Name: העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: למד את שיטת העברת עוברים דרך מחבר הרחם-חצוצרה בעכברים לשימור שרידות עוברים טרום-השתלה. טכניקה זו מונעת דימום ובריחת עוברים ומאפשרת הערכת הצלחה לפי מספר הגורים הנולדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמחלקה למדעי בעלי חיים ועופות לBT.

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים פינת Beltsville והשימוש Comittees (BAACUC 11-015) בהתאם משרד החקלאות טיפול בבעלי חיים ושימוש בהנחיות. 1. הרדמה ושיכוך כאבים (משותף לשני פרוצדורות כירורגיות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר ולטעון את חומרי ההרדמה ומשככי כאבים הבאים בשני מזרקים 1 מיליליטר עם 27 מחטי G: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטמין (0.1 מ&quot;ג / גר &#39;: 0.01 מיליליטר / גרם של פתרון 10 מ&quot;ג / מיליליטר) ו xylazine (0.01 מ&quot;ג / גר&#39;: 0.005 מיליליטר / גרם של פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצירות (0.1 מיקרוגרם / g: 0.01 מיליליטר של פתרון 0.01 מ&quot;ג / מיליליטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את העכבר על ידי להרים את העורף שלה קרוב ללסתות ככל האפשר עם האגודל ואצבע מורה ומחזיק את הזנב בין האצבעות הקטנות וטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק תערובת קטמין-Xylazine intraperitoneally. על מנת להימנע מניקוב איברים פנימיים, להחזיק את העכבר עםראשו מעט מתחת לרמה של ירכיה (איור 1 א) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק תת עורי עצירות בעורפו של צוואר אחיזה בין האגודל ואצבע המורה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את העכבר בכלוב (הנקי וללא כל בעל חיים אחרים) על במה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שלא מודע, לבדוק על היעדריו של רפלקס האחורי ברגל (נבדק על ידי קמצוץ הבוהן). החל משחה העין כדי למנוע יובש בעיניים ולבדוק על היעדריו של רפלקס palpebral (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מספק מטוס כירורגית בהרדמה למינימום של 30 דקות, מספיק כדי לבצע את ההליכים המתוארים להלן (פרוטוקולים 2 ו -3). אם פעמים יותר נדרשות, זריקה נוספת של קטמין + xylazine עם מחצית מהמינון שתואר ב1.1.1 יכולה להיות מיושמת לאחר 30 דקות. שינוי בדפוס נשימה לאחד מהיר ולא סדיר מצביע על loss של מטוס ההרדמה המתאים. </li></ol> 2. ניתוח עיקור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגברים עם ביצועי הזדווגות מוכחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח, לנקות את המשטחים שבו ניתוח יבוצע ולנגב אותם עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הרדמה כמפורט לעיל (פרוטוקול 1), בדיקה לאובדן הרפלקסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על במה חמה, להסיר את פרווה עם קוצץ חשמלי מאזור הגחון בין שני קווים רוחביים דמיוניים להציב 0.5 סנטימטר ו2.5 ס&quot;מ מעל הפין (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את האזור המגולח ידי ניגוב רציף עם 10% יוד povidone ו70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה עם הזנב לכיוון המנתח ומכסה במגבת סטרילית עם חור חושף את האזור המגולח. להאיר את אזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע incisio עור אורך 10-15 מ&quot;מn בקו המדיאלי של הבטן, כ 1 סנטימטר מעל לפין. את העור עם רוטב מלקחיים משוננים ולאחר מכן לגזור במספריים (2A דמויות ו2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך אורכי 5-10 מ&quot;מ בalba Linea. החזק את השרירים עם microdissecting מלקחיים משוננים ולגזור במספריים (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את רפידת שומן האשכים של צד אחד עם מיקרו לנתח מלקחיים משוננים ולמשוך אותו לחשוף את האשך, צינור זרע ויותרת אשך. זרע זרע ממוקם המדיאלי לאשך וזה צינור בחינם להבחין בבירור (לא צמוד לקיר כמו האשך יותרת האשך) עם כלי דם רצו לאורך צד אחד (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את צינור זרע עם מלקחיים לנתח