חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנטר את האינטראקציה בין שני חלבונים המובעים בעלי טבק שלמים. מטרה זו מושגת על ידי תכנון קונסטרוקטים מתאימים, חיבור של שני הגנים הרלוונטיים לחלבונים פלורסצנטיים מפוצלים (split fluorescent proteins) והחדרת קונסטרוקטים אלו לחיידקי אגרובקטרים. בשלב השני, תרביתי אגרובקטרים מעורבבים ומוזרקים לעלי טבק, דבר המוביל לביטוי של החלבונים ולקבלת אות פלורסצנטי משוחזר.

אם החלבונים מגיעים לקרבה הדדית, השלב הבא הוא ניתוח של עלים שלמים או פרוטופלסטים מבודדים תחת המיקרוסקופ. התוצאות המתקבלות מראות אינטראקציות בין חלבונים בהתבסס על האות הפלואורסצנטי שנפלט ונמדד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיקוע משותף (co-immunoprecipitation) או שמרים היברידיים (yeast two-hybrid), הוא שניתן לניטור ישיר של האינטראקציה בין החלבונים בתוך תא צמח חי.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמחים, כגון היווצרות של קומפלקסים חלבוניים במדורים תאיים שונים. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו את חיידשיי ה-agro שישמשו לטרנספורמציה של עלי הטבק. חדירו (Inoculate) 50 µL של תרבית מאגר גליצרול של AG L one המכילה את הפלסמיד הרלוונטי לתוך מבחנה סטרילית בנפח 50 milliliter המכילה 10 milliliters של מצע LB עם האנטיביוטיקה המתאימה.

דגרו בטמפרטורה של 28 °C למשך 24 שעות לפחות, בניעור במהירות של 190 RPM, עד שהתרבית תגיע לערך OD 600 שבין 1.0 ל-2.0 למחרת. סנטריפוגו את החיידקים ב-3000 ×g למשך 15 דקות. לאחר השלכת הנוזל העליון, השעיקו את המשקע במצע חלחול שהוכן זה עתה והביאו את התמיה לערך OD 600 של 1.0.

דגרו את תאי ה-agro bacteria במנער עליון למשך שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר לצורך חלחול לעלי טבק. בחרו מספר עלים מבוגרים מצמח טבק בן שלושה שבועות. ערבבו נפחים שווים.

שלושה מיליליטרים של כל אחד מחיידקי ה-agro bacteria הנושאים את המבנים (constructs) הרלוונטיים. מלאו מזרק של חמישה מיליליטרים ללא מחט בתערובת תרחיף התאים כדי להחדיר את תרחיף התאים לעלי הטבק. לחצו בזהירות את המזרק על הצד התחתון של העלים במספר נקודות, השקו את הצמחים והשאירו אותם מכוסים ומוגנים מאור למשך יומיים.

כדי לבודד פרוטופלסטים מעלה שעברה חדרת תמיסות (infiltration), ראשית, הניחו את העלה בתוך צלחת פטרי והוסיפו מעט מתמיסת אנזימים שהוכנה טרי. באמצעות להב תער חדש, חתכו את העלה לחתיכות בגודל של כ-0.5 סמ"ר. לאחר מכן, העבירו את חתיכות העלה יחד עם תמיסת האנזימים למכשיר ואקום.

בקבוק חלחול. בצעו חלחול בוואקום למשך כ-20 שניות עד שבועות אוויר יפלטו מהעלים. שחררו את הוואקום בזהירות רבה.

נער את הבקבוק במשך 90 דקות במהירות של 40 RPM בחושך ובטמפרטורת החדר לאחר 90 דקות. שחרר את הפרוטופלסטים על ידי ניעור למשך דקה אחת במהירות של 90 RPM. סנן את התמיסה דרך גזה אל תוך מבחנה צנטריפוגית בעלת תחתית עגולה בנפח של 15 מיליליטר.

הוסיפו מעל תמיסת הפרוטופלסטים שני מיליליטרים של בופר FPCN וסבבו במרכזפוגה למשך 10 דקות ב-70 ×g עם תאוצה והאטה איטיות בטמפרטורת החדר. פרוטופלסטים שלמים יצטברו בממשק שבין תמיסת האנזימים ל-FPCN. העבירו את הפרוטופלסטים השלמים לשפופרת צנטריפוגה נקייה באמצעות טיפ פפיטה של מיליליטר אחד עם פיה רחבה. להצלחת הליך זה, השתמשו תמיד בטיפים בעלי פיה רחבה כדי למנוע קרע של הפרