Name: חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: למדו הדמיית אינטראקציות חלבונים בעזרת BiFC בפרוטופלסטים ועליי טבק. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאי צמח חיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות ליורגן סול לדיונים מועילים וכריס קארי לקריאה ביקורתית של כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי chemischen DFG וFonds der Industrie (SFB מספרי מענקים 1035, A04 פרויקט לאס והאם 187/22 לRS).

1. טרנספורמציה של BiFC הבונה בAgrobacteria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט של מבני BiFC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הגן של עניין מתבנית מתאימה באמצעות oligonucleotides מכילה attB אתרי איגוף. לבצע PCR באמצעות פולימראז הגהה. להתאים את אורך צעד חישול לשילוב פריימר תוכנן ואת אורכו של שלב התארכות בהתאם לגודל השבר. בדוק את המוצר ה-PCR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ולטהר אותו על ידי שימוש בערכת ה-PCR לנקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת BP עם שבר שהושג ואת וקטור הכניסה באמצעות recombinase BP. מערבבים 15-150 ng של מוצר attB-PCR עם 150 ng של וקטור הכניסה, להוסיף 2 μl של recombinase BP ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 8 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 2 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך כל התגובה לE. המוסמך coli DH5α; תאים ומסך המושבות מתקבלות על ידי המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצף ה-DNA של פלסמידים חיוביים מתבצע כדי לוודא היעדר המוטציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשיבוט הכניסה מתקבל עבור רקומבינציה LR עם וקטור היעד המתאים באמצעות recombinase LR. מערבבים 50-150 ננוגרם של וקטור הכניסה עם 150 ng של וקטור היעד, להוסיף recombinase LR μl 1 ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 5 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 1 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך כל התגובה לתאים המוסמכים E. coli DH5α ומסך המתקבלים על ידי מושבות המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצפי DNA אין צורך בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את ה-DNA פלסמיד עם ערכת פלסמיד Mini כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Agrobacteria כימית המוסמך (AGL1 המתח, ריפאמפיצין והתנגדות Carbenicillin) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> agrobacteria פס מ תרבות המניה ולגדול ל24 שעות ב28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר מדיום LB עם מושבה אחת ודגירת הלילה בשעה 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 50 מיליליטר מדיום LB עם 2 מיליליטר של תרבות הלילה ולגדול לכ 4 שעות ב28 ° C ל OD 600 של 1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 3,000 15 דקות ב 4 ° C ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר עיקור קר כקרח CaCl 2 (10 מ&quot;מ). שמור את התאים על קרח לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquots (100 μl) של התאים, להקפיא באופן מיידי בחנקן הנוזלי ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרנספורמציה של Agrobacteria כימי המוסמך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו aliquot אחד מתאי AGL1 המוסמכים על קרח. להוסיף 1-2 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד לתאים. דגירה במשך 5 דקות על קרח, 5 דקות בחנקן נוזלי ו5 דקות ב37 ° C. הוספת 600 מדיום LB μl לתאים והיםהייק ב650 סל&quot;ד במשך 4 שעות ב28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 1 דקות ב8,000 XG וזורקים supernatant. Resuspend את הכדור ב50 μl של המדיום שנותר LB וצלחת על צלחות LB המכילות האנטיביוטיקה המתאימה. לאטום את הצלחות ודגירה עבור 2 ימים ב28 ° C. מושבות מסך לנוכחות של פלסמיד על ידי המושבה PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת חיובית ב5 מיליליטר מדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 28 ° C במשך הלילה. מערבבים 500 μl של תרבות הלילה עם 500 μl 50% גליצרול מעוקר ולהקפיא ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן agrobacteria במדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ישירות ממניית גליצרול לשינוי זמני של עליי טבק. </li></ol></li></ol> 2. טרנספורמציה חולפת של עליי טבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agrobacteria צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות המניות הבאים: acetosyringone (150 מ&quot;מ, מתמוסס ב70% EtOH), חנות aliquots ב -20 ° C. pH MES / KOH (0.1 M) 5.7, לאחסן ב 4 ° C (סינון סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר), מניית MgCl 2 (ז 1), חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימה עם 50 μl של תרבות מניית גליצרול AGL1 המכילה את הפלסמיד של עניין בצינור מיליליטר סטרילי 50 ולדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות רועד ב190 סל&quot;ד עד OD 600 בין 1.0 הוא הגיע -2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 15 דקות. Resuspend את הכדור במדיום הסתננות טרי [MgCl 2 (10 מ&quot;מ), pH MES / KOH (10 מ&quot;מ) 5.7, acetosyringone (150 מיקרומטר)] ולהתאים את ההשעיה לOD 600 של 1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי agrobacteria בייקר תקורה לשעה 2 בחושך. התאים לאחר מכן ניתן להשתמש לחדירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסתננות של עליי טבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בשלושטבק ישן שבוע צמחים (benthamiana Nicotiana). בחר כמה עלים מבוגרים להסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות שווה של agrobacteria נושא את המבנים של עניין (3 מיליליטר כל אחד). קח מזרק 5 מיליליטר ללא מחט להסתננות. לחדור את ההשעיה התא בזהירות לתוך עלי הטבק על ידי לחיצה על המזרק בצד התחתון של העלים בכמה מקומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את הצמחים ולהשאיר אותם בחושך במשך יומיים. </li></ol></li></ol> 3. Protoplast הכנה הכנת Protoplast של עליי טבק הותאמה מKoop et al. 16 ושונים מעט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום F-PCN: מאקרו-מלחים [kno 3 (1012 מיקרוגרם / מיליליטר), CaCl 2 • 2H 2 O (440 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 MgSO • 7H 2 O (370 מיקרוגרם / מיליליטר), KH 2 PO 4 ( 170 מיקרוגרם / מיליליטר), [4 succinate-NH (20 מ&quot;מ; להכין סול מניית 2 Mution (succinate (236 מיקרוגרם / מיליליטר) ו4 Cl NH (106 מיקרוגרם / מיליליטר), להתאים את ה-pH 5.8 לפזר)], מיקרו מלחים [EDTA-Fe (III) x Na-מלח (40 מיקרוגרם / מיליליטר), KJ (0.75 מיקרוגרם / מיליליטר), H 3 BO 3 (3 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 MnSO • H 2 O (10 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 ZnSO • 7H 2 O (2 מיקרוגרם / מיליליטר), Na 2 Moo 4 • 7H 2 O (0.25 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 CuSO • 5H 2 O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר), CoCl 2 • 6 שעות 2 O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר)], MES (390 מיקרוגרם / מיליליטר), גלוקוז (כ 80 מיקרוגרם / מיליליטר) mOsm osmolarity 550, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום F-PIN: כל המרכיבים כמו F-PCN אבל במקום סוכרוז גלוקוז שימוש (כ 110 מיקרוגרם / מיליליטר), osmolarity 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום W5: 150 mM NaCl, 125 מ&quot;מ CaCl 2, 5 מ&quot;מ KCl, MES 2 מ&quot;מ, osmolarity 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). חנות ב 4 °; C (מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון אנזים טרי לבידוד protoplast (0.1 cellulase גרם, 0.03 macerozym גרם ב10 מיליליטר F-PIN). דגירה הפתרון ב55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבות RT. הוספה של BSA 10% 100 μl ל10 מיליליטר פתרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עלה אחד הסתנן לתוך צלחת פטרי ולהוסיף את פתרון האנזים הטרי. השתמש בסכין גילוח חדש לחתוך את העלה לכ 0.5 סנטימטר 2 חתיכות בגודל. מעביר את העלים החלקים עם פתרון האנזים לתוך בקבוק ואקום חדירה והאבק לחדור לכ 20 שניות עד בועות אוויר יוצאות מהעלים (ואקום שחרורו בזהירות רבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הבקבוק ל90 דקות ב40 סל&quot;ד בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר protoplasts ידי טלטול 1 דקות ב90 סל&quot;ד. סנן את הפתרון באמצעות גזה (100 מיקרומטר) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר (תחתית עגולה). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Overlay פתרון protoplast עם 2 מיליליטר חיץ F-PCN ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 70 XG (תאוצה איטית והאטה) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> protoplasts ללא פגע לצבור על הממשק של פתרון האנזים וה-F-PCN. קח את קצה פיפטה מיליליטר רחב פתח 1 להעביר protoplasts השלמה לתוך צינור צנטריפוגות טרי ולהתמלא בחיץ W5. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב100 XG (האצה האטה איטית) לגלולת protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה וגלולה resuspend בכ 200 חיץ W5 μl, בהתאם לכמות של protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו תמיד בטיפי פתח רחבים כדי למנוע פקיעה של protoplasts ללא פגע. </li></ol></li></ol> 4. לייזר סריקה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק שתי רצועות קטנות של חומר איטום סביב שקופיות מיקרוסקופ (למעט 2 סנטימטר). הנח 20 μl של פתרון protoplast בין הרצועות ומניח את מכסה זכוכית בזהירותעל העליונה. רצועות איטום לוודא כי protoplasts אינם נמעך על ידי כיסוי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסך דגימות עלים לחתוך חתיכת 1 סנטימטר מהעלה ולמקם אותו על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם הצד התחתון של העלה פונה כלפי מעלה. להוסיף כ 30 μl H 2 O, למקם את כוס על גבי עטיפה ולתקן אותה בחוזקה עם דבק בשני הצדדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות הדמיה ומיקרוסקופ confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר מיקה, סוג: TCS SP5. להגדלת שימוש בעדשה אובייקטיבית (HCX PL APO CS) עם סדר גודל של 63X עם גליצרול כמדיום הדמיה. הגדר את הצמצם המספרי ל1.3. השתמש בתוכנת Leica Application Suite / מתקדם הקרינה להערכה (ראה משלימה נתונים S1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לייזר ארגון ל30% וכוח הלייזר ב488 ננומטר לעוצמת 18% לפקח על אות BiFC מחדש ב515 ננומטר ולהגדיר רוחב פס פליטה אחד PMT גלאי 495-550. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח autofluorescence כלורופיל להגדיר רוחב פס פליטת גלאי PMT שני 650-705. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על אות mCherry להשתמש בליזר HeNe 561, להגדיר את עוצמת הלייזר 561-18% ורוחב פס הפליטה של ​​גלאי PMT שלישי 587-610. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי תמונות של כל ערוצי גלאי PMT נלקחות עם אותן הגדרות הרווח (רווח צריך להיות בין 800-900 להוציא אותות רקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות ברוחב / גובה תבנית של 1024 x 1024 פיקסלים עם מהירות סריקה של 100 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור Z-stackings להשתמש במרחק מרבי של 0.5 מיקרומטר בין כל ערימה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li>
<li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ABCG+transporters%2C+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids%2C+dimerize+in+different+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li>
<li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li>
<li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li>
<li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li>
<li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li>
<li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

על תכנון ניסוי BiFC כמה נקודות צריכה להיחשב. למרות שאין מידע מבני על החלבונים של העניין נדרש, טופולוגיה צריכה להיות ידועה בעת עבודה עם חלבוני קרום פורש. חלבוני הניאון צריכים להתגורר באותו התא subcellular או פנים באותו הצד של קרום כדי לאפשר אינטראקציה. באופן טבעי, בעת ניתוח חלבונים הדורשים רצף מיקוד N-מסוף, יכול להיחשב רק תג C-מסוף. הכיוון שניתן שהתג מפריע להחדרת מיקוד או קרום תקין של החלבון של עניין זה רצוי לבדוק לוקליזציה subcellular לפני כן, למשל, על ידי לבטא חלבון GFP-tagged. י...

לומד את היווצרות של קומפלקסי חלבונים והלוקליזציה שלהם בתאי צמח in vivo היא חיונית כדי לחקור רשתות סלולריות, איתות ותהליכי חילוף חומרים. BiFC מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם ישירות בתוך תא הצמח החי 1-5. בBiFC להתקרב לשלמה של שני שברי N-ו-C-מסוף nonfluorescent של עופרת חלבון פלואורסצנטי לחלבון פלואורסצנטי מחדש. שברי חלבוני ניאון רבים ושונים שימשו כדי לזהות אינטראקציות חלבון, למשל החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) כרומופור של אשר נוצר כימי על ידי שלוש שאריות שונות 6. ניתן לחצות חלבוני ניאון בתוך לולאה או SS-גדיל להביא שני שברי nonfluorescent אשר ניתן התמזגו שני החלבונים של עניין. Assay יכול לשמש כדי לזהות אינטראקציות בכל compartme subcellularnt בכל אורגניזם גדל אירובי או תאים שיכולים להיות מהונדס גנטי כדי לבטא חלבוני ההיתוך. אם שני החלבונים באים בסמיכות בתוך התא, הקרינה היא מחדש והוא יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ ללא התוספת של fluorophores או צבעים 3 אקסוגניים. טבק (benthamiana Nicotiana) הוכיח להיות אורגניזם מודל נוח לדמיין את האינטראקציה של חלבונים צמחיים, שכן בקלות ניתן לבטא חלבונים על ידי ניצול שינוי בתיווך Agrobacterium של טבק עם המבנים שנוצרו. Agrobacteria להשתמש פלסמיד שנקרא Ti (גידול גרימת) קידוד עבור אנזימים שלתווך התמרה של הגן של עניין לתאי צמח. BiFC הוא גם ישים עבור מסיס, כמו גם לחלבוני קרום בתוך כל התאים הסלולריים ושמש בהצלחה בשנים האחרונות לזהות אינטראקציה חלבוני in vivo, כמו גם לנתח אתרי אינטראקציהבתוך החלבונים 7-9. על הביטוי של הגנים הציגו, את האינטראקציה של חלבוני הניאון ניתן דמיינו ישירות בעלים, אשר מתאימה למבנים הסלולר גדולים יותר, כמו reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה או כלורופלסטים. עם זאת, כדי לפקח על הלוקליזציה במבנים מעודנים יותר, למשל, את מעטפת הכלורופלסט, רצוי לדמיין את הקרינה בprotoplasts מבודדת מעלי טבק השתנו. קבוצה של וקטורי BiFC המכילים גם C-מסוף או תג ניאון N-מסוף צריך לשמש לגישת BiFC בצמחי 10. הפרוטוקול המתואר להלן שימש כדי לחקור את האינטראקציה חלבון cytosolic הלם חום 90 (Hsp90) של עם חוזר tetratricopeptide תחום (TPR) המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7 מתגוררים במעטפת החיצונית הכלורופלסט וreticulum endoplasmic, בהתאמה 11-13. לצורך כך, Hsp90 היה התמזגו לCtחלק erminal של SCFP (SCFP C). התג היה N-סופני התמזגו למלווה כדי להבטיח נגישות של המוטיב בטרמינל C-MEEVD המחייב של Hsp90 כדי לצבוט מסוג תחומים TPR. במקביל, חלק N-המסוף של ונוס (Venus N) היה התמזגו לתחומי cytosolic של תחום TPR המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7, בהתאמה. כביקורת שלילית שאנו משובטים חלק מסיס בטרמינל C-C של SCFP אך ורק בו מתגורר בcytosol ולכן שליטה מתאימה. תגי הניאון של החלבונים למדו צריכים להתמודד באותו תא סלולארי כדי לאפשר לסמיכות ובכך הכינון מחדש של אות הניאון. כדי לקבוע את הלוקליזציה של אות הניאון מחדש חלבון סמן התמזגו לתג ניאון שונה ניתן cotransformed כדי להדגים את לוקליזציה subcellular של האינטראקציה. חלבון סמן ER התמזגו mCherrry הפך בו זמנית במקרה של ER ממוקם 14 AtTPR7. Autofluorescence של כלורופיל שימש כסמן הכלורופלסט במקרה של Toc64. לפי זה לא רק האינטראקציה in vivo של Toc64 וAtTPR7, בהתאמה, עם מלווה Hsp90 cytosolic ניתן לנטר ישירות בי הטבק אלא גם לוקליזציה subcellular של האינטראקציה יכולה להיחקר. BiFC מתאים גם כגישה משלים לשיטות אחרות לומדות אינטראקציות בין חלבונים. בהשוואה לcoimmunoprecipitation או בניסויים נפתחים מבחנה, למשל, אין נוגדנים ספציפיים צריכים להיות זמין לחלבונים של עניין, והחלבונים לא צריכים לבוא לידי ביטוי recombinantly במבחנה, מה שיכול להיות מאתגר, במיוחד לחלבונים בממברנה. יתר על כן, גם ניתן לנטר אינטראקציות חולפות באמצעות BiFC, שכן החלבונים שנתפסו על ידי האינטראקציה של תגי הניאון התמזגו 15.