מיקרו משונן, מלקחיים הלבשה להבה עד שהם הופכים לאדומים (איור 2E </strong&gt;), ולאחר מכן להשתמש בם כדי לגזור ולצרוב את צינור הזרע בשתי נקודות בו זמנית (איור 2F). החתך צריך להסיר את החלק של כ -5 מ&quot;מ ולהשאיר שני יופרדו בצורה ברורה קצוות צרובים (איור 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את האשך, יותרת האשך וצינור זרע חזרה לחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך משלב 9 באשך השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפרת את השריר עם תפרים מזרן אופקיים אחד או שניים עשו עם 5/0 תפר נספג (איור 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את העור עם קוצץ אחד או שניים פצע (איור 2 ט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את זכר vasectomised (טבעת אוזן, קעקוע אצבע ...), להעביר אותו לכלוב שהונח על במה חמה ולהתבונן עד שהוא מתאושש מהרדמה (מודעת ולשמור על עינת חזה). הזרקה תת עורית מיליליטר 0.5-1 של תמיסת מלח חמימה משפרת מחדשcovery. רשום את מקרים האפשריים המתרחשים בעת העברת כריתת צינור זרע, להוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להסיר קליפים פצע 10 ימים לאחר כריתת צינור זרע עם מסיר גוזז פצע או זוג המלקחיים שיניים. הזכר שעוקר יהיה מוכן להזדווג 2 שבועות לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את פוריותו של הזכר שעוקר על ידי הזדווגות עם נקבות פורה לפני השימוש בו כדי להשיג נמענים. </li></ol> 3. חזרת עוברים ברחם, חצוצרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר morulae או בלסטוציטים ניתן להעביר על ידי טכניקה זו לנקבת נמען pseudopregnant ב2.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פיפטה זכוכית המניפולציה עובר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללטש את קצות נימי זכוכית על מנת למנוע נזק לבעל פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את החלק אמצעי של נימי זכוכית על ידי חימום עם להבה עדינה תוך סיבוב מעטהנימים בשתי הידיים באופן סינכרוני. ברגע שסעיף הנימים הופך להיות רך וגמיש (צבע אדום בהיר), לסגת ממנו במהירות מהאש ולמשוך את שני הקצוות כדי לצמצם בקוטר החיצוני שלה ל130-150 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לזכוכית להתקרר ולאחר מכן לחתוך אותו בקלילות הבקיע החלק הצר בעיפרון יהלומי נקודה, אבן מחוספסת או פצירה ומושך משני הצדדים. צריכה להיות ההפסקה נקייה ובניצב </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללטש את הקצה על ידי בוער מהר מאוד, והשאיר הפתח 100-130 מיקרומטר. טפטפות יכולה להיות מאוחסנת לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת מניפולציה עובר החמה (CZBH או M2, ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירי ניתוח, לנקות את המשטחים שבו ניתוח יבוצע ולנגב אותם עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הרדמה כמפורט לעיל (פרוטוקול 1), בדיקה לאובדן הרפלקסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על tהוא העכבר על במה חמה, להסיר את הפרווה עם קוצץ חשמלי מאזור הגב בין הברכיים וצלעות דיסטלי (3A דמויות ו3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את האזור המגולח ידי ניגוב רציף עם 10% יוד povidone ו70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העוברים מן החממה לתקשורת המניפולציה עובר prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הנמען לבמה חמה מתחת לסטראו ולמקם אותו בעמדה נוטה רוחבי למנתח (בראשה מביט לימין או לצד שמאל של המנתח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את האזור במגבת סטרילית עם חור חושף את האזור המגולח ולהאיר את אזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רוחבי 1 סנטימטר חתך (אנכי) בעור במיקום ממוקם על ⅓ הגולגולת של הקו בין הצלע האחרונה והירכיים ו⅓ הגב של הקו בין הגב והבטן (3A דמויותnd 3B). את העור עם רוטב מלקחיים משוננים ולגזור במספריים (איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהעור נחתך, השחלה (אדום / כתום) או כרית השומן המקיפה את השחלה (לבנה) יכול להיות דמיינו דרך קיר הגוף. בצע שוכל סנטימטר 0.3-0.5 חתך (אנכי) בקיר הגוף על השחלה או כרית שומן במקום שבו החתך לא לחתוך את כל כלי דם גדולים. החזק את השרירים עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו ולגזור במספריים (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את העכבר כדי לקבל את ראשו פונה כלפי המנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פיפטה עובר המניפולציה (3E איור): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר תקשורת CZBH לעלות בנימיות דרך החלק הצר של פיפטה המניפולציה עד כ -5 מ&quot;מ של חלק הרחב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את בועת אוויר קטנה (0.2-0.5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את העוברים (5-10) בכמות מינימאלית של תקשורת (2-4 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את עוד בועת אוויר קטנה (0.2-0.5 מ&quot;מ) וכמות קטנה של מדיה (0.5-1 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את פיפטה הזכוכית מחוברת לבעל aspirator פה או למכשיר מופעל ביד, מוכן לצעד 3.17. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את רפידת השומן המקיפה את השחלה עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו ולמשוך אותו לכיוון ראש העכבר כדי לחשוף את השחלה, oviduct, וחלק קטן של הרחם העליון מחוץ לחלל הבטן (3F דמויות ודור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק חתיכת הפה aspirator בפה, מוכן לשימוש, תופס את כרית השומן עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו כדי להזיז את oviduct ולחשוף את צומת הרחם-תובל (כלומר היכן oviduct עומד ברחם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על צומת הרחם-תובל נגיש, לקחת מלקחיים מעוקלים קלים מיקרו לנתיחה ביד שמאל (אם ימניים) ולמקם אותם ממש מתחתצומת הרחם-תובל תופסת oviduct כ 2 מ&quot;מ מעל חלק זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את צומת הרחם-חצוצרות עם המלקחיים נתיחה קלים המעוגלים מיקרו, לנקב את סעיף oviduct הקרוב למלקחיים עם מחט G 27 (איור 3H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את פיפטה המניפולציה העובר לתוך פתח הופיע עם המחט ומראש לרחם דרך צומת הרחם-תובל (איורים 3I ו3J). ברגע שפיפטה עברה את הצומת ברחם, חצוצרות (איור 3K) הוא מחליק בקלות. לא יתקדם רחוק מאוד אל תוך הרחם כדי למנוע נזק של רירית הרחם (לא יותר מ 3 מ&quot;מ) וחסימת פיפטה על ידי הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים לתוך הרחם על ידי בעדינות נושבת (איור 3L). שני בועות האוויר חייבים לעבור דרך הרחם. חלק מכלי התקשורת מעל הבועה הראשונהיכול גם להשתחרר אל תוך הרחם, אבל למנוע החדרת אוויר יותר, מכיוון שהוא עלול לעכב השתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פיפטה רק לאחר העוברים שוחררו אל תוך הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את oviduct ושחלה חזרה לחלל הבטן על ידי גרירת כרית השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפרת את השריר עם תפר מזרן אופקי עם 5/0 תפר נספג (איור 3M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את העור עם גוזז פצע (איור 3N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך משלב 10 בצד השני, אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הנמען (טבעת אוזן, קעקוע אצבע ...), להעביר אותה לכלוב שלה (שהונח על במה חמה) ולבחון עד שהוא מתאושש מהרדמה (מודעת ולשמור על עינת חזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן במקרים האפשריים המתרחשים במהלך חזרת עוברים ולהוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה. הזרקה תת עורית מיליליטר 0.5-1 של סאלי החמהפתרון ne משפר את ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להסיר קליפים פצע 10 ימים לאחר חזרת עוברים עם מסיר גוזז פצע או שני זוגות מלקחיים (איור 3O). הנמען יכול להישקל באותו יום כדי להעריך את ההריון ולהעריך את מספר הגורים. לספק חומר גוזל לנמען 15 ימים לאחר חזרת עוברים. </li></ol>

<ol><li>Fernandez-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effect+of+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+with+serum+on+mRNA+expression+of+imprinting+genes%2C+development%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).</li>
<li>Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glucose+concentration+during+in+vitro+culture+of+mouse+embryos+on+development+to+blastocyst%2C+success+of+embryo+transfer%2C+and+litter+sex+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio.</a> 79, 329-336 (2012).</li>
<li>Tarkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+isolated+blastomers+of+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs.</a> Nature. 184, 1286-1287 (1959).</li>
<li>Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+mouse+eggs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilization of mouse eggs in vitro.</a> Nature. 220, 592-593 (1968).</li>
<li>McLaren, A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+development+and+birth+of+mice+cultivated+in+vitro+as+early+as+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos.</a> Nature. 182, 877-878 (1958).</li>
<li>McLaren, A., Michie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transfer+of+fertilized+mouse+eggs+to+uterine+foster-mothers.+I.+Factors+affecting+the+implantation+and+survival+of+native+and+transferred+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs.</a> J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).</li>
<li>Goto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+embryos+transferred+into+the+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assist.+Reprod.+Gen%22%5BJournal%5D)">The fate of embryos transferred into the uterus.</a> J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Chin, H. J., Wang, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utero-tubal+transfer+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Utero-tubal transfer of mouse embryos.</a> Genesis. 30, 77-81 (2001).</li>
<li>Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stem+cell+activation%2C+culture+media+of+manipulated+embryos%2C+and+site+of+embryo+transfer+in+the+production+of+F0+embryonic+stem+cell+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice.</a> Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).</li>
<li>Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+abdominal+and+scrotal+approach+methods+of+vasectomy+and+the+influence+of+analgesic+treatment+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice.</a> Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+PA+%22Laboratory+Animal+Anaesthesia%22">Laboratory Animal Anaesthesia</a>. , Academic Press. Oxford, UK. (2009).</li>
<li>Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+with+various+anesthetics+in+mice+%28pentobarbitone+ketamine-xylazine%2Ccarfentanyl-etomidate%29%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate).</a> Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).</li>
<li>Tarin, D., Sturdee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anaesthesia+of+mice%3A+evaluation+of+tribromo-ethanol%2C+ether%2C+halothane+and+methoxyflurane+and+development+of+a+reliable+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique.</a> Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).</li>
<li>Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+tribromoethanol+as+used+in+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice.</a> Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).</li>
<li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+stored+and+newly+prepared+tribromoethanol+in+ICR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).</li>
<li>Lieggi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+preparation+methods+and+storage+conditions+of+tribromoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol.</a> Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).</li>
<li>Meyer, R. E., Fish, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+tribromoethanol+anesthesia+for+production+of+genetically+engineered+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats.</a> Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).</li>
<li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).</li>
<li>Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+hamster+oocytes+to+assay+the+fertilizing+capacity+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa.</a> J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).</li>
<li>Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+development+of+mice+morulae+after+storage+in+non-frozen+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

ניתוח העיקור הוא טכניקה כירורגית קדימה יחסית ישרה שאינו כרוכה בקשיים גדולים. כאשר חיטוי עם יוד povidone ואתנול לוודא כי השטיפה האחרונה (עם אתנול) מסירה יוד povidone, מכיוון שהוא עלול לגרום לגירוי הצפק. הגישה לצינור זרע גם יכולה להיות מושגת על ידי שק האשכים או ביצוע חתך רוחבי בבטן 8. חתך האשכים כבר המליץ ​​לי רוחבי חתך בבטן עקב החתך הקטן יחסית לצורך ולאחר ניתוח התנהגות 11 מעט טובה יותר. עם זאת, אנו מעדיפים את החתך בבטן מעל צק האשכים מכיוון שהוא מספק ג...

חזרת עוברים הוא כנראה ההליך הכירורגי השכיח ביותר שבוצע במודל העכבר. טכניקה זו היא חיונית כדי להשיג צאצאים מעוברים נתון במבחנה טכניקות מניפולציה, ולכן מהווה צעד הכרחי לפיתוח של מודלים מהונדסים גנטי על ידי הזרקת pronuclear, התמרה lentiviral, או היווצרות הכימרה. חוץ מזה, הטכניקה מאפשרת הלימוד של ההשפעות התפתחותיות של עלבונות מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות preimplantation. השימוש בטכניקות מלאכותיות רבייה 1 או החשיפה לריכוזים חריגים של חומרים או מטבוליטים 2 שונים עשוי להשפיע על התפתחות עובר וכתוצאה מכישלונות השתלה או placentation והשפעות ארוך טווח בצאצאים. טכניקת חזרת עוברים אמינה לשחזור היא חיונית כדי לבדוק את ההשפעות שליליות האפשרית של טיפול ניסיוני בהשתלה והתפתחות העובר באדם עקבינר. ניתן להעביר עוברי preimplantation Murine לנקבת נמען או לתוך oviduct באמצעות ampullae פוסט 0.5 ימים coitum הנמענים (DPC) pseudopregnant (העברת oviduct) 3,4 או לתוך הרחם של 2.5 נמען pseudopregnant DPC (העברת רחם) 5,6 בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם. עוברים בשלב הבלסטוציסט, כגון אלו המשמשים ליצירת עכברי chimeric על ידי הזרקה של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה, הם מועברים בדרך כלל על ידי העברת רחם. יכול גם להיות מועבר בלסטוציטים לoviduct של נמען DPC 0.5, אבל היא מהווה מבחן פחות פיסיולוגי למשבשים התפתחותי, כי העובר עובר diapause ויש לו 2 ימים להתאושש מהעלבון לפני ההשתלה מתרחשת. העברה ברחם כרוכה ניקוב דופן הרחם בעזרת מחט צרה על מנת ליצור הפתח המאפשר הגישה של פיפטה מניפולציה עובר לתוך לומן הרחם.lthough טכניקה זו יכולה להניב תוצאות טובות, ההישרדות לטווח (כלומר אחוז העוברים הועברו המתפתחים לגור) היא לעתים קרובות נמוכה ובלתי צפוי 7,8. ניקוב דופן הרחם כרוך כמה תופעות לוואי מזיקות. ראשית, myometrium היא רקמת vascularized מאוד ולנקבה לעתים קרובות תוצאות דימום קטן. דם עלול לחסום את טפטפת העברת עובר או לפלוש ללומן רחם גרימת מוות עוברי ו / או כישלון השתלה. זה רלוונטי במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים, כמו תאי הדם והפסולת יכולים לצרף לסטומרים. שנית, הפתיחה שבוצעה אינה חותמת אחרי העוברים הועברו, ולכן הם יכולים לזרום בחזרה דרך פתח ולהיות מגורשים לחלל הבטן, כאשר נפח גדול מדי כבר להכניס לתוך הרחם. העברת העובר ברחם, חצוצרות שתוארו במסמך זה לנצל את צומת הרחם-חצוצרות כדי לספק embryos לתוך הרחם ללא הצורך בניקוב דופן רחם ובכך להימנע מההשלכות השליליות שלה 9. נקבות נמען pseudopregnant משמשות להעברת עובר מתקבלות על ידי הזדווגות טבעית עם זכרים עוקרו 8. הפרשות המכוננת המיוצרים על ידי זכר סטרילי נדרשות לרחם להפוך פתוח לעוברים שהועברו. כדי להשיג נמען, למקסימום של 2 נקבות של 8 שבועות עד 6 חודשים של גיל מונחים עם זכר שעוקר בשעתי אחר הצהריים. למחרת בבוקר, נשים נבדקות לנוכחות של תקע הזדווגות בנרתיק, סבך של חלבונים קרוש מנוזל הזרע הגברי. כהזדווגות מתרחשת בדרך כלל בחצות, היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב 0.5 DPC. למרות שניתן לרכוש זכרים עוקרו מכמה ספקים, ההליך הכירורגי שתואר במסמך זה הוא קל יחסית ואינו דורש כל מכשירים נוספים מהנדרש להעברת עובר.

<table><tbody><tr><td>קטמין</td><td>VEDCO</td><td>Ketaved ANADA 200-257</td><td>להזמנה על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>Anased NADA #139-236</td><td>להזמנה על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>בופרנורפין</td><td>גנרי</td><td>NDC 400-42-010-01</td><td>להזמנה על ידי וטרינר מורשה.</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>נוברטיס</td><td>אנטיביוטיקה ג'נטאלית</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פייזר</td><td>Clavamox NADA #55-101.</td><td>נוסף למי שתייה (0.3 מ"ג/מ"ל אמוקסיצילין טריהידרט ו-0.075 מ"ג/מ"ל אשלגן קלבולנט). הוסף 1.5 מ"ל מבקבוק 15 מ"ל המחודש ל -250 מ"ל מים.</td></tr><tr><td>חבישת מלקחיים משוננים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-8120</td><td>כל מלקחיים ישרים מפלדה בגודל בינוני בדרגה כירורגית יעבדו.</td></tr><tr><td>מיקרו-ניתוח מלקחיים משוננים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>אלה מעוקלים בזווית של 90&. ניתן להשתמש במלקחיים ישרים אם מעדיפים.</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו דיסקציה מעוקלים קלים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>דגם זה שימושי במיוחד להחזקת צינור הביצית.</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5880</td><td>כל מספריים ישרים קטנים מפלדה בדרגה כירורגית רגילה יעבדו.</td></tr><tr><td>מחטים 27 גרם</td><td>בקטון-דיקינסון</td><td>305136</td><td>ניתן להשתמש גם במחטים קטנות יותר (30 גרם). 25 גרם עשוי להיות קצת גדול מדי.</td></tr><tr><td>אפליקציית קליפ</td><td>MiKRon</td><td>42763</td><td></td></tr><tr><td>9 מ"מ קליפסים</td><td>MiKRon</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>מסיר קליפס</td><td>MiKRon</td><td>7637</td><td>ניתן להשתמש בשני זוגות מלקחיים לשיניים (ROBOZ RS-8160) במקום.</td></tr><tr><td>מחזיק מחט תפר</td><td>ROBOZ</td><td>RS-7820</td><td></td></tr><tr><td>תפר</td><td>Dowist Gell</td><td>5-0 Dexon S 7204-21</td><td>ניתן להחליף בכל תפר נספג 4-0 עד 6-0 עם מחט מעוקלת צרה.</td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>VWR</td><td>100 ul פיפטות מכוילות 53432-921</td><td>הוא כולל מערכת שואב פה הדורשת רק לחבר 0.22 & #181; מסנן M בצינור כדי להיות מוכן לשימוש. מידע נוסף ניתן לקבל ב- Nagy et al.8Burner</td></tr> <tr><td></td><td>KISAG AG</td><td>Typ 2002</td><td>מבער המופעל על ידי גז, ניתן לטעינה עם Kigas (CH-4512, מאותו ספק). ניתן להשתמש גם במבערי אלכוהול, אך גז מספק טמפרטורה גבוהה יותר ומבער זה מספק להבה קטנה ומדויקת.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>זהו אסטראומיקרוסקופ יקר עם פלואורסצנטיות, שיכול לשמש גם למטרות אחרות. ישנן אפשרויות זולות יותר כמו Leica MZ8 או Nikon SMZ-10 או SMZ-2B, אם להזכיר כמה. עדיף להשתמש בשני סטריאומיקרוסקופים, אחד לטיפול בעוברים (שלא צריך להיות נחמד במיוחד) ואחד אחר עבור המקבל. זה המשמש עבור הנמען צריך להציג מרחק רב מלוחית הבמה לעדשת האובייקטיביה, על מנת להיות מסוגל להתמקד 3-4 ס"מ מעל לוחית הבמה (שם תוצב הביצית) ועדיין להשאיר קצת מקום למנתח; רוב הסטריאומיקרוסקופים יכולים לעשות זאת, אבל חלקם לא.</td></tr><tr><td>אילוסטרציה של סיבים אופטיים</td><td>דולן ג'נר</td><td>פייבר לייט</td><td>להארת אזור הניתוח. ישנן מערכות שונות זמינות.</td></tr><tr><td>שלבים חמים</td><td>היקף אמריקאי</td><td><a href="https://exch.mail.umd.edu/owa/redir.aspx? C=1qTJKejamUSfudeYG_MlZHvTY3dsJM9Iaqr2SnwGD4ECWGzB8e8Rpg--_L7u0vJmyatXQJzGQ0k.& URL=http%3a%2f%2fstore.amscope.com%2ftcs-100.html" target="_blank">http://store.amscope.com/tcs-100.html</a></td>ניתן <td>למקם אותם מעל לוחית הבמה של הסטריאומיקרוסקופ. ייתכן שיהיה צורך בשינויים מסוימים (הכנסת מקל כדי ליישר את הבמה) אם הוא קצר מדי עבור הסטריאומיקרוסקופ. ניתן להשתמש בבמה חמה גדולה לחימום הכלוב אם היא זמינה. אם לא, ניתן להשתמש בכרית חימום רגילה, אך יש לבדוק את הטמפרטורה.</td></tr><tr>ניתן להשתמש גם <td>בכלי תרבית למניפולציה של עוברים</td><td>פלקון</td><td>353001</td><td>351008; הם יצרו טיפות צרות יותר.</td></tr></tbody></table>

