Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את הקישור של פפטידים קצרים עם MHC אנושי, שני חלבונים חיסוניים באמצעות בדיקת צלחת באר 3 84 בתפוקה גבוהה. זה מושג על ידי ביצוע ראשון של מבחני תחרות בשלב הפתרון עם הפפטידים המעניינים. בשלב השני, הפפטיד המאוזן MHC שני קומפלקסים נלכדים עם נוגדן אנטי MHC שני משותקים על לוחות ELIZA בעלי קשירה גבוהה.

לאחר מכן, הקומפלקסים שנלכדו מודגרים עם האופיום המסומן סטרפטווידין ואז הסטרפטווידין הלא קשור נשטף והאופיום שנלכד מופעל. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפלואורומטריה שנפתרה בזמן כדי לכמת את הרמות של פפטיד בקרה שנלכד בשני MHC. שיטה זו יכולה לספק תובנות ראשוניות לגבי הפוטנציאל החיסוני של חלבוני מטרה.

זה שימושי במיוחד לאימות התפוקה של מנבאים בסיליקו, התחל את ההליך על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים L 2 43 מדוללת טרי לכל באר של 3 84. צלחת אלייזה לבנה מחייבת גבוהה אטמה את הצלחת בסרט פוליאסטר ודגרה אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ואז התחל עם מלאי של 10 מילימולר של כל בדיקה.

פפטיד ו-DMSO מייצרים את סדרת הדילול הבאה ומאגר פוספט ציטראט באמצעות 3 84 לוחות פוליפרופילן בארות. שימו לב שלוח פוליפרופילן מלא של 3 84 בארות דורש שלוש לוחות EIA נפרדים כפי שמוצג באיור. לאחר מכן, יש לדלל את שני תמיסות ה-MHC שנבחרו לריכוז של 101 ננו מולארי במאגר תגובה באמצעות צינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר מכן יש לדלל את פפטיד הבקרה מ-20 מיקרומולר ליחס של אחד ל-100 בתערובת המאסטר הטרייה של MHC שהוכנה ולהוסיף 21.5 מיקרוליטר של תערובת MHC שני מאסטר עם פפטיד בקרה לבקרה החיובית. ובכן של צלחת הפוליפרופילן 3 84 באר, הוסף את תערובת המאסטר MHC המכילה פפטיד בקרה לכל אחד מדילול פפטיד הבדיקה ביחס של אחד לאחד כדי ליצור את תגובת הכריכה גם בשלב זה. לבסוף, אטמו את תגובת הקישור עם סרט פוליאסטר ודגרו את הצלחת למשך 12 עד 24 שעות בחממה מבוקרת ללא פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.

למחרת, יש לדלל את בארות תגובת הקישור ב-3 84. צלחת באר ביחס של אחד לאחד עם מאגר נטרול. לאחר מכן שטפו את צלחת אלייזה שלוש פעמים עם 60 מיקרוליטר לבאר PBS 0.05% בין 20 ההעברה הבאה, 25 מיקרוליטר מכל תמיסת תגובת קשירה מנוטרלת מצלחת הבאר 3 84 במשולש לציפוי הנוגדן 3 84.

ובכן צלחת אלייזה ואז דגרו את צלחת האליזה המכוסה בסרט פוליאסטר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה לאחר הדגירה. שטפו את צלחת ELIZA שלוש פעמים כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטר של אופיום סטרפטוקוקוס דין טרי מדולל לכל אחד. ובכן דגרו את הצלחת המכוסה בסרט פוליאסטר בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה.

במהלך הדגירה, הביאו 10 מיליליטר של תמיסת שיפור לכל צלחת לטמפרטורת החדר גם בחושך לאחר שעה, שטפו את צלחת ELIZA כפי שהודגם, ולאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטר של תמיסת שיפור לכל באר ודגרו את הצלחת המכוסה בסרט פוליאסטר למשך 10 עד 15 דקות בחושך. לבסוף קרא את הקרינה עם קורא לוחות פלואורסצנטי שנפתר בזמן עם הגדרות אופיום. בניסוי מייצג זה, נותח רצף פפטידים בוגר של אנטרובקטר Cloe P תשע תשעה בטא-לקטמז עבור קושרים פפטידים משוערים לאלל MHC 2.

DRB אחד חמישה-עשר או מאה ושבעה-עשר לא-או פפטידים זוהו עם שאריות עוגן חובה P אחת במיקום אחד הנדרש לקשירת MHC שתיים בסף של 5% בלבד. פפטידים עם ציונים גדולים או שווים ל-2.6 הם ככל הנראה קושרים. לפיכך, בסף של 5% רק 11 הפפטידים המובילים צפויים להיקשר ל-MHC שני DRB 1 15 0 1.

פאנל מייצג של אפיטופים חזויים נבחר לניתוח בבדיקה מחייבת זו של MHC. שברי פפטיד בטא-לקטמאז של 15 שאריות אלה סונתזו כימית כך ששני אפיטופים משוערים של nonamer MHC הוטמעו בתוך שברי החלבון הסינתטי שלהם. היכולת של פפטידים סינתטיים אלה להתחרות עם פפטיד בקרת חלבון B בסיסי של מיאלין ביוטיניל לקשירה ל-MHC שני DRB 1 15 0 1 נותחה לאחר מכן כפי שהודגם זה עתה.

עקומות קשירה תחרותיות עבור הפפטידים הסינתטיים מומחשות כאן. ערכי IC 50 חושבו על ידי התאמת נתוני טרנספורמציית היומן באמצעות פונקציית התאמה לא ליניארית מחייבת תחרותית באתר אחד של פריזמה. כפי שמודגם בטבלה כפי שניתן לראות בגרף, הפפטידים מחולקים באופן טבעי לשלוש קבוצות, קלסרים חזקים עם IC 50 של פחות ממיקרו-מולרית אחת קלסרים בינוניים עם IC 50 גדול או שווה למיקרומולר אחד, אך פחות מ-100 מיקרו-מולרים וקלסרים חלשים עם IC 50 גדול או שווה ל-100 מיקרומולר לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי האימונולוגיה המולקולרית והתכנון הביו-תרפי לחקור באופן מלא יותר את אירועי הזיהוי המולקולרי העיקריים העומדים בבסיס תגובות חיסוניות אנטי-חלבונים בחולים אנושיים.