Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים
25 במרץ 2014
מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.
המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת את הקישור של פפטידים קצרים לחלבוני MHC two חיסוניים אנושיים באמצעות בדיקת לוח 384 בארות בעלת תפוקה גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע בדיקות קישור תחרותיות במופע תמיסתי עם הפפטידים הרלוונטיים. בשלב השני, קומפלקסי הפפטיד MHC two שהגיעו לשיווי משקל נלכדים באמצעות נוגדן anti MHC two המקובע על לוחות ELISA בעלי קישור גבוה.
בשלב הבא, הקומפלקסים שנלכדו מודגריים עם streptavidin המסומן באופיום, ולאחר מכן ה-streptavidin שאינו קשור נשטף והאופיום שנלכד מופעל. לבסוף, ניתן להשתמש בפלואורומטריה בעת רH (time resolved fluorometry) כדי לכמת את רמות ה-MHC two של הפפטיד השליטה שנלכד. שיטה זו יכולה לספק תובנות ראשוניות לגבי הפוטנציאל האימונוגני של חלבוני מטרה.
שיטה זו שימושית במיוחד לתיקוף של תוצרי חיזויים ב-in silico. התחילו את הפרוצדורה על ידי הוספת 25 µL של תמיסת נוגדן L 2 43 שדוללה טרי לכל באער של פלטת ELISA לבנה עם קישוריות גבוהה בעלת 384 באערים. אטמו את הפלטה באמצעות סרט פוליאסטר והדגירו אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, התחילו עם תמיסת מלאי של 10 mM של כל בדיקה.
הכינו את סדרת המהלולים הבאה של פפטיד ו-DMSO ואת בופר ציטראט-פוספט באמצעות 3 פלטות פוליפרופילן של 84 בארות. שימו לב כי פלטת פוליפרופילן מלאה של 84 בארות דורשת שלוש פלטות EIA נפרדות כפי שמוצג. לאחר מכן, מהלו את תמיסות המלאי הנבחרות של MHC two לריכוז של 101 nano molar בבופר תגובה באמצעות מבחנה קונית של 15 milliliter.
לאחר מכן, דללו את הפפטיד הבקרה מ-20 micromolar ביחס של 1:100 בתוך תערובת ה-MHC two master mix שהוכנה טרי, והוסיפו 21.5 microliters של ה-MHC two master mix עם הפפטיד הבקרה לבאר הבקרה החיובית בלוח הפוליפרופילן בעל 384 בארות. הוסיפו את ה-MHC two master mix המכיל את הפפטיד הבקרה לכל אחת מדילולות הפפטיד הנבדקות ביחס של 1:1 כדי ליצור גם בשלב זה את תגובת הקשירה. לבסוף, אטמו את תגובת הקשירה באמצעות סרט פוליאסטר והדגירו את הלוח למשך 12 עד 24 שעות באינקובטור ללא בקרת carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ללא ניעור.
ביום למחרת, יש לדלל את בארות תגובת הקישור בפלטת ה-384 בארות ביחס של אחד לאחד עם בופר נטרול. לאחר מכן, יש לשטוף את פלטת ה-ELISA שלוש פעמים עם 60 µL של PBS 0.05% לכל בארה. בשלב הבא, יש להעביר 25 µL מכל תמיסת תגובת קישור מנוטרלת מפלטת ה-384 בארות, בשלוש חזרות, אל פלטת ה-384 המצופה בנוגדנים.
בצעו סמיכה (coating) של פלטת ה-ELISA ולאחר מכן דגרו את פלטת ה-ELISA כשהיא מכוסה בנייר פוליאסטר בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. לאחר הדגירה, שטפו את פלטת ה-ELIZA שלוש פעמים כפי שהודגם כעת, ולאחר מכן הוסיפו 25 µL של strep din opium מדולל טרי לכל באר. דגרו את הפלטה כשהיא מכוסה בנייר פוליאסטר, בחושך ובטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
במהלך הדגירה, יש להביא 10 מיליליטר של תמיסת הגברה לכל פלטה לטמפרטורת החדר, גם כן בחושך. לאחר שעה, שטפו את פלטת ה-ELISA כפי שהודגם, ולאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת הגברה לכל באר והדגירו את הפלטה כשהיא מכוסה בסרט פוליאסטר למשך 10 עד 15 דקות בחושך. לבסוף, קראו את הפלואורסצנציה באמצעות קורא פלטות פלואורסצנטי בעל רזולוציית זמן (time resolved) עם הגדרות אופטימום. בניסוי מייצג זה, רצף פפטיד בוגר של enterobacter Cloe P nine nine beta-lactamase נותח כדי לאתר קושרים פפטידיים משוערים לאלל MHC two.