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

העברת עוברי preimplantation לנקבה פונדקאית היא צעד הנדרש לייצורם של עכברים מהונדסים גנטי או כדי לחקור את ההשפעות של שינויים אפיגנטיים מקורו במהלך פיתוח preimplantation על בריאות פיתוח ומבוגר עוברית שלאחר מכן. השימוש בטכניקת העברת עובר יעילה ועקבית הוא חיונית כדי לשפר את הדור של בעלי חיים מהונדסים גנטי ועל מנת לקבוע את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעורי השרשה והישרדות לטווח. עוברים בשלב הבלסטוציסט בדרך כלל מועברים על ידי העברת רחם, ביצוע לנקב בדופן הרחם להציג פיפטה המניפולציה עובר. פתח שבוצע ברחם אינו נסגר לאחר פיפטה בוטלה, והעוברים יכולים יצוא לחלל הבטן עקב הלחץ החיובי של הרחם. לנקב יכול גם לייצר דימום הפוגע בהשתלה, בלוקים טפטפת ההעברה ועלולה להשפיע על עובר דevelopment, במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים. כתוצאה מכך, טכניקה זו לעתים קרובות תוצאות בשיעורי הישרדות עובר נמוך מאוד משתנים וכוללים. הימנעות השפעות השליליות אלה, העברת עובר ברחם, חצוצרות לנצל את צומת רחם-חצוצרות כמחסום טבעי המונע יצוא עובר ולהימנע מניקוב דופן הרחם. זכרים שעוקרו נדרשים לקבלת מקבלי pseudopregnant. טכניקה לביצוע ניתוח עיקור מתוארת כהשלמה לעוברים ברחם, חצוצרות.

<html> העברת עובר ברחם, חצוצרות מספקת מתכוון להעביר עוברים אל רחם הימנעות חלק מהסיבוכים הקשורים לעוברים ברחם 2,9,10. בטבלה 1 אנו מראים כמה תוצאת נציג השגנו העברת בלסטוציטים CD1 נתון למיני מניפולציות לנמעני CD1 שונים בעקבות הפרוטוקול המתואר. ההישרדות לטווח (% מעוברים וכתוצאה מגור) או הישרדות לE15 (במקרה של lentivirus נחשף) דומה בין עוברים פשוט בתרבית במבחנה משלב הזיגוטה (IVC), עובר נתון להזרקת iPSC לייצר גורי chimeric ועוברים שהוסרו Zona...

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר עוברים טרום-השתבצות לרחם של נקבה מקבלת בהיריון מדומם ביום 2.5 DPC. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת השחלה, ה-uct והקטע הראשון של הרחם. לאחר מכן, ה-UCT ננקב באמצעות מחט.בשלב הבא, פפיפטה קפילרית מזכוכית מוחדרת דרך החור ומתקדמת אל תוך חלל הרחם. לבסוף, העוברים משוחררים אל הרחם. בסופו של דבר, מספר הגורים שנולדו משמש להוכחת השרידות של העוברים שהועברו בשלב טרום-השתבצות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטה כגון העברה רחמית של עוברים הוא שדופן הרחם אינה ננקבת, ובכך נמנעים דימומים וזרימה של העוברים. כל ניסויי בעלי החיים אושרו על ידי ועדות לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם של אזור Beltsville, בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ה-USDA. לאחר מתן אלחוש ומשככי כאבים לעכבר זכר בעל ביצועי זיווג מוכחים, ואישור שהבעל מסומם כראוי, מקמו את העכבר על במה חמה והשתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי להסיר את הפרווה מהאזור הבטני בין שני קווים רוחביים דמיוניים הממוקמים 0.5 סנטימטרים ו-2.5 סנטימטרים מעל הפיפיס.השתמשו ב-10% povidone iodine וב-70% ethanol לחיטוי האזור הגזור. לאחר מכן, בעזרת פינצטה משוררת לדסמינג (dressing serrated forceps), אחזו את העור בקו האמצעי של הבטן ובצעו חתך עורי אורכי של 10 עד 15 מילימטרים, כסנטימטר אחד מעל הפין. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה משוררת לדיסקציה (di

utero-tubal-embryo-transfer-and-vasectomy-in-the-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

תיאור אינדוקציה הניתוח של אנדומטריוזיס בעכברים וחולדות על ידי השתלת אוטומטית של רקמת הרחם אל מפל העורקים של mesentery המעי.

עכבר דגם של אנדומטריוזיס בניתוח המושרה על ידי השתלת אוטומטי של רקמות הרחם

מקור: Lutz, D., et al. הערכת פרמטרים של נוירופלסטיות אולטרה-מבנית לאחר התמרה ברחם של מוח העכבר וחוט השדרה המתפתחים. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים התמרה ויראלית באמצעות הזרקה תוך רחמית בעוברי עכברים. מכינים עכברה בהריון לניתוח, ומבצעים חתך בקו האמצע כדי לחשוף את קרני הרחם. תערובת של וירוס המכיל את הגן הרצוי וצבע מעקב מוזרקת לעוברים בתוך שקי הרחם במיקומים הממוקדים. לאחר מכן מחזירים את קרני הרחם לפני התפירה.

התמרה ויראלית ברחם בעכבר

אנו מתארים פרוטוקול לביצוע בתוך הרחם השתלת (דליה) דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר של הזרקת במודל מאתר. פרוטוקול זה ניתן להציג תאים וקטורים ויראלי, חומרים אחרים לתוך לסביבה הייחודית של העובר החיסון-סובלנית.

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות) הן בהערכה רציפה כדי לשפר את התוצאות ולהפחית את הסיכונים הקשורים. כתב יד זה מתאר הליך מינימלית פולשני העברת העובר עם פרוטוקול הקריוגנית יעיל המאפשר שימוש בארנבים כמודל בעלי חיים אידיאלי של רבייה אנושית.

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

מודלים שונים של בעלי חיים של שבר דיאפרגמטי מולד וחסימת קנה הנשימה העוברי מציגים יתרונות וחסרונות לגבי סוגיות אתיות, עלות, קושי כירורגי, גודל, שיעורי הישרדות וזמינות של כלים גנטיים. מודל זה מספק כלי חדש כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת קנה הנשימה והלחץ המואצני המוגבר על התפתחות הריאות.

מודל חסימת קנה הנשימה העוברי הטרנס-רחמי בעכברים

ביסוס הריון הוא תהליך דינמי הכולל הצלבה מורכבת של עוברים ורחם. התרומות המדויקות של סביבת הרחם האימהית לתהליכים אלה נותרו תחום מחקר פעיל. כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לסייע בעיצוב מודלים של בעלי חיים in vivo כדי לענות על שאלות מחקר אלה.

שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות

שיטת מניפולציית צוואר הרחם המוצגת יכולה לגרום לפסאודו-הריון בעכברים ללא צורך בגידול נקבות עם זכרים שעברו כריתת כלי דם. השראת פסאודו-הריון נדרשת להצלחת החזרת עוברים לא כירורגית והזרעה מלאכותית לא ניתוחית, שניהם מוצגים גם.

גרימת פסאודו-הריון בעכברות נקבות ללא צורך בזכרים שעברו כריתת כלי דם לפני החזרת עוברים לא ניתוחיים או הזרעה מלאכותית

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל עכבר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI)-העברת עוברים (ET), המאפשר לנו לצפות בשינויים הקשורים לגיל במטבוליזם של גלוקוז שניתן לייחס ל- ICSI, ומספקים תובנות לגבי ההשפעות ארוכות הטווח הפוטנציאליות שלו על ההתפתחות האנושית.

ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית

למד את שיטת העברת עוברים דרך מחבר הרחם-חצוצרה בעכברים לשימור שרידות עוברים טרום-השתלה. טכניקה זו מונעת דימום ובריחת עוברים ומאפשרת הערכת הצלחה לפי מספר הגורים הנולדים.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

גלה סרטונים נוספים