שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות
26 ביולי 2014
אנו מציגים גישת רישום תמונה לשחזור נפח היסטולוגיה תלת מימדית (תלת מימדית), המאפשרת לחקור את השינויים של איבר ברמת מבני המאקרו המורכבים מתאים. באמצעות גישה זו, חקרנו את השינויים התלת-ממדיים בין בלוטות חלב מסוג בר לבלוטות חלב Igfbp7-null.
המטרה הכללית של הסרטון הבא היא להציג גישה לרישום תמונות (image registration) עבור היסטולוגיה תלת-ממדית ושחזור נפחי כדי לחקור שינויים במבנה המאקרו-תאי של בלוטות החלב. לשם כך, בלוטות חלב מוצאות מעכברים שלושה ימים לאחר תחילת ההנקה, בעכברים מסוג wild type ובעכברים עם מחסור בחלבון קושר של גורם גדילה דמוי אינסולין 7, IGF BP seven null. לאחר מכן, הבלוטות מעובדות ומוטמעות בבלוקים של פאראפין לצורך חיתוך.
בשלב הבא נלכדות תמונות של פני השטח האופטיים של בלוקי הרקמה, ולאחר מכן בלוקי הרקמה נחתכים לפרוסות. נלכדות תמונות של הפרוסות ובאמצעות תוכנה ייעודית, כל פרוסה מיושרת ביחס לתמונת פני השטח התואמת לה כדי לשחזר את הנפח ההיסטולוגי של בלוטת החלב. הנתונים המתקבלים מדגישים הבדלים בגודל בין בלוטות של סוג פראי (wild type) לבלוטות מוטנטיות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת-ממדית כפולה, הוא שהיא מספקת מידע על פני פריסה מרחבית רחבה בהרבה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור ולתקף טכניקות ואלגוריתמים חדשניים בדימות רפואי ותיפולים נפחיים, וכן ליצירת ניתוח תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של איברים שונים. נפח היסטולוגי משוחזר זה מציג ייצוג מהימן של דגימת התהליך ללא שגיאת רישום מצטברת.
הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבחנו כי לעכברים עם מחסור ב-IGF P seven ישנם שגרים קטנים יותר והם אינם מסוגלים להחזיק מספר שגרים גדולים, ולכן החלטנו לבחון את מבנה בלוטות החלב שלהם. לאחר שהרקמה מוטמעת בפראפין, השתמשו במיקרוטום סיבובי כדי לקצץ את הבלוק עד להסרת עודפי הפראפין. לאחר מכן, באמצעות מכונת קידוח אנכית, קדחו חורים בעומק 1 mm לפחות בשתי פינות של בלוק הפראפין, בניצב למתקן הקסטה, והניחו את בלוק הרקמה על המיקרוטום הסיבובי.
כדי להקים את מערכת הדמיית פני הבלוק לפני המיקרוטום, מקמו מצלמה עם עדשת טלפוטו בזווית קלה מפני השטח של בלוק הרקמה. המצלמה צריכה להיות מחוברת למחשב המוצב לפני המיקרוטום. לאחר מכן, מקמו מקור אור לפני הבלוק כך שהמצלמה תלcapture את השתקפות האור מהבלוק.
כוון את זווית המצלמה עד שהרקמה על פני השטח של הבלוק תהיה מובחנת בבירור מהפראפין שמסביבה. צלם תמונה אחת של פני השטח של הבלוק האופטי. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום כדי לחתוך סרטיים של ארבעה חתכים, בעובי של 5 microns.
העבירו את סרטי החיתוכים לאמבט מים קרים, הפרידו בין מקטעי הסרט, ולאחר מכן העבירו את המקטעים השני והרביעי מהמים הקרים אל על גבי זכוכית
לאחר שהן הוחלקו, הרכיבו מחדש את החתכים על גשריות המיקרוסקופ באמצעות דגימה. כפי שצוין קודם לכן, שימו לב שחיתוך, הרכבה והחלקה של החתכים עלולים לגרום לעיוותים מסוימים, כגון קרעים, קיפולים, התכווצות והתרחבות. ארטיפקטים אלו מקשים על רישום (registration) של חתכי ההיסטולוגיה.
צבע את החתכים ב-h ו-d באמצעות צובע אוטומטי. לאחר מכן, הנח זכוכית כיסוי על השקופיות בעזרת מכשיר להנחת זכוכית כיסוי אוטומטית, וסרוק את השקופיות באופן דיגיטלי באמצעות סורק שקופיות היסטולוגי ברזולוציה הרצויה. עבור פרוטוקול זה, ההגדלה היא 20 x והרזולוציה היא 0.47 microns.
חלק זה של הסרטון מספק סקירה כללית של תהליך רישום התמונות (image registration), המבוצע באמצעות תוכנה מותאמת שפותחה במעבדה שלנו בשילוב עם MATLAB c plus plus. באמצעות ITK, התחלו בדגימה מופחתת (downsampling) של תמונות ההיסטולוגיה לרזולוציה של תמונות פני השטח של הבלוק (block face images). פעולה זו תקטין את תמונות ההיסטולוגיה במקדם של 0.026.
בשלב הבא, לצורך סגמנטציה של התמונה ובחירת נקודות, פתחו מספר תמונות של פני הבלוק ב-MATLAB והשתמשו בכלי סמן הנתונים (data cursor) כדי למדוד את ערכי הפיקסלים של חורי הרישום. השתמשו בערך הפיקסל הממוצע כסףת רגב קבועה לסגמנטציה של חורי הרישום. כדי להסיר סגמנטים מיותרים, השתמשו במדדי העגוליות והשטח של האובייקטים שעברו סגמנטציה כדי להשאיר את החורים ולהסיר את הסגמנטים המיותרים.
בשלב הבא, עבור כל בלוטת חלב, בחרו תמונת פני בלוק אחת שתשמש כרפרנס. יישרו את מרכזי חורי הרישום של שאר תמונות פני הבלוק למרכזי חורי הרישום של תמונת הרפרנס. לאחר מכן, באמצעות התמורות שהתקבלו עבור חורי הרישום, יישרו את תמונות פני הבלוק. עבור תמונות פני הבלוק המיושרות, בצעו סגמנטציה ידנית או חילוץ של הרקמה מהרקע עבור חתכים מסוג h ו-d.
השתמש בטכניקת הסף של OSU כדי לבצע סגמנטציה של התמונות מהרקע וליצור מסכות בינאריות של תמונות ההיסטולוגיה. לאחר מכן, באמצעות ההיסטוגרמה של האובייקטים המסומנים, זהה ובחר את האובייקט הגדול ביותר בכל מסכה. חלץ את נקודות השפה ברוחב פיקסל אחד הן ממסכות ההיסטולוגיה והן ממסכות פני הבלוק.
בשלב הבא, השתמש באלגוריתם של מתארים פוריאריים (Fourier descriptors) כדי למצוא את השניתה הקשיחה (rigid transform) הראשונית בין נקודות הגבול של ההיסטולוגיה לבין תמונות פני הבלוק (block face images) המתאימות להן. התמרה ראשונית זו כוללת את גורמי ההעתקה, הסיבוב והקנה. בצע התמרה לכל תמונה היסטולוגית באמצעות השניתה הראשונית שהתקבלה בשלב הקודם.
כדי לדייק את הרישום הקשיח, הסר מקווי המתאר ההיסטולוגיים את מקטעי השוליים בעלי העקמומיות הגבוהה באמצעות מסנן כדור מתגלגל (rolling ball filter). לאחר מכן, בחר באקראי 500 נקודות מתוך נקודות הגבול ההיסטולוגיות שנותרו, באמצעות התפלגות אחידה. העבר את נקודות הגבול ההיסטולוגיות באמצעות התרגום הראשוני שהתקבל ממתארי פוריה (Fourier descriptors).
השתמש בנקודות השפה של פני השטח של הבלוק ובאלגוריתם הנקודות הקרובות ביותר האיטרטיבי (Iterative Closest Points) כדי למצוא את הטרנספורמציה הקשיחה בין נקודות השפה של פני השטח של הבלוק לבין ההיסטולוגיה. נקודות שפה אקראיות. לאחר מכן, בצע טרנספורמציה לתמונות ההיסטולוגיה שהתקבלו מהשלב הקודם כדי ליצור תמונה ויזואלית של הנפח ההיסטולוגי בתוכנת ההדמיה התלת-ממדית.
בתוכנת Me vis lab, בחרו ב-modules, לאחר מכן ב-file miscellaneous והוסיפו את המודול composed 3D from 2D files. לאחר מכן בחרו ב-image מהתפריט והוסיפו את המודול image property convert. לבסוף, הוסיפו מודול view 3D מתוך modules visualization 3D viewers.
לחץ פעמיים על compose 3D from 2D files כדי לטעון את התמונות ולחץ על create 3D. התאם את גודל הווקסל על ידי לחיצה כפולה על image property convert, והגדר את גודל הווקסל כ-0.018 0.018 0.01. צפה בנפח על ידי לחיצה כפולה על view 3D.
לבסוף, צפו בערימת התמונות בהגדלה של five x על ידי ביצוע השלבים המפורטים במסמך המצורף. כדי לאפיין טוב יותר את החסר של I-G-F-B-P seven null, בוצע שחזור תלת-ממדי של בלוטות החלב בעכברים כפי שמתואר כאן. איורים אלה מציגים את נפחי ההיסטולוגיה המשוחזרים של בלוטות החלב מסוג wild type ובסוג null.
שימו לב כי בלוטת המוטנט מצד ימין קצרה וצרה יותר מאשר סוג הבר (wild type) מצד שמאל, אך בעלת עומק דומה, כאשר עומקה של בלוטת סוג הבר הוא 1.06 millimeters ועומקה של בלוטת ה-null הוא 1.02 millimeters. כמו כן, שימו לב כיבלוטות סוג הבר מצד שמאל מכילות מעט רקמה סטרומלית, כפי שמעיד צביעת ה-eosin הוורודה, בעוד שבלוטות ה-null מצד ימין נראות כמרכיבות בעיקר רקמה סטרומלית. כאן, צביעת ה-hematoxylin, המזהה תאים בעלי גרעין, מראה כי בלוטת ה-null שומרת על צפיפותה, בעוד שבלוטת סוג הבר נראית כמרכיבה בעיקר מבנים בלוטיים.
כדי לחקור זאת הלאה, תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של אזור קשרי הלימפה סודרו כאן. ניתן לראות מבנים גדולים, שהיו אמורים להיות מלאים בחלב. לעומת זאת, בבלוטת ה-I-G-F-B-P seven null ישנם מעט מבנים מפותחים היטב.
יתרה מכך, מבנים אלו צפופים בתאים דמויי פיברובלסטים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו יוצרים שחזור תלת-ממדי של איבר באמצעות בנייה מחדש של סדרת חתכים סרוקים. מצוין. כעת, בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לקרוא לשקופיות ולסריקות בשמות עקביים, כיוון שיהיה מספר רב של שניהם, וארגון רצפי הוא המפתח להצלחה בביצוע הליך זה.
ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה לסמני תאים ומחלות ספציפיים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד חודרת הרשת כלי הדם אל תוך הגידול?
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה לרישום תמונות (image registration) עבור שחזור נפחי תלת-ממדי של היסטולוגיה, תוך התמקדות בשינויים במבנה המקרו-תאי של הגlande המטרית. באמצעות בחינת בלוטות טבעיות מעכברים מסוג wild-type ומעכברים עם מחסור ב-Igfbp7, המחקר מדגיש הבדלים משמעותיים בגודל הבלוטה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- היסטולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת התפתחות בלוטת הע mysteries היא חיונית להשגת תובנות לגבי ההנקה.
- טכניקות של רישום תמונות (Image registration) משפרות את הניתוח של נתונים היסטולוגיים.
- הבדלים במבנה בלוטת הע mysteries יכולים להעיד על מנגנונים ביולוגיים בבסיסם.
- IGF BP seven ממלא תפקיד בהתפתחות בלוטת הע mysteries.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לשחזור נפחים היסטולוגיים בתלת-ממד.
- השוואת ההבדלים המבניים בין בלוטות חלב של סוג בר (wild-type) לבין בלוטות חלב של עכברים עם דלילת IGF BP seven.
- סיוע בהבנה טובה יותר של מקרו-מבנים תאיים בבלוטות חלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בלוטות חלב הוצאו מעכברים שלושה ימים לאחר ההנקה.
- הבלוטות עובדו והוטמעו בבלוקים של פראפין.
- נקלטו תמונות אופטיות של פני השטח של כל בלוק רקמה.
- תוכנה ייעודית שימשה ליישור של תמונות החתכים עם תמונות פני השטח של הבלוק לצורך שחזור נפחי.
תוצאות עיקריות
- נצפו הבדלי גודל משמעותיים בין בלוטות חלב של מוטנטים לבין בלוטות חלב של סוג בר (wild-type).
- שיטת רישום התמונות שחזרה ביעילות את נפח ההיסטולוגיה.
- הנתונים שהתקבלו מספקים תובנות לגבי השינויים המבניים בבלוטות החלב.
- ניתן להחיל גישה זו על רקמות אחרות למחקרים דומים.
מסקנות
- טכניקת רישום התמונות שפותחה בעלת ערך לניתוח היסטולוגי בתלת-ממד.
- הבדלים במבנה בלוטת הע owning may inform future research on lactation.
- שיטה זו יכולה לשפר את הבנתנו לגבי הארגון התאי בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
שיטה זו מאפשרת לחוקרי ביו-פרמה לכמת שינויים מבניים בתלת-ממד ברקמת השד, ובכך לתמוך בתיקוף מטרות בביולוגיה של בלוטת השד ובמסלולים הקשורים להנקה. על ידי אספקת שחזור נפח היסטולוגי נטול שגיאות, היא מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים של התפתחות בלוטית ושל אינטראקציות סטרומליות-אפיתליות. הגישה מקלה על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה בין פנוטיפים של סוג בר (wild-type) לבין פנוטיפים מוטנטיים ברזולוציה מקרו-מבנית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של הבדלים מקרו-מבניים בבלוטות החלב בין מודלים של טיפוס פרא (wild-type) למודלים חסרי IGFBP7.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה תלת-ממדית אמינה של מדורי הסטרומה והבלוטות, ללא הפצת שגיאות רישום.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי יצירת נפחי היסטולוגיה תלת-ממדיים בע plateau רזולוציה גבוהה ובסטנדרט אחיד.
- ערך תפעולי: מבטיח מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור באמצעות יישור עקבי של חתכים והפקת נקודות גבול מתמונות היסטולוגיה ותמונות של פני הבלוק.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות להדמיה של שינויים מבניים הקשורים למחסור ב-IGFBP7, כגון הפחתה בגודל הגlande והגברה של התוכן הסטרומלי.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה של המורפולוגיה של בלוטת החלב של טיפוס מוטנטי וטיפוס פראי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים ועד לזיהוי מובילים (leads) ותיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור ביולוגיה של בלוטת העווית ומסלולי העברה של אותות בסטרומה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה בתלת-ממד של מאקרו-מבני בלוטת החלב במודלים גנטיים.
- סריקה: משפרת את מוכנות הבדיקה באמצעות יישור הסטה של חיתוכי היסטולוגיה באופן הדיר, תוך שימוש בתמונות של פני הבלוק האופטי ובתוכנת רישום מותאמת אישית.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כגון נפח, אורך, רוחב ועומק של הבלוטה, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להערכה מבנית אורךית הרלוונטית לתהליכי הנקה ושחזור רקמות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לשחזור היסטולוגי בתלת-ממד עבור איברים ותנאים ניסיוניים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכנית במודלים של התפתחות בלוטת החלב.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות תהליך רישום תמונות הניתן לשחזור, המשתמש בסימני ייחוס (fiducials) של פני השטח ובאתחול באמצעות תיאורי פורייה.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים תלת-ממדיים כמותיים לצורך תעדוף מטרות בסטרומה של בלוטת החלב או באיתות אפיтелиאלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות על קידום מודלים תוך התחשבויות בסיכון, וזאת באמצעות פנוטיפינג אובייקטיבי מבוסס-נפח של מודלים גנטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, רישום תמונות (image registration) ותוכנה מותאמת אישית מבוססת MATLAB לבחירת נקודות ולטרנספורמציה.
- תלוי בציוד הכולל מיקרוטום סיבובי, מכונת פריזה אנכית, מצלמה עם עדשת טלפוטו, מקור אור ומערכות לצביעה וסריקה היסטולוגית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים בשמות השקופיות, רצף החתכים ולכידת תמונות של פני הבלוק, על מנת להבטיח דיוק ביישור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על סוגי רקמות אחרים, בשל הבדלים בגודל, בנוקשות ובמאפייני הצביעה.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לארטיפקטים של חתכים, כגון קרעים, קפלים והתכווצות במהלך ההרכבה, אשר עלולים לסבך את הרישום.