<table><tbody><tr><td>3&#039;,5&#039;-Dimethoxy-4&#039;-hydroxyacetophenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Acetosyringone</td></tr><tr><td>Cellulase, Onozuka-R10</td><td>Serva</td><td>16419</td><td>from Trichoderma viridae</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10&nbsp;</td><td>Serva</td><td>28302</td><td>מבית Rhizopus sp.</td></tr><tr><td>GATEWAY, BP Clonase II, ערכת אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>11789-(020)</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY, LR Clonase II, ערכת אנזים</td><td>Invitrogen</td><td>11791-(020)</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ג'ל וערכת ניקוי PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609-250</td><td></td></tr><tr><td>pDEST-GWVYNE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr><tr><td>pDEST-VYNE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr><tr><td>pDEST-SCYCE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr></tbody></table>

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בprotoplasts הטבק ועלים

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים רבים האינטראקציה transiently עם חלבונים אחרים או משולבים מתחמי חלבון רב כדי לבצע את תפקידם הביולוגי. שלמת bimolecular פלואורסצנטי (BiFC) היא שיטת in vivo כדי לפקח כגון אינטראקציות בתאי צמח. בפרוטוקול המובא חלבוני המועמד חקרו הם התמזגו לחצאים משלימים של חלבוני ניאון ומבני בהתאמה מוכנסי תאי צמח באמצעות שינוי בתיווך Agrobacterium. בהמשך לכך, החלבונים באים לידי ביטוי בtransiently עלי טבק וניתן לאתר אותות ניאון המשוחזר עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal בתאים שלמים. זה מאפשר הדמיה לא רק של האינטראקציה עצמה, אלא גם לוקליזציה subcellular של קומפלקסי החלבונים ניתן לקבוע. לצורך כך, ניתן coexpressed גנים סמן המכילים תג ניאון יחד עם מבני BiFC, וכך לדמיין מבנים הסלולר כגון tהוא endoplasmic reticulum, מיטוכונדריה, מנגנון Golgi או קרום הפלזמה. אות הניאון ניתן לנטר באופן ישיר בתאי עלה אפידרמיס או בprotoplasts הבודד, אשר יכול להיות מבודד בקלות מהעלים הטבק השתנו. BiFC הוא אידיאלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם בתוך התא החי. עם זאת, יש לו כדי להיחשב כי הביטוי צריך להיות מונע על ידי יזמים חזקים וששותפי האינטראקציה משתנים עקב שילוב של תגי הקרינה גדולים יחסית, מה שעלול להפריע למנגנון האינטראקציה. עם זאת, BiFC הוא גישה משלים מצוינת לשיטות נפוצות מיושמות אחרות חוקרים אינטראקציות בין חלבונים, כגון coimmunoprecipitation, במבחני חוץ גופית נפתחים או ניסויי שמרים ושניים-היברידיים.

