מודלים DNBS / TNBS קוליטיס: מתן תובנות מחלת מעי דלקתי והשפעות של התזונה שומן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציע שיטה חלופית וזולה לחקר מחלות מעי דלקתיות או IBD באמצעות חומצה זונית DY ניטרו בנזן או DNBS. זה מושג על ידי מתן DNBS תוך רקטלי ראשון באמצעות החדרה עדינה לפי הטבעת. בשלב השני, קטעי רקמות של המעי הגס נרכשים לבדיקה היסטולוגית ולהערכת פעילות המיאלו פרוקסידאז של הרקמות המאותגרות של DNBS, בסופו של דבר ניתן להעריך את ההשפעות של שמנים תזונתיים על ירידה במשקל וקוליטיס בשיטות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות כאחד.

היתרון העיקרי של עניין זה על פני שיטת הנתרן הסולפט הקיימת של דקסטרון הוא ששיטת DNBS קלה לביצוע, פחות יקרה וניתנת לשחזור מאוד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של IBD, כגון מהם התפקידים של מתח ודיכאון בהישנות של IBD, או מהם המנגנונים הבסיסיים בפגיעה ותיקון מעיים להתקנה רקטלית של DNBS בעכברים התחל בחיבור מזרק מיליליטר אחד למחט בגודל 19. מצויד בצנתר פוליאתילן 50 ואז שואב DNBS טריים שהוכנו לתוך הצנתר.

לאחר מכן, מרחו ג'ל דמעות על עכבר מורדם והפעילו לחץ עדין עם קצות האצבעות על הקצה האחורי של החיה כדי להסיר כל צואה הקיימת במעי הגס הדיסטלי. כעת הזריק כמות קטנה של תמיסת DNBS כדי לשמן את המעי הגס להחדרה קלה יותר תוך החדרה עדינה של הצנתר תוך פי הטבעת כשלושה עד ארבעה סנטימטרים. לאחר שהקטטר נמצא במקומו, הזרקו 100 מיקרוליטר של DNBS או נפח שווה של 50% אתנול עבור חיות הביקורת.

לאחר מכן מקם את ראש החיה כלפי מטה למשך 90 שניות כדי למנוע אובדן של הריאגנטים. לאחר מתן DNBS, האכילו את בעלי החיים ב-8% מי סוכרוז ב-0.2% מלח כדי למנוע התייבשות במהלך השבוע הראשון. ניטור קפדני של היומיום של בעל החיים לירידה במשקל, התייבשות או מצוקה למשך הניסוי שנועד לנקודת הזמן הרצויה.

לאחר אתגר DNBS, פתח את חלל הבטן של החיה המורדמת והסר את כל המעי הגס. ואז פתח את המעי לאורך. יש להבחין בכיבים ריריים מקרוסקופיים כשניים עד שלושה סנטימטרים פרוקסימליים מהקצה הדיסטלי של המעי הגס.

אסוף חתכים של 0.5 סנטימטר קרוב לאתר הנזק המקרוסקופי המקסימלי בחיות הניסוי ובמקטעים של המעי הגס מהמיקומים האנטומיים המתאימים מחיות הביקורת. לאחר מכן יש להקפיא 0.5 סנטימטרים מקטע אחד של ביקורת ו-1D NBS בחנקן נוזלי להערכת פעילות מיאלו פרוקסידאז ולתקן את החלקים האחרים בפורמין ניטרלי של 10% בן לילה או ניתוח היסטולוגי. למחרת בבוקר, שטפו את הטישו הקבוע של פורמלין עם אתנול 70% והניחו בקסטה כדי לשלוח למתקן היסטולוגי כדי להטמיע בפרפין ולצבוע בהמטין ואואין לצורך ניקוד היסטולוגי.

לאחר מכן ציין לפחות שלושה קטעי רקמה מכל חיה תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את ציוני הנזק ההיסטולוגי עבור כל קבוצה כדי לבחון את פעילות המיאלו פרוקסידאז של הרקמות המאותגרות של DNBS. ראשית הומוגניזציה של רקמות הבקרה והניסוי הקפואות במאגר ההומוגניזציה של מיאלו פרוקסידאז כדי לתת מקטע מעי גס של 50 מיליגרם למיליליטר של תרחיף מאגר הומוגניזציה. לאחר מכן יש לצרף את התמיסה ההומוגניסטית למנות מיליליטר אחת ולצנטריפוגה למשך שתי דקות בטמפרטורה של 10, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר מכל אליקוט לקובטות בודדות והוסיפו 2.9 מיליליטר PBS בתוספת IDE, דיהידרוכלוריד ומי חמצן ערבוב נמרץ. לבסוף, מדוד את קצב הספיגה באמצעות ספקטרופוטומטר ב-460 ננומטר. בעקבות אתגר תוך רקטלי עם DNBS כפי שהודגם זה עתה.

ירידה משמעותית במשקל נצפתה על ידי 48 שעות בחולדות בתוספת שמן דגים או קנולה, ועל ידי 72 שעות בחולדות בתוספת שמן חריע. הירידה המקסימלית במשקל שנצפתה מתרחשת לאחר 48 שעות בשמן דגים, בחולדות שקיבלו תוסף, וב-72 שעות בחולדות. בתוספת שמן קנולה או חריע.

העלייה במשקל התחדשה לאחר 72 שעות וחמישה ימים לאחר מתן DNBS, הקבוצות שטופלו בשמן דגים ושמן חריע הראו משקל גוף דומה לערכי הבסיס שלהן. חולדות ביקורת שקיבלו תוספת של שמנים תזונתיים ואותגרו עם אתנול תוך פי הטבעת עלו במשקל בהתמדה לאורך כל תקופת המחקר של חמשת הימים. הנזק למעי שנגרם על ידי DNBS יכול להיות נרחב.

עם זאת, אזור הנזק המקסימלי ממוקם בדרך כלל בששת הסנטימטרים הדיסטליים של המעי הגס בחולדות ובשלושה סנטימטרים הדיסטליים בעכברים. בהערכה היסטולוגית מדוקדקת יותר, נצפתה פגיעה אפיתל נרחבת, כולל היווצרות כיבים, חדירת נויטרופילים ולימפוציטים, דלדול ריר ובצקת. למרות שהסימנים ההיסטולוגיים הללו של דלקת ונזק לרקמות ניכרים בכל שלוש הקבוצות שקיבלו תוספי שמן תזונתיים באתגר עם DNBS, הנזק החמור ביותר נראה בקבוצת שמן החריע ואחריה קבוצת שמן הקנולה.

ואילו חולדות בקבוצת שמן הדגים מדגימות פגיעה מינימלית באפיתל וחדירה מוגבלת של תאים דלקתיים לתוך הרירית. ניתן לכמת את ההבדלים בנזק ההיסטולוגי בין הדגימות כדי לאפשר השוואה טובה יותר בין הקבוצות. הגרף ממחיש את ציוני הנזק ההיסטולוגי עבור שלוש קבוצות השמנים התזונתיים במהלך קוליטיס DNBS.

כפי שנצפה בקטעים המוכתמים h ו-e, הקבוצה שקיבלה תוספת שמן חריע מציגה את היקף הנזק הגדול ביותר ואחריה קבוצת שמן הקנולה. בעוד שקבוצת שמן הדגים מציגה את כמות הנזק הנמוכה ביותר, ניתן לבחון את מידת חדירת התאים הדלקתיים, במיוחד של נויטרופילים, על ידי ביצוע בדיקת פעילות מיאלו פרוקסידאז. כצפוי מציוני הנזק ההיסטולוגי.

הערכת פעילות המיאלו פרוקסידאז במעי הגס של חולדות ביום החמישי לאחר החשיפה ל-DNBS מגלה עלייה בפעילות בכל שלוש הקבוצות עם פעילות המיאלו פרוקסידאז הגדולה ביותר שנצפתה בקבוצת שמן החריע, ואחריה קבוצת שמן הקנולה וקבוצת שמן הדגים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להרדים עכברים קלות ולייעל את מינוני ה-DNBS לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות המעי הדלקתיות לחקור מנגנונים השולטים בדלקת מעיים במודלים של מחלות מעי דלקתיות בבעלי חיים.

אל תשכח שעבודה עם DNBS עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש ללבוש תמיד אמצעי זהירות כגון ביגוד מגן, כפפות, משקפי מגן וטיפולי פנים בזמן הכנת התמיסה.