זוהו 117 פפטידים עבור DRB1*15:01 עם שארית עוגן P1 חובה בעמדה 1, הנדרשת לקשירה ל-MHC class II, בסף של 5% בלבד. פפטידים עם ציונים הגבוהים או השווים ל-2.6 הם ככל הנראה קושרים. לפיכך, בסף של 5% בלבד, 11 הפפטידים המובילים נחזים כקושרים ל-MHC class II DRB1*15:01.
פאנל מייצג של אפיתופים חזויים נבחר לניתוח במבחן קישור MHC two זה. מקטעי פפטידים של Beta-lactamase בני 15 שאריות סונתזו כימית כך שאפיתופים פוטנציאליים של nonamer של MHC two היו מוטמעים בתוך מקטעי החלבון הסינתטיים שלהם. לאחר מכן נותחה יכולתם של פפטידים סינתטיים אלה להתחרות עם פפטיד בקרה B של myelin basic protein הביוטינילי לקישור ל-MHC two DRB 1 15 0 1, כפי שהודגם זה עתה.
עקומות קישור תחרותיות עבור הפפטידים הסינתטיים מוצגות כאן. ערכי IC 50 חושבו באמצעות התאמת נתונים שעברו טרנספורמציית לוגריתם, תוך שימוש בפונקציית התאמה לא-ליניארית של קישור תחרותי לאתר אחד בתוכנת Prism. כפי שמוצג בטבלה ובגרף, הפפטידים חולקו באופן טבעי לשלוש קבוצות: קושרים חזקים עם IC 50 של פחות מ-1 µM, קושרים בינוניים עם IC 50 הגבוה או שווה ל-1 µM אך נמוך מ-100 µM, וקושרים חלשים עם IC 50 הגבוה או שווה ל-100 µM לאחר פיתוחם.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי האימונולוגיה המולקולרית ותכנון טיפולים ביו-תרפויטיים לחקור באופן מעמיק יותר את אירועי הזיהוי המולקולרי המרכזיים העומדים בבסיס תגובות חיסוניות נגד חלבונים במטופלים בני אדם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקת קישור פפטיד-MHC II בתסריף גבוה המשתמשת בלוחיות בעלות 384 בארות כדי לכמת את הקישור של פפטידים קצרים לחלבונים של MHC II אנושיים. שיטה זו נועדה לספק תובנות מהירות לגבי זיהוי אפיתופים אימונוגניים והיא שימושית במיוחד בתהליכי דה-אימוניזציה של חלבונים ובפיתוח חיסונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- פיתוח חיסונים
- בדיקות ביוכימיות
רקע
- מולקולות MHC II אנושיות ממלאות תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- זיהוי Epitopes אימונוגניים הוא חיוני לתכנון חיסונים.
- בדיקות בקיבולת גבוהה (High throughput) יכולות להאיץ את תהליך המחקר.
- קיים צורך בשיטות יעילות מבחינת עלות בתחום האימונולוגיה.
מטרת המחקר
- לכימות קישור של פפטידים לחלבוני MHC II.
- להקל על זיהוי של אפיתופים אימונוגניים.
- לתמוך במאמצים של תכנון ופיתוח חיסונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקות קשירה תחרותיות בשלב התמיסה עם פפטידים.
- לכידה של קומפלקסים של פפטיד-MHC II באמצעות נוגדנים ל-MHC II.
- דגירה עם סטפטאוואידין המסומן באופיום.
- כימות באמצעות פלואורומטריה בעת רזולוציה של זמן (time-resolved fluorometry).
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מספקת נתונים כמותיים על קישור peptide-MHC II.
- היא מאפשרת הערכה של הפוטנציאל האימונוגני של פפטידים.
- השיטה ניתנת להרחבה (scalable) ויעילה מבחינה כלכלית.
- התוצאות יכולות להנחות אסטרטגיות עתידיות לפיתוח חיסונים.
מסקנות
- הבדיקה המתוארת היא כלי בעל ערך למחקר אימונולוגי.
- היא משפרת את ההבנה של אינטראקציות בין פפטידים ל-MHC.
- הגישה עשויה להוביל להתקדמות בתכנון חיסונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות קישור ל-MHC II בתפוקה גבוהה מאפשרות הערכה כמותית ומהירה של אימונוגניות פפטידים, ותומכות באופן ישיר בתהליכי דאימוניזציה (deimmunization) ובתכנון חיסונים בשלבים מוקדמים. על ידי מעבר לפורמט של 384 בארות ואוטומציה של טיפול בנוזלים, שיטה זו מגבירה את התפוקה ואת ההדירות תוך הפחתת עלויות ריאגנטים, ובכך מקלה על תיקוף יעדים (target validation) ובחירה ראשונית של מועמדים בפורטפוליו. גישה זו מאפשרת לצוותי מו"פ לבחון ביעילות מועמדים לאפיטופים ולתעדף מובילים בביטחון חיזוי גבוה יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של אינטראקציות בין פפטידים ל-MHC II לצורך הערכת סיכון לאימונוגניות.
- תומך בתיקוף תפקודי של תחזיות Epitope מסוג in silico, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
- מקל על מיון מהיר של פפטידים מועמדים עבור תהליכי דה-אימוניזציה (deimmunization) או פיתוח חיסונים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק נתוני קישור סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור מספר פפטידים ואללים של MHC II במקביל.
- מכין מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף לבדיקה ואופטימיזציה של אימונוגניות בשלבים הבאים.
- מאפשר הערכה בעלת תפוקה גבוהה ובקנה מידה משתנה של ספריות פפטידים, עם פלטי IC50 כמותיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את בחירת הפפטידים לסיכון האימונוגניות התרגומית על ידי כימות ספי binding thresholds הרלוונטיים לאללים של MHC II אנושיים.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת נתוני binding כמותיים ומהימנים.
- מפחיתה סיכונים בקידום מועמדים על ידי סיווג הפפטידים לקושרים חזקים, בינוניים או חלשים על בסיס ערכי IC50.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו משתלבת ברצף השלב שבין הגילוי למסלול הפרה-קליני, ומגשרת בין חיזוי in silico, תיקוף ניסויי והערכת סיכונים תרגומית עבור אימונוגניות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת נתונים כמותיים על קישור לבדיקת היפותזות של אימונוגניות ולהבהרת סיכוני epitope.
- סריקה: מציעה מוכנות לבדיקות בעלות תפוקה גבוהה וניתנות לשחזור להערכה של ספריות פפטידים.
- אנליזה: מייצרת ערכי IC50 ועקומות קישור המאפשרות השוואה ישירה של מועמדים פפטידיים.
- מחקר תרגומי: מתאימה את בחירת הפפטידים לפרופילי קישור של אללי MHC II רלוונטיים לבני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה להערכת אימונוגניות שוטפת על פני תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת האפיטופים ומפחית את הסיכון לאימונוגניות בשלבים מאוחרים.
- ערך תפעולי: משפר את תפוקת הבדיקה, את השחזוריות ואת היעילות העלייתית באמצעות אוטומציה ומיניאטוריזציה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי המשך התהליך (go/no-go) ותיעדוף תיקים בהתבסס על מדדי אימונוגניות כמותיים.
- השפעה על תיק המוצרים: תומך בקידום מותאם סיכונים ובדה-תיעדוף של מועמדים בסיכון גבוה בשלבים מוקדמים של הפיתוח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונולוגיה, כימיה של פפטידים ופיתוח בדיקות כמותיות.
- נדרשת גישה לרובוטיקה לטיפול בנוזלים, תשתית ל-ELISA ב-384 בארות וקוראי לוחיות של פלואורסצנציה בפתרון זמן (time-resolved fluorescence).
- דורש סטנדרטיזציה קפדאית של פרוטוקולי בדיקה ותהליכי ניתוח נתונים בין צוותים שונים.
- עשוי לדרוש התאמה לאללים שונים של MHC II או לכימיה של פפטידים בהתאם לצרכי התוכנית.
- התפוקה והיכולת להרחבה מוגבלות על ידי המכשור הזמין ואספקת הרגיאנטים.