בדוגמא זו השתמשנו בשיטת BiFC לעקוב אחר האינטראקציה של Hsp90 המלווה המולקולרי cytosolic עם חלבוני העגינה קרום AtTPR7 וToc64. AtTPR7 הוא חלק מtranslocon Sec ואינטראקציה עם מלווים cytosolic, שאולי לספק preproteins הפרשה לטרנסלוקציה לאחר translational על קרום ER. כמו כן, Toc64 במעטפת החיצונית הכלורופלסט פועל ביבוא לאחר translational על ידי קבלת preproteins הכלורופלסט קשור Hsp90. שני החלבונים מהווים תחום TPR cytosolic החשוף, אשר מתווך אינטראקציה עם מוטיב MEEVD טרמינל C-של Hsp90. <p...

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנטר את האינטראקציה בין שני חלבונים המובעים בעלי טבק שלמים. מטרה זו מושגת על ידי תכנון קונסטרוקטים מתאימים, חיבור של שני הגנים הרלוונטיים לחלבונים פלורסצנטיים מפוצלים (split fluorescent proteins) והחדרת קונסטרוקטים אלו לחיידקי אגרובקטרים. בשלב השני, תרביתי אגרובקטרים מעורבבים ומוזרקים לעלי טבק, דבר המוביל לביטוי של החלבונים ולקבלת אות פלורסצנטי משוחזר.אם החלבונים מגיעים לקרבה הדדית, השלב הבא הוא ניתוח של עלים שלמים או פרוטופלסטים מבודדים תחת המיקרוסקופ. התוצאות המתקבלות מראות אינטראקציות בין חלבונים בהתבסס על האות הפלואורסצנטי שנפלט ונמדד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיקוע משותף (co-immunoprecipitation) או שמרים היברידיים (yeast two-hybrid), הוא שניתן לניטור ישיר של האינטראקציה בין החלבונים בתוך תא צמח חי.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמחים, כגון היווצרות של קומפלקסים חלבוניים במדורים תאיים שונים. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו את חיידשיי ה-agro שישמשו לטרנספורמציה של עלי הטבק. חדירו (Inoculate) 50 µL של תרבית מאגר גליצרול של AG L one המכילה את הפלסמיד הרלוונטי לתוך מבחנה סטרילית בנפח 50 milliliter המכילה 10 milliliters של מצע LB עם האנטיביוטיקה המתאימה.דגרו בטמפרטורה

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג'ין להציג פלסמיד דנ"א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular...

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Subcellular לוקליזציה של חלבונים חשוב בקביעת הרגולציה במרחב ובזמן של איתות התא. כאן אנו מתארים השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) כשיטה פשוטה לניטור אינטראקציות המרחבי של חלבונים בתא.

השלמה Fluorescence bimolecular

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

כאן אנו מציגים, שיטה לדמיין היווצרות מורכבת טרנרית בין שלושה שותפי חלבון באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי BiFC מבוסס FRET-FLIM assay. שיטה זו היא בעלת ערך לחקר מתחמי אינטראקציה בין חלבון חלבון ב- vivo.

קביעת אינטראקציה משולשת בין שני מונומרים של גורם שעתוק של קופסת MADS וחלבון חיישן סידן על ידי BiFC-FRET-FLIM Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי סימון קרבה (PL) במלפפון (Cucumis sativus L.) באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2)-AirID כמודל. השיטה מתארת בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירת אגרו-אין, חדירת ביוטין, מיצוי חלבונים וטיהור חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

למדו הדמיית אינטראקציות חלבונים בעזרת BiFC בפרוטופלסטים ועליי טבק. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאי צמח חיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

גלה סרטונים נוספים