שיטה משופרת למדידה מדויקת והמהירה של טיסה בביצועים דרוזופילה
13 בפברואר 2014
כאן אנו מתארים שיטה למדידה מהירה ומדויקת של ביצועי טיסה בדרוזופילה, המאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד במהירות ובדייקנות את ביצועי הטיסה בדרוזופילה. זה מושג על ידי הטלת זבובים תחילה לתוך גליל טיסה. השלב השני של ההליך הוא הדמיית משטח הנחיתה במצלמה דיגיטלית.
השלב האחרון הוא ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת הדמיה על ידי מדידת גובה הנחיתה של כל זבוב. בסופו של דבר, הליך זה מסייע בזיהוי מוטציות ומצבים כגון הזדקנות או ניוון עצבי, הפוגעים ביכולת הטיסה ועוזר לכמת את ביצועי הטיסה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בוחן הטיסה המקורי, הוא שהיא מתאימה יותר למסכים בעלי תפוקה גבוהה עבור מוטאנטים ותנאים אחרים הפוגעים בטיסה.
הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו כמה זמן כרוך בבדיקת מספר רב של גנוטיפים באמצעות בודק הטיסה המקורי. אבטח את גליל הטיסה למעמד טבעת באמצעות מהדקי שרשרת. השאירו כשלושה סנטימטרים מתחת לגליל למנה.
טען את צלחת הדרך בשכבה דקה של שמן מינרלי והחלק אותה מתחת לגליל הטיסה. אבטח את המשפך למעמד טבעת שני. התאם את גובה המשפך כך שתחתית המשפך תהיה צמודה לחלק העליון של גליל הטיסה.
החלק הצר ביותר של המשפך חייב להיות צר יותר מבקבוקון זבוב. קוטר צינור הטיפה צריך להיות מעט רחב יותר מבקבוקון זבוב, כך שהבקבוקון מסוגל ליפול בחופשיות. הכנס את צינור הטיפה לחלק העליון של המשפך ואבטח אותו באמצעות טופר clamp.
לאחר מכן, מגיליון פולי אקרילאמיד, חותכים חתיכה מלבנית באורך גליל הטיסה ברוחב מעט קטן יותר מההיקף הפנימי של גליל הטיסה. מרחו שכבה דקה של דבק מלכודת סבך על הסדין, והשאירו מספיק מקום בחלק העליון והתחתון ללא ציפוי כדי להחזיק את הסדין. לאחר שהדבק על הסדין התייבש במשך שעה, החלק את הסדין לתוך גליל הטיסה עם הדבק פנימה.
לאחר מכן, הרכיבו את מסלול המצלמה באמצעות תושבות תמיכה מעץ אורן. ודא שהחלק התחתון של המסלול יכול לתמוך במצלמה מבלי לחסום את העדשה. לאחר מכן הברג את הפקקים למקומם במקום בו הם לא מפריעים לתצוגת המצלמה של יריעת הפלסטיק.
אסוף בקבוקונים של זבובים לבדיקה עם לא יותר מ-20 זבובים לבקבוקון. הקש בעדינות על הזבובים לתחתית הבקבוקון. נתק את הבקבוקון מהחשמל והכנס אותו לצינור הטיפה.
שחרר את הבקבוקון. כאשר הבקבוקון פוגע בדפנות המשפך ההולך ומצטמצם, הזבובים נפלטים לתוך גליל הטיסה. הרם את צינור הטיפה כדי להסיר את הבקבוקון הריק ולהעמיס זבובים נוספים אם תרצה.
ניתן לבדוק עד 200 זבובים שנטענו מ-10 בקבוקונים ולצלם אותם בקלות על יריעת פולי אקרילאמיד אחת. כעת, הסר את יריעת הפלסטיק והנח אותה על משטח לבן שטוח ניתן להשתמש בלוח פוסטרים לבן אם הספסלים בצבע כהה. הרכיבו את מסלול המצלמה מעל יריעת הניילון.
המצלמה צריכה להיות גבוהה מספיק מעל הגיליון כדי שגם החלק העליון וגם התחתון של הגיליון יהיו בשדה הראייה. החלק את המצלמה לאורך המסלול תוך כדי לחיצה ממושכת על לחצן הצילום כדי לקבל תמונה פנורמית. ניתן לספור באופן ידני את מספר הזבובים הנוחתים בשמן בצלחת מתחת לתא הטיסה.
עבור כל ניסוי בין ניסויים, ניתן להסיר זבובים מהגיליון ולעשות שימוש חוזר בגיליון. פתח את קבצי התמונה בתוכנת תמונה J חתוך את התמונות במידת הצורך כדי לכלול רק את שטח פני הנחיתה. השמנת ההסתבכות של האזור המצופה.
המירו את התמונות לגווני אפור של שמונה סיביות וצרו סף. כדי לסנן את הרקע הלבן. הגדר את הפרמטרים לזיהוי כל זבוב.
באמצעות תפריט ניתוח חלקיקים, הגדר את הפרמטרים. משמש לזיהוי חלקיק באמצעות מכשיר ההדגמה. שטח של חמישה עד 90 פיקסלים בריבוע ומעגליות של 0.4 עד 1.0 יזהו במדויק את כל הדגימות.
כעת, מדדו את מיקומו של כל זבוב באמצעות רשימת הקואורדינטות שנוצרה עבור כל חלקיק. ניתן להמיר את קואורדינטת X בפיקסלים לסנטימטרים. כדי לחשב את גובה הנחיתה, ייבא את הטבלה לגיליון אלקטרוני והמשך בניתוח.
ביצועי הטיסה של זבובים מוטנטיים איטיים, שיש להם פגם טיסה ידוע, הושוו לזבובי קנטון מסוג בר. כל הזבובים היו בני שלושה ימים, שגדלו בבקרת טמפרטורת החדר זבובים נחתו בעקביות ליד החלק העליון של הגליל. התפשטות הנחיתה הייתה הרבה יותר גדולה עבור מוטאנטים איטיים.
גובה הנחיתה הממוצע של קנטונים ב-73 סנטימטרים היה גדול משמעותית מזה של מוטציות איטיות ב-44 סנטימטרים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כגון היסטולוגיה כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשלמות המבנית של שרירי טיסה, נוירונים מוטוריים או צמתים עצביים-שריריים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד אתה יכול להעריך במהירות את ביצועי הטיסה ב-oph.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה למדידה מהירה ומדויקת של ביצועי תעופה ב-Drosophila, המאפשרת סריקה בתושבה גבוהה. הפרוצדורה כוללת הפלה של זבובים לתוך גליל תעופה, לכידת תמונות של משטח הנחיתה וניתוח הנתונים למדידת גובה הנחיתה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- גנטיקה
רקע
- ביצועי תעופה הם מדד קריטי במחקר של Drosophila.
- שיטות קיימות למדידת יכולת תעופה הן לרוב בעלות תפוקה נמוכה.
- זיהוי מוטציות המשפיעות על התעופה יכול לספק תובנות לגבי ניוון עצבי.
- שיטה זו משפרת את היכולת לסרוק מצבים שונים המשפיעים על התעופה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה בעלת תפוקה גבוהה להערכת ביצועי תעופה ב-Drosophila.
- זיהוי מוטציות גנטיות ותנאים הפוגעים ביכולת התעופה.
- כימות מדויק של ביצועי התעופה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זבובים מסוג Drosophila מופלים לתוך גליל תעופה.
- מצלמה דיגיטלית קולטת תמונות של משטח הנחיתה.
- תוכנת דימות מנתחת את הנתונים כדי למדוד את גובה הנחיתה.
- השיטה מאפשרת סריקה מהירה של דגימות מרובות.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת מדידות מדויקות של ביצועי תעופה.
- היא מתאימה לסריקה בthroughput גבוה של מוטנטים.
- ניתן להעריך מצבים כגון הזדקנות וניוון עצבי.
- התוצאות יכולות לסייע בהבנת הבסיס הגנטי של ליקויים בתעופה.
מסקנות
- טכניקה זו משפרת שיטות קיימות למדידת ביצועי תעופה.
- היא מאפשרת לחוקרים לבצע ניתוחים בעלי תפוקה גבוהה ביעילות.
- הממצאים עשויים לתרום להבנת ההשפעות הגנטיות על התנהגות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מדידה כמותית של ביצועי התעופה של Drosophila מאפשרת סריקה גנטית ופנוטיפית בעלת תפוקה גבוהה, התומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקרי נוירוביולוגיה והזדקנות. זרימת העבודה המשופרת מבצעת סטנדרטיזציה של בדיקות התנהגותיות, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי עבור מחקרים תפקודיים המשכיים ותיעדוף תיקי מחקר. יכולת זו מאיצה את זיהוי המודיפיקטורים הגנטיים ופנוטיפים הרלוונטיים למחלה במערכות מודל פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים על התפקוד הנוירו-מוסקולרי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות פנוטיפים התנהגותיים הקשורים להפרעות גנטיות.
- מסייע בהסרת סיכונים מנגנוניים על ידי הבחנה בין ביצועי תעופה תקינים ללקויים.
- משפר את רמת הביטחון הניבוית לצורך תיעדוף מטרות גנטיות בתהליכי פיתוח למחלות ניוון עצבי והזדקנות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מודלים מאוששים של Drosophila עבור תהליכי סינון התנהגותיים הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- מנstandardize תנאי הבדיקה על ידי בקרה של מהירות הכניסה ואוטומציה של לכידת הנתונים.
- מאפשר קריאות כמותיות בעוצמה גבוהה המתאימות לסריקות גנטיות או של תרכובות בהיקף רחב.
- תומך בהערכה מהימנה של גנים מועמדים או התערבויות המשפיעות על התפקוד המוטורי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין פלטים פנוטיפיים לבין נקודות סיום הרלוונטיות למחלה במחקרי ניוון עצבי והזדקנות.
- מספק רצף מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של תוצאים פונקציונליים.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום [של תהליכים/מוצרים] המותאמת לסיכון, בהתבסס על נתונים התנהגותיים כמותיים ואמינים.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור בין הגנוטיפ לפנוטיפ תפקודי.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה גנטית מוקדמת ועד לתיקוף של מודלים פרה-קליניים, ובכך מספקת מבחן התנהגותי סטנדרטי למחקר בתחומי הגנומיקה הפונקציונלית והנוירוביולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות ליקויי תעופה על פני גנוטיפים ותנאים שונים.
- סקרינג: מספק פלטים כמותיים וניתנים לשחזור עבור סקרינג של מוטנטים או התערבויות בתפוקה גבוהה.
- אנליטיקה: מספק דימוי דיגיטלי ומדידה מבוססת תוכנה של גובה נחיתה לצורך השוואה אובייקטיבית של נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר פנוטיפים התנהגותיים של Drosophila לתוצאות תפקודיות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור קמפיינים מגוונים של סקרינג גנטי ופנוטיפי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והתפוקה של בדיקות התנהגותיות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקה של תהליכים (go/no-go) וניהול יעיל של תיק הפעילויות מבחינה הונית.
- השפעה על תיק הפעילויות: תומך בתיעוד עדיפויות מותאם סיכון ובקידום של מטרות גנטיות והתערבויות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila ובהקמה של בדיקות התנהגותיות.
- נדרש ציוד דימוי דיגיטלי ותוכנה לניתוח תמונות עבור קריאות כמותיות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הבדיקה ושל זרימות העבודה בניתוח הנתונים.
- ניתן להתאמה לרקעים גנטיים ותנאים ניסויים שונים ב-Drosophila.
- מוגבל למערכות מודל שבהן ביצועי התעופה מהווים נקודת קצה תפקודית רלוונטית.
