוס.

נדרש מחזיק צלחת 35 מילימטר רגע לפני הדמיית התאים. בצע את הפעולות הבאות. ראשית, החלף כל מדיום תאים המכיל פנול אדום באחד ללא פנול אדום.

התחל מיד לדמות את התאים. גרגירי מתח ייווצרו תוך פחות משעה, כך שמתח יושרה לאחר הדמיה של התאים. חשוב להתחיל את הרכישות בהקדם האפשרי לאחר השראת הלחץ, ולהתאים במדויק שני פרמטרים בהתאם לסוג התא ולסוג החלבון שלך.

עוצמת הלייזר ומשך הרכישות נמוכים משניהם כדי להפחית ציטוטוקסיות. לאחר מכן, הצג את התאים עם יעד טבילת שמן של 40 x ו-63. ודא שהצלחת שטוחה במחזיק והשתמש באור הפלורסנט בצורה מינימלית.

לאחר איתור שדה עניין, השתמש בתוכנה כדי לרכוש תמונות. התחל עם עוצמת הלייזר ב-10% או פחות, והגדר את הרווח וההיסט כדי להשיג את יחס האות לרעש הטוב ביותר האפשרי. סרוק ב-1000 הרץ כדי למזער את חשיפת התאים לערימת המחלה של ערכת הלייזר כרצונך, ולשמור על מרווח הסריקה ארוך ככל האפשר כדי לשמור טוב יותר על בריאות התרבית.

רכוש נתונים כל עוד יש צורך בגרגירי MEFs נוצרים תוך 10 דקות ונראים בבירור תוך שעה. בתאי עצב, התהליך מתויג מעט לאט יותר. G שלוש BP אמור לספק אות חזק למדי למשך 45 דקות לפחות באמצעות הטכניקות המתוארות.

היווצרות גרגירי מתח נוטרה בתאים מתורבתים. הלוקליזציה של החלבון המתויג G three BP הייתה מפוזרת במיתוסים של תרבית הציטופלזמה, וגם מפוזרת בציטופלזמה של נוירונים. בטיפול בארסוניט, החלבונים מתמקמים בבירור למוקדים מוגדרים וגדולים יותר בכל אחד מסוגי התאים.

אלה הם גרגירי הלחץ. ניתן לשחזר את התמונות שצולמו לסרט דולג זמן. הסרטון הראשון והשני מראים פיברובלסטים מגיבים לסטרס.

הסרטון השלישי מראה את אותו הדבר. בתא עצב בהיפוקמפוס, שחזורי זאק מציעים לוקליזציה תלת מימדית של ה-G המתויג שלוש B bp ובכך נקודת מבט שונה על מעקב. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בכימיה של ציטו חיסוני כדי לדמיין את רכיבי הגרגיר לאחר סוג אחר של לחץ ולאחר קיבוע עצמי.

זה יכול לענות על שאלות כמותיות לגבי הגודל והמספר של הגופים התאיים השונים בתנאים שונים.