Name: בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: חקור בידוד mRNAs הקשורים למיטוכונדריה בשמרים לחקר תרגום מקומי. השיטה כוללת ליזה עדינה של תאים וסרכוז דיפרנציאלי לבידוד מיטוכונדריה. ניתוח צפוני מאמת את איכות ה-RNA המבודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים בני הזוג. ארז אליהו, דניאל מלמד, Ophry פינס ודורון רפפורט לעזרה והערות במהלך הקמתה של פרוטוקול זה. עבודה זו ממומנת על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק מספר 1193-1109).

1. מיטוכונדריה טיהור לשקול את גלולה של תאים. בערך 0.6 גרם מתקבלים מ100 תאים למ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 100-150 מיליליטר של תאי שמרים לOD 600 = 1-1.5 ב30 ° C במדיום גידול nonfermentable, כגון מצע גידול מבוסס גלקטוז, על מנת להעשיר למיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם מים מזוקקים כפולים ו צנטריפוגות שוב. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר DTT הצפת ל0.5 גרם של תאים. חשוב לטיפול בתאים עם סוכן צמצום כדי לשבור את קשרי דיסולפיד בתוך דופן התא, ובכך לשפר את הידרוליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 10 דקות ב30 ° C עם רעד עדין. בינתיים, שוקל zymolyase 6 מ&quot;ג לכל 1 גרם של תאים ולהשעות אותו בZymolyase הצפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקותטמפרטורת חדר לא וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר Zymolyase הצפת ל0.15 גרם של תאים. לא מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד OD 600 של 10 aliquot μl של התאים ב990 μl מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת Zymolyase (שלב 1.5) לתאים לhydrolyze פולימרים של גלוקוז בβ-1 ,3-גלוקן הקשרים וליצור spheroplasts. מהשלב הזה, צריך להיות כל הזמן spheroplasts בתמיסה איזוטונית כדי להימנע תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 15 דקות ב 30 מעלות צלזיוס (לפעילות אופטימלית של zymolyase) עם רעד עדין. כדי לוודא הידרוליזה של דופן התא ודור spheroplasts, לערבב 10 μl של התאים עם 990 μl מים. Spheroplasts צפוי lyse בשל הבדל האוסמוטי, ו600 OD צריכים להיות לפחות פי 10 פחות מהשווי שנקבע בשלב 1.9. אם לא, תמשיך דגירה עם zymolyase לעוד דקות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות דיסכרטיס supernatant, כגלולה עשוי להיות לא יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף spheroplasts עם Zymolyase הצפת וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts עם 100 בינוני שחזור מיליליטר. העבר spheroplasts לבקבוק Erlenmeyer דגירה במשך שעה 1 ב30 ° C עם רעד. צעד התאוששות זו הוא הכרחי שכן בתרגום טיפול Zymolyase נעצר ולוקליזציה mRNA מופרת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר CHX וspheroplasts העברת צינור חרוטי 50 מיליליטר precooled. בנוסף CHX חשוב להקפיא את העמותה &#39;הריבוזומים עם mRNAs. לפיכך, הריבוזומים תלויים עמותת mRNA עם מיטוכונדריה נשמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spheroplasts צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמיים עם קרה מניטול הצפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts עם 4 מיליליטר קר מניטול הצפת ולהעביר אותם לhomogenizer Dounce של 15 מיליליטר קיבולת מצויד בהולם בחוזקההעלי. בעדינות לשבור spheroplasts עם 15 משיכות ולהעביר lysate לצינור 13 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב1,500 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C עד גלולה גרעינים ותאים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את supernatant לצינור חדש. להפריש 1 מיליליטר (25%) של המדגם כמדגם unfractionated (מדגם &quot;סך הכל&quot;). העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4X LSB לניתוח כתם מערבי. משקע RNA משאר המדגם &quot;סך הכל&quot; (ראה פרוטוקול 3, ממטרים RNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה מיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant (~ 3 מיליליטר) לצינור חדש ולשמור אותו על קרח. זה שבריר &quot;Cytosolic&quot;. העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4x LSB לניתוח כתם מערבי. משקע RNA משאר המדגם &quot;Cytosolic&quot; (ראה Protocol 3, ממטרים RNA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 3 מיליליטר מניטול הצפת ו צנטריפוגות שוב ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור עם 3 מיליליטר מניטול הצפת. מדגם זה מכיל את המיטוכונדריה, ומכונה שבר &quot;מיטוכונדריה&quot;. העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4x LSB לניתוח כתם מערבי. </li></ol> 2. RNA חילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לכל נפח דגימה אחת של ז 8 guanidinium-HCl ושני כרכים של 100% אתנול. וורטקס ו דגירה של לפחות 2 שעות ב-20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant. להיזהר כמו גלולה עשויה להיות לא יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור עם 400 מיליליטר מים RNase ללא ולהעביר את הדגימה לצינור Eppendorf חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את הרנ&quot;א שוב על ידי הוספת 0.1 נפח של 3 acetat M נתרןדואר pH 5.2 ושני כרכים של 100% EtOH. וורטקס ו דגירה של לפחות 2 שעות ב-20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 20,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש גלולה ו resuspend במי RNase חינם. דגימות RNA החנות ב -80 ° C. דוגמאות יכולות לשמש לניתוח צפוני 19 או ניתוח microarray 18 (ראה פרוטוקול 3). </li></ol> 3. הכנת RNA לMicroarray ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend mRNA משלב 2.2 עם 650 מיליליטר מים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר כל דנ&quot;א או חלבוני שייר, להוסיף נפח שווה (650 מיליליטר) של פנול חומצי: כלורופורם (5:1, pH 4.7) ומערבולת במרץ. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 500 מיליליטר של השלב העליון (השלב ​​המימית) לצינור חדש. הימנע מלקחת את שלבי ביניים, מכיוון שהיא מכילה DNA. גם להיות זהיר של לקיחת פנול, אשר יכול לעכב את תגובת השעתוק לאחור. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם RNA מכיל כמות משמעותית של הפרין, שהוא מעכב חזק של reverse transcriptase. כך, RT-PCR או תיוג microarray זה צריך להסירו. הסר הפרין על ידי המשקעים LiCl: להוסיף LiCl לריכוז סופי של 2 מ &#39;ודגירת דגימות במשך הלילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הדגימות בשעה 4 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגות ב XG 20,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך בזהירות את supernatant לשטוף את הכדור עם 80% אתנול. שוב צנטריפוגות כמתואר בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, האוויר היבש וresuspend את הכדור ב150 מיליליטר מים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר כל LiCl שייר, לזרז שוב עם 0.1 נפח של 3 pH אצטט M נתרן 5.3 ו3 כרכים של 100% אתנול. לדגור על -20 ° C לפחות 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות שיא ל20 דקות ב 4 ° C. שטוף בזהירות את הכדור השקוף עם 80% אתנול ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspendגלולה עם מים RNase ללא 25 מ&quot;ל ולשמור את הדגימות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים לתיוג RNA והכלאה מתואר ב18,20. </li></ol>

<ol><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li>
<li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li>
<li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li>
<li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li>
<li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li>
<li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li>
<li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li>
<li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li>
<li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Saccharomyces+cerevisiae%2C+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+EMBO%22%5BJournal%5D)">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li>
<li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+biogenesis%3A+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
<li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUF+proteins%3A+repression%2C+activation+and+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li>
<li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins%3A+a+cotranslational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+RES%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria%3A+a+role+in+protein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li>
<li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li>
<li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+tracking+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li>
<li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li>
<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li>
<li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li>
<li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li>
<li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li>
<li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li>
<li>Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieder%2C+SE+%22Isolation+of+subcellular+fractions+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.+Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. 8, (2001).</li>
<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

התקדמות טכנולוגית בתחום ההדמיה הניבה כלים ברזולוציה גבוהה ללמוד לוקליזציה mRNA. כיום, ניתן למדוד את התנועה של אפילו מולקולת mRNA אחד בזמן בקנה מידה msec 23-26. עם זאת, גישות ביוכימיות מסורתיות, כפי שתואר לעיל, גם אינפורמטיבי ועדיפים במקרים מסוימים. בידוד ביוכימיים מאפשר טיהור של רפרטואר רחב של mRNAs וחלבונים, ולכן עדיף ללימודי הגנום כולו. בבידוד אחד, אחד יכול להשיג רמות ה-mRNA מספיק כדי לאפשר אפיון של אלפי גנים, או על ידי מערכי DNA או RNA-seq 18,27. במקביל, א...

תאי אוקריוטים מאורגנים בתאים נפרדים, בעלי פונקציות ספציפיות. כדי להשיג את תפקידה, כל תא מכיל מערך ייחודי של חלבונים שחיוניים לפעילותו. מנגנון אפשרי שבאמצעותו חלבונים אלה מתקרבים התא שלהם הוא על ידי 1,2 תרגום לשפה מקומי. בתהליך זה, החלבון מסונתז ביעד שלה על ידי הריבוזומים וmRNAs שנמצאים שם. בין היתרונות האפשריים של תרגום מקומי גדלו יעילות של מיקוד חלבון, ירידה בצורך במלווי חלבון, ומאפשר למנגנוני רגולציה ספציפי לאתר. כמו כן, mRNAs והריבוזומים מקומיים יכולים להיות מאגר מבודד של מכונות תרגום במקרים של מתח הסלולר, כאשר תרגום כללי הוא עצור. מיטוכונדריה הפכה בשנים האחרונות מודל מרכזי ללמוד תרגום מקומי. רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין, המתורגם בcytosol,ומיובא לאברון. קווים שונים של ראיות מצביעים על כך שרבים מחלבונים אלו מיוצרים בתהליך תרגום מקומי. בתחילה, לימודים במיקרוסקופ אלקטרונים וחלוקה ביוכימיים זוהו הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה 3-5. מחקרים אלה שבו ולאחר מכן אומתו in vivo על ידי עבודה על mRNAs הספציפי, שנמצאו להיות מיובאים רק ב6,7 אופן cotranslational. מחקרי הגנום של mRNAs שיתוף עם המיטוכונדריה חשפו כי חלק משמעותי של mRNAs הם מקומיים לסביבת מיטוכונדריה 8-10. חלקם של mRNAs אלה התאפיינו נוספים על ידי in vivo הקרינה שיטות, כגון דגים או mTAG 9,11. פרשנות ישר קדימה של עמותה זו היא שmRNAs אלה משמש כתבניות לתרגום לשפה מקומית. המנגנונים שבאמצעותם mRNAs אלה מתקרבים למיטוכונדריה אינם ידועים. תחומים noncoding (רוב significantl3 UTRs &#39;y) הוצג להיות מעורב בmRNA העמותה למיטוכונדריה 12. תחומים אלה עשויים לשמש כאתר קישור לחלבוני קושרי RNA אשר מתווכים התחבורה שלהם. מחקרים בשמרים גילו כי חבר של משפחת PUM של חלבונים (Puf3) תומך בעמותת mRNA עם מיטוכונדריה 8,13. תפקיד מתקבל על הדעת לPuf3, המבוסס על פונקציות של בני משפחה אחרים, הוא לעכב תרגום ואילו את ה-mRNA הוא הדרך 14. לפיכך, mRNAs עשוי להיות מועבר במעמד nontranslated, על ידי חלבוני RNA מחייבים כי אינטראקציה עם אזורי noncoding. לחלופין, גוף עבודות גדול מצביע על כך שהתחבורה מתרחשת בזמן שהחלבון הוא להיות מסונתזת. בפרט, מעכבי תרגום הוצגו להשפיע mRNAs עמותה 8,13. יתר על כן, תכונות תורגמו כגון אוגוסט, רצף של המיטוכונדריה מיקוד (MTS) או אזורי ORF הוצגו כדי לסייע בלוקליזציה 8,11,15. ch חלבון HSP70 משפחתיaperone וקולטן חלבונים על הקרום החיצוני מיטוכונדריה הוצגו גם כדי לתמוך בעמותת ה-mRNA, רומזים עוד כי תכונות מקודדות חלבונים חשובות ללוקליזציה mRNA 16. זה עולה בקנה אחד עם מודל שבו החלבון המתעוררים-הריבוזום משמש כאלמנט הכרה למיקוד מורכב mRNA-הריבוזום חלבונים למיטוכונדריה 17. תרגום מקומי ליד המיטוכונדריה נחקר על ידי שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים (כדי להמחיש הריבוזומים) 3, דגים 9, RNA הירוק (כדי לזהות mRNAs הספציפי) 11, וחלוקה ביוכימי (כדי לזהות שני RNA וריבוזומים) 10,18. בעוד השיטות לשעבר לזהות לוקליזציה in vivo ועשויות לאפשר הדמיה של דינמיקת תחבורה, האחרון מאפשר זיהוי של mRNAs שונים בניסוי יחיד. יתר על כן, לתחומים קידוד חלוקה ביוכימי או noncoding לא צריך להיות אלחזרתי אחורנית, ולכן ניתן להעריך התפקידים הספציפיים שלהם. חלוקה ביוכימיים שמשה בהצלחה במשך שנים רבות, לבידוד תרמי של תאים סלולריים שונים. מנהלים ומגבלותיו מבוססים היטב, ואפשר בקלות לשנות את הפרוטוקולים קיימים למטרות שונות. המכשור הדרוש הוא סטנדרטי במעבדות רבות, ולכן הוא בדרך כלל השיטה הראשונה לבחירה ללימוד לוקליזציה תאית. אנו מתארים פרוטוקול שהיה מותאם לבידוד של mRNAs בעוד הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה. פרוטוקול זה הוא אפוא אופטימלי לחקר גורמים המעורבים בתרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

<table><tbody><tr><td>תמצית</td><td></td><td></td><td></td>שמרים</tr><tr><td>BactoPeptone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td></td><td></td><td>אין לחסל את מדיום</td></tr><tr><td></td><td></td><td>גידול</td> הגלקטוז <td>להעשרת המיטוכונדריה, יש להשתמש בכל מקור פחמן שאינו ניתן לתסיסה, כגון מדיום גידול מבוסס גלקטוז מעוקר 1% תמצית שמרים, 2% BactoPeptone, 2% גלקטוז</td></tr><tr><td>0.1 M Tris-HCl, pH 9.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 מ"מ Tris-HCl, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 מ"מ מאגר</td><td></td><td></td> DTT <td>0.1 מ' TrisHCl pH 9.4, 10 מ"מ דיתיותרייטול (DTT). בצע טרי בכל פעם</td></tr><tr><td>1.2 M סורביטול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 מ"מ KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &#956; m filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase Buffer</td><td></td><td></td><td>1.2 M סורביטול, 4 מ"מ KH2PO4, 16 mM K2HPO4. סנן מאגר זה (0.2 &#956; m) ולשמור בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי</td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td></td><td></td><td>20,000 U/g</td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td><td>התאוששות מדיום גידול מבוסס גלקטוז בתוספת 1 M סורביטול</td></tr><tr><td>0.1 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסימיד (CHX)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.6 M מניטול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"מ MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ג/מ"ל הפרין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 מ"מ פניל-מתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> מניטול <td>0.6 מ' מניטול, 30 מ"מ Tris-HCl pH7.6, 5 מ"מ MgAc, 100 מ"מ KCl. הוסף טרי: 0.5 מ"ג/מ"ל הפרין, 0.1 מ"ג/מ"ל CHX ו-1 מ"מ (PMSF). סנן את המאגר הזה והשתמש בו קר כקרח</td></tr><tr><td>8 M גואנידיניום-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% ו-70% אתנול (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M נתרן אצטט, pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>מלאי LiCl</tr><tr><td>250 מ"מ Tris HCl pH 6.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-מרקפטואתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 מ"מ Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% גליצרול, 20% &#946;-מרקפטואתנול, ו-0.02% ברומופנול כחול</td></tr><tr><td>הומוגנייזר Dounce בקיבולת 15 מ"ל מצויד בעלי</td><td></td><td></td><td></td> צמודים</tr></tbody></table>

בידוד של mrnas הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין וצריך להיות מיובא לתוך אברון. יבוא עלול להתרחש בזמן שהחלבון מסונתז ליד המיטוכונדריה. תמיכה באפשרות זו נגזר ממחקרים שנעשה לאחרונה, שבו mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה הוצגו להיות מקומי כדי קרבת מיטוכונדריה. יחד עם הפגנות קודמות של העמותה &#39;הריבוזומים עם הקרום החיצוני, תוצאות אלו מצביעות על תהליך תרגום מקומי. תרגום מקומי כזו עשויה לשפר את יעילות יבוא, לספק אתרי רגולציה ייחודיים ולמזער מקרים של ביטוי מחוץ לרחם. מגוון שיטות שימשו כדי לאפיין את הגורמים ומרכיבים אשר מתווכים תרגום מקומי. תקן בין אלה הוא חלוקה subcellular על ידי צנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה יש את היתרון של בידוד של mRNAs, ריבוזומים וחלבונים בהליך אחד. אלה אז יכולים להיות מאופיינים על ידי מולקולריים ודו שוניםשיטות ochemical. יתר על כן, ניתן ליישם שיטות transcriptomics ופרוטאומיקה לחומר וכתוצאה מכך, ובכך לאפשר לתובנה הגנום כולו. הניצול של שמרי כאורגניזם מודל למחקרים מסוג זה יש את היתרונות של מהירות, עלויות ופשטות. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים וזני מחיקה זמינים להקל על אימות של גורמי מועמד.

פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של חלק המכיל את המיטוכונדריה מרכיבי cytosolic. הדרך הטובה ביותר לבחון את הצלחתה היא לבצע ניתוח צפוני וניתוח מערבי (איור 1) לדגימות מצעדי הבידוד השונים. שלושה פרמטרים לאיכות הבידוד נגזרים מניתוחים אלו. ראשית, אם RNA או חלבונים בדגימות הם שלמים - אלו יזוהו כלהקות שונות בניתוחים. אירועי השפלה יניעו את המראה של, להקות קצרות נוספות או מריחות. שנית, השוואת האותות מכל שלב עם האות מהקלט (כלומר סה&quot;כ) מספקת מידע חשוב לגבי הפסדים במהלך ה...

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד מיטוכונדריה הקשורות ל-mRNAs בתהליך תרגום. זאת משיגים תחילה על ידי קציר תאי שמרים שגודלו בתנאים המעשירים מיטוכונדריה. השלב השני הוא ליסיס עדין של התאים בנוכחות cycloheximide.בשלב הבא, המיטוכונדריה מופרדות מהמרכיבים המסיסים באמצעות סנטריפוגציה דיפרנציאלית. השלב הסופי הוא מיצוי RNA מהמיטוכונדריה וממדגמי ביקורת. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח northern כדי להראות את הניקיון והאיכות של ה-RNA הקשור למיטוכונדריה.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד סוגים רבים של RNA בהכנה אחת. לכן, ניתן לבצע ניתוח השוואתי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון מיקוד תוך-תאי ותפקוד אורגנלה.בפרוצדורה זו, מיטוכונדריה יטוהרו מ-100 עד 150 ml של תאי שמרים שגודלו עד OD 600 של 1 עד 1.5 בטמפרטורה של 30 °C במצע גידול שאינו תוסס. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השלך את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את המשקע במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן סבב שוב בצנטריפוגה.לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), שקלו את משקע התאים. בדרך כלל מתקבלים כ-0.6 גרם מ-100 מיליליטר של תאים. השביו (resuspend) את המשקע במיליליטר אחד של DTT buffer לכל 0.5 גרם תאים.חשוב לטפל בתאים באמצעות חומר מחזר כדי לשבור את קשרי הדיסולפיד בדופן התא, ובכך לשפר את

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

המיטוכונדריה המתמחה הריבוזומים זה שונה מהקבצים המקבילים בקטריאליים ו cytoplasmic. הנה אנחנו מראים כיצד ניתן להשיג mitoribosomes שלהם בתא הילידים HEK תאים. השיטה כוללת בידוד של המיטוכונדריה מתאי ההשעיה ולטיהור הסוגר mitoribosomes.

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

עבודה זו מסבירה כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות שיטה ביוליסטית. אנו גם מראים כיצד לבחור ולטהר את הטרנספורמנטים וכיצד להציג את המוטציה הרצויה במיקום המטרה בתוך הגנום המיטוכונדריאלי.

טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

חקור בידוד mRNAs הקשורים למיטוכונדריה בשמרים לחקר תרגום מקומי. השיטה כוללת ליזה עדינה של תאים וסרכוז דיפרנציאלי לבידוד מיטוכונדריה. ניתוח צפוני מאמת את איכות ה-RNA המבודד.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

גלה סרטונים נוספים