בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד מיטוכונדריה הקשורות ל-mRNAs בתהליך תרגום. זאת משיגים תחילה על ידי קציר תאי שמרים שגודלו בתנאים המעשירים מיטוכונדריה. השלב השני הוא ליסיס עדין של התאים בנוכחות cycloheximide.

בשלב הבא, המיטוכונדריה מופרדות מהמרכיבים המסיסים באמצעות סנטריפוגציה דיפרנציאלית. השלב הסופי הוא מיצוי RNA מהמיטוכונדריה וממדגמי ביקורת. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח northern כדי להראות את הניקיון והאיכות של ה-RNA הקשור למיטוכונדריה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד סוגים רבים של RNA בהכנה אחת. לכן, ניתן לבצע ניתוח השוואתי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון מיקוד תוך-תאי ותפקוד אורגנלה.

בפרוצדורה זו, מיטוכונדריה יטוהרו מ-100 עד 150 ml של תאי שמרים שגודלו עד OD 600 של 1 עד 1.5 בטמפרטורה של 30 °C במצע גידול שאינו תוסס. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השלך את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את המשקע במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן סבב שוב בצנטריפוגה.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), שקלו את משקע התאים. בדרך כלל מתקבלים כ-0.6 גרם מ-100 מיליליטר של תאים. השביו (resuspend) את המשקע במיליליטר אחד של DTT buffer לכל 0.5 גרם תאים.

חשוב לטפל בתאים באמצעות חומר מחזר כדי לשבור את קשרי הדיסולפיד בדופן התא, ובכך לשפר את ההידרוליזה. דגרו את התאים למשך 10 דקות ב-30 °C עם ניעור עדין. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע.

במיליליטר אחד של xmal liase buffer לכל 0.15 גרם תאים, אין לבצע ערבוב ב-vortex. מדדו את ה-OD 600 של מנת עליקוטי של 10 microliter תאים ב-990 microliter מים ורשמו ערך זה. הוסיפו xmal liase שהוכן טרי לתאים כדי להמיס פולימרים של גלוקוז בקשרי beta one three glucan וליצור Sphero plast.

מעתה ואילך יש לשמור את הספרופלסטים (Sphero plasts) בתמיסה איזוטונית כדי למנוע ליזיס; דגרו את התאים במשך 15 דקות ב-30 °C עם ניעור עדין. כדי לוודא את הידרוליזת דופן התא ואת היווצרות הספרופלסטים, ערבבו 10 µL מהתאים עם 990 µL מים ומדדו את ה-OD 600. הספרופלסטים צפויים לעבור ליזיס עקב ההבדל האוסמוטי, וערך ה-OD 600 צריך להיות נמוך פי עשרה לפחות מהערך שנקבע לפני הוספת ה-xmal liase. אם לא, המשיכו בדגירה עם xmal liase למשך 15 דקות נוספות.

יש להשעות מחדש את ה-PHE של Plast ב-100 milliliters של תמיסת התאוששות ולהעביר את כדור ה-plast לבקבוק Helen Meyer. יש לדגרי עבור שעה אחת ב-30 degrees Celsius עם ניעור. שלב התאוששות זה נחוץ מכיוון שהתרגום נעצר והלוקליזציה של ה-mRNA משובשת במהלך הטיפול ב-XYs.

לאחר שעה אחת, הוסיפו 0.1 mg/mL של cycloheximide, והעבירו את הספרופלסטים למבחנות קונויות של 50 mL שקוללו מראש. הוספת cycloheximide חשובה כדי להקפיא את הקישור של הריבוזומים ל-mRNAs. כך נשמר הקישור של mRNA למיטוכונדריה התלוי בריבוזומים.

סבב במערכת צנטריפוגה את כדור הפלס ב-3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. השלך את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף פעמיים עם מניטול קר. באפר reus.

השעה את כדור הפלס (sphere of plass) בארבעה מיליליטר של בופר מניטול קר והעבר את התו suspension להומוגנייזר בנפח של 15 מיליליטר המצויד בעלי עבור tight fitting. שבש את כדור הפלס בעדינות באמצעות 15 תנועות והעבר את הליזאט למבחנה של 13 מיליליטר. סבב את הליזאט בצנטריפוגה במהירות של 1,500 ×g למשך שש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C).

כדי לשקיע את הגרעינים והתאים שלא נפרצו. העבר בזהירות את הנוזל העליון למבחנה חדשה. הפר 1 ml או 25% מהדגימה כדגימה לא מופרדת או דגימה כוללת.

העבר 50 µL מדגימה זו למבחנה חדשה והוסף 15 µL של four XLSB. לצורך ניתוח western blood, RNA ישקיע מהיתרה של הדגימה הכוללת עבור ניתוחי northern ו-microarray. סבב את הסופרנאט (supernatant) בצנטריפוגה ב-10,000 ×g.

בכבידה למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי לשקע את המיטוכונדריה, העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה ושמרו אותה על קרח. זהו הפראקציה הציטוזולית.

העבר 50 µL מדגימה זו למבחנה חדשה והוסף 15 µL של four XLSB. עבור ניתוח western blot, ה-RNA ישקע משארית הדגימה הציטוזולית לצורך ניתוחי northern ו-microarray. שטוף את המשקע עם 3 mL של mannitol, buffer וסבב שוב בצנטריפוגה ב-10,000 ×g.

סנטריפוגה בכוח 중דרה למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את המשקע ב-3 מיליליטר של בופר מניטול. דגימה זו מכילה את המיטוכונדריה ומכונה פרקציית המיטוכונדריה.

העבר 50 µL מדגימה זו למבחנה חדשה והוסף 15 µL של four XLSB לצורך אנליזת Western blot. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הוסף לכל דגימה נפח אחד של guanidinium HCl בריכוז 8 M ושני נפחים של 100% ethanol, ערבב ב-vortex והדגר למשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של 20- °C. סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

שפך את הנוזל העליון. היזהר, שכן המשקע עלול להיות לא יציב. לאחר שטיפת המשקע ב-70% ethanol, השעה את המשקע ב-400 µL של מים נקיים מ-RNase והעבר את הדגימה למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה.

השקה שנית את ה-RNA על ידי הוספת 0.1 נפח של sodium acetate בריכוז three molar ו-pH 5.2 ושני נפחים של 100% ethanol; ערבב ב-vortex והדגר למשך שעתיים לפחות בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius.

שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו ב-70% ethanol. ייבשו את המשקע באוויר והמיסו מחדש במים נקיים מ-RNA. אחסנו את דגימות ה-RNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

ניתן להשתמש בדגימות לאחר מכן לניתוחי northern או למערכי שבבים (microarray). כדי להכין את ה-RNA לניתוח במערך שבבים, ראשית יש להמיס מחדש כל משקע MRNA שהתקבל מהשקעה ב-guanidine HCl ואתנול ב-650 µL של מים נקיים מ-RNase ולהעבירו למבחנה עם פקק הברגה. לאחר מכן, יש להוסיף 650 µL של פנול-כלורופורם חומצי, לערבב בעוצמה ב-vortex ולסובב בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך שתי דקות.

העבירו 500 µL מהפאזה המימית העליונה למבחנה חדשה. הימנעו משאיבת השכבה הבין-פאזית (interphase) כיוון שהיא מכילה DNA. כמו כן, יש להיזהר לא לשאוב פנול, שעלול לעכב את תגובת השעתוק ההפוך.

הסר הפרין מדגימת ה-RNA באמצעות שיקוע של ליתיום כלוריד. הוסף ליתיום כלוריד עד לריכוז סופי של 2 M והדגר את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 20- °C. למחרת, הפשר את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C וסבב בצנטריפוגה במהירות של 20,000 ×g.

צנטריפוגה בכוח הכבידה למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את העלייה (supernatant) ושטוף את המשקע באמצעות 80% ethanol בצנטריפוגה. שוב, הסר את העלייה, ייבש באוויר והשהה מחדש את המשקע ב-150 microliters של מים נקיים מ-RNA כדי להסיר כל משקע שארית של ליתיום כלוריד; בצע שוב עם 0.1 נפח של sodium acetate בריכוז של שלושה מולר ב-pH 5.3 ושלושה נפחים של 100% Ethanol, והדגר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות.

סבב במערך צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שטוף בזהירות את המשקע השקוף ב-80% ethanol ויבש באוויר. לבסוף, השהה את המשקע ב-25 µL של מים נקיים מ-RNA ושמור את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

את הצלחתו של פרוטוקול זה בהפרדת פרקציה המכילה מיטוכונדריה מרכיבים ציטוזוליים ניתן לבחון בצורה הטובה ביותר על ידי ביצוע אנליזת Northern ואנליזת Western על דגימות מהשלבים השונים של הבידוד. בדוגמה זו, הדגימות נלקחו לפני הפרקציונציה (או מהפרקציה הכוללת), מהפרקציה הציטוזולית ומהפרקציה המיטוכונדריאלית. אנליזת Northern בוצעה עבור ה-mRNAs הבאים, COB an RNA.

זה מתומלל בתוך המיטוכונדריה, CO1 הוא mRNA המקודד לחלבון המיובא למיטוכונדריה. ACT1 הוא mRNA המקודד לחלבון האקטין הציטוזולי, ו-SEC61 הוא mRNA המקודד לחלבון השוכן ברשתית התוך-פלזמית (ER). הפאנל התחתון מציג צביעת מethylene blue של ממברנת ה-northern, שבה מזוהים שני פסים בולטים של RNA, מסוג 25 s ו-18 s.

מכיוון ש-COB מתעתק בתוך המיטוכונדריה, האות שלו צריך להופיע באופן בלעדי במיטוכונדריה, כפי שנצפה במחקר זה. הופעה של COB בפרקציית הציטוזול תעיד על ליזיס של המיטוכונדריה במהלך ההכנה.

ACO one מקודד לחלבון המיובא למיטוכונדריה ונמצא בעיקר בפרקציה המיטוכונדריאלית. ACT one מקודד לחלבון ציטוזולי ולכן נמצא בעיקר בפרקציה הציטוזולית. נוכחותו של SEC 61 בפרקציה המיטוכונדריאלית מעידה על נוכחות של רכיבי ER בפרקציה זו.

אותות ה-RNAs מופיעים בשני השברים, דבר המעיד על נוכחות של ריבוזומים. ניתוח Western בוצע עבור החלבונים הבאים: POR1, חלבון ממברנה חיצונית של מיטוכונדריה hx, K1A, החלבון הציטוזולי CUE1, וחלבון ER ו-RPL39. כפי שצפוי, אות של POR1, חלבון ריבוזומלי, זוהה רק בשבר המיטוכונדריאלי.

אם היה מזוהה אות של POR 1 במקטע הציטוזולי, הדבר היה מרמז על התפרקות של רכיבי המיטוכונדריה במהלך ההכנה. כמו כן, כצפוי, hx K 1 זוהה רק במקטע הציטוזולי. האות החזק של CUE 1 במקטע המיטוכונדריאלי מעיד על כך שכמויות משמעותיות של חומר הקשור לרשתית התוך-פלזמית (ER) בודדו במקביל במקטע המיטוכונדריאלי.

ייתכן שזוהי תוצאה של המגעים הפיזיים הידועים בין ה-ER למיטוכונדריה. אות RPL 39 מופיע בשני השברים, מה שמאשר שוב את נוכחותם של ריבוזומים בשני השברים; השמטת שלב ההשבה מהפרוצדורה גורמת להיעלמות הריבוזומים משבר ה-M, דבר שישפיע על הקישור של mRNA למיטוכונדריה. בנוסף לאימות איכות ההפרדה בין הרכיבים המיטוכונדריאליים והציטוזוליים, חשוב לוודא שה-RNA או החלבונים בדגימות שלמים וכי לא חלו אובדנים משמעותיים של RNA או חלבונים במהלך הכנת הדגימה.

RNA וחלבונים שלמים צריכים להופיע כפסים נפרדים בניתוחים, כפי שמוצג כאן. עבור mRNA אחד של c CCP, המקודד לחלבון המיובא למיטוכונדריה, הופעתם של פסים קצרים נוספים או מריחות תעיד על דגרדציה. אובדן חמור יוביל להבדל משמעותי בין הכמות הכוללת לכמות האות היחסית, דבר שלא נצפה, בסיכום הדברים.

תוצאות אלו מתקפות פרוטוקול זה כשיטה יעילה לבידוד של mRNAs, ריבוזומים וחלבונים בהליך אחד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות ברמה הגנומית כגון RNA-Seq או אנליזה פרוטאומיקה כדי לזהות מאפיינים מרכזיים וייחודיים של תפקודים אורגנליים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן בידוד RNA הקשור למיטוכונדריה.