מודלים DNBS / TNBS קוליטיס: מתן תובנות מחלת מעי דלקתי והשפעות של התזונה שומן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציע שיטה חלופית וזולה לחקר מחלה דלקתית של המעי או IBD באמצעות DNBS (2,4-dinitrobenzene sulfonic acid). הדבר משיג תחילה על ידי מתן DNBS באופן תומי-פישתי באמצעות הכנסה עדינה לפישבון. בשלב השני, נלקחים חתכי רקמה מהמעי הגס לצורך סריקה היסטולוגית ולהערכת פעילות המיאלופרוקסידאז ברקמות שנחשפו ל-DNBS; לבסוף, ניתן להעריך את השפעותיהם של שמנים תזונתיים על איבוד משקל ועל קוליטיס באמצעות שיטות מאקרוסקופיות ומיקרוסקופיות.

היתרון המרכזי של גישה זו על פני שיטת ה-dextron sodium sulfate הקיימת הוא ששיטת ה-DNBS קלה לביצוע, זולה יותר ובעלת הדירות גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המחקר של IBD, כגון מהם תפקידיהם של סטרס ודיכאון בחזרת ה-IBD, או מהם המנגנונים העומדים בבסיס הפגיעה והתיקון במעי. עבור התקנה רקטלית של DNBS בעכברים, התחל בחיבור מזרק של 1 mL למחט gauge 19. צייד אותו בקטטר polyethylene 50, ולאחר מכן שאב DNBS שהוכן טרי לתוך הקטטר.

בשלב הבא, מרחו ג'ל דמעות לעכבר הרדומ והפעילו לחץ עדין בקצות האצבעות על הקצה האחורי של החיה כדי להסיר צואה שנמצאת במעי הגס הדיסטלי. כעת, הזריקו כמות קטנה של תמיסת DNBS כדי לשמן את המעי הגס להחדרה קלה יותר, תוך כדי החדרה עדינה של הקתטר באופן תו-רקטלי לעומק של כ-3 עד 4 סנטימטרים. לאחר שהקתטר במקומו, הזריקו 100 µL של DNBS או נפח שווה של 50% ethanol עבור חיות הביקורת.

לאחר מכן, יש להניח את בעל החיים במצב ראש למטה למשך 90 שניות כדי למנוע איבוד של הרכיבים. לאחר מתן DNBS, יש להאכיל את בעלי החיים במי סוכרוז בריכוז 8% בתוך תמיסת saline בריכוז 0.2% למניעת התייבשות במהלך השבוע הראשון. יש לעקוב בקפידה אחר בעלי החיים מדי יום כדי לזהות ירידה במשקל, התייבשות או מצוקה לאורך כל הניסוי עד לנקודת הזמן הרצויה.

לאחר אתגר ה-DNBS, פתח את חלל הבטן של החיה שהורגזה והוצא את המעי הגס כולו. לאחר מכן, פתח את המעי לאורכו. יש לצפות באולקוסים ריריים מאקרוסקופיים במרחק של כשני עד שלושה סנטימטרים פרוקסימלית מהקצה הדיסטלי של המעי הגס (colon).

אספו מקטעים של 0.5 סנטימטר באופן פרוקסימלי לאתר הנזק המקרוסקופי המקסימלי בבעלי החיים הניסיוניים, ומקטעים של המעברון (colon) מהמיקומים האנטומיים המקבילים בבעלי החיים של קבוצת הביקורת. לאחר מכן, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) של מקטעים באורך 0.5 סנטימטר מדגימה אחת של ביקורת ומדגימה אחת שטופלה ב-1D NBS בחנקן נוזלי לצורך הערכת פעילות myelo peroxidase, וקבעו את שאר המקטעים בפורמלין 10% בבפר רב-ערכי (neutral buffered formalin) למשך לילה לצורך אנליזה היסטולוגית. למחרת בבוקר, שטפו את הרקמות שקובעו בפורמלין באתנול 70% והניחו אותן בקסנטה לשליחה למעבדה להיסטולוגיה לצורך הטמעה בפרפין וצביעה ב-hematin ו-eoin לצורך דירוג היסטולוגי.

לאחר מכן, דרגו לפחות שלושה חתכי רקמה מכל בעל חיים תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע את ציוני הנזק ההיסטולוגי עבור כל קבוצה. כדי לבחון את פעילות ה-myelo peroxidase ברקמות שנחשפו ל-DNBS, ראשית הומוגניזרו את רקמות הביקורת והרקמות הניסיוניות שהוקפאו במהירות (snap frozen) בבופר הומוגניזציה של myelo peroxidase, לקבלת תרחיף של 50 milligram של מקטע מעי הגס ל-milliliter של בופר הומוגניזציה. לאחר מכן, חלקו את התמיסה ההומוגנית למנות של one milliliter וסבבו אותן בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-10,000 ×g ובטמפרטורה של four degrees Celsius.

בשלב הבא, העבירו 100 µL מכל מנה לקובטות נפרדות והוסיפו 2.9 mL של PBS מועשר ב-IDE, dihydrochloride ומי חמצן תוך כדי ערבוב נמרץ. לבסוף, מדדו את קצב הבליעה באמצעות ספקטרופוטומטר באורך גל של 460 nm. לאחר אתגר תומי רקטלי עם DNBS כפי שהודגם זה עתה.

ירידה משמעותית במשקל נצפתה בתוך 48 שעות בחולדות שקיבלו תוספת של שמן דגים או שמן קנולה, ובתוך 72 שעות בחולדות שקיבלו תוספת של שמן סאפלורה. הירידה המקסימלית במשקל נצפתה בתוך 48 שעות בחולדות שקיבלו תוספת של שמן דגים, ובתוך 72 שעות בחולדות שקיבלו תוספת של שמן קנולה או סאפלורה.

עליית המשקל התחדשה לאחר 72 שעות, וחמישה ימים לאחר מתן DNBS, קבוצות הטיפול בשמן דגים ובשמן פרגילו הפגינו משקלי גוף הדומים לערכי הבסיס שלהן. חולדות ביקורת שקיבלו תוספת של השמנים התזונתיים ונחשפו לאתגר של אתנול תוך-רקטלי עלו במשקל באופן עקבי לאורך כל תקופת המחקר בתחמישה ימים. הנזק המעי המגורם על ידי DNBS עשוי להיות נרחב.

עם זאת, אזור הנזק המקסימלי ממוקם בדרך כלל בששת הסנטימטרים הדיסטליים של המעי הגס בחולדות ובשלושת הסנטימטרים הדיסטליים בעכברים. בבחינה היסטולוגית מעמיקה יותר, נצפה פגיעה אפיתליאלית נרחבת, הכוללת היווצרות של כיבים, חדירה של נויטרופילים ולימפוציטים, דלדול ברירית ובצקת. אף שסימנים היסטולוגיים אלו של דלקת ונזק רקמתי ניכרים בכל שלוש הקבוצות שקיבלו תוסף שמן תזונתי לאחר חשיפה ל-DNBS, הנזק החמור ביותר נראה בקבוצת שמן הסאפלוורה, ואחריה קבוצת שמן הקנולה.

בעוד שחולדות בקבוצת שמן הדגים מראות פגיעה אפיתליאלית מינימלית וחדירה מוגבלת של תאים דלקתיים לתוך ה-mucosa cosa. ניתן לכמת את ההבדלים בנזק ההיסטולוגי בין הדגימות כדי לאפשר השוואה טובה יותר בין הקבוצות. הגרף ממחיש את ציוני הנזק ההיסטולוגי עבור שלוש קבוצות השמנים התזונתיים במהלך colitis מסוג DNBS.

כפי שנצפה בחתכים שנצבעו ב-h and e, הקבוצה שקיבלה תוסף של שמן כרתי exhibits את מידת הנזק הגדולה ביותר, ואחריה קבוצת שמן הקנולה. בעוד שקבוצת שמן הדגים מראה את מידת הנזק הנמוכה ביותר, ניתן לבחון באופן מעמיק יותר את היקף חדירת תאי הדלקת, ובמיוחד נויטרופילים, באמצעות ביצוע בדיקת פעילות מיאלופרהוסידאז. תוצאה זו תואמת את ציוני הנזק ההיסטולוגיים.

הערכת פעילות המיאלו-פרוקסידאז (myelo peroxidase) במעי הגס של חולדות בחמישה ימים לאחר חשיפה ל-DNBS מעלה עלייה בפעילות בכל שלוש הקבוצות, כאשר פעילות המיאלו-פרוקסידאז הגבוהה ביותר נצפתה בקבוצת שמן הכרטם, ולאחריה קבוצת שמן הקנולה וקבוצת שמן הדגים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להרדימ את העכברים קלות ולבצע אופטימיזציה למינוני ה-DNBS לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות מעי דלקתיות לבחון מנגנונים השולטים בדלקת מעיים במודלים של IBD בבעלי חיים.

אל תשכחו שעבודה עם DNBS עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון ביגוד מגן, כפפות, משקפי מגן ומסכות פנים בעת הכנת התמיסה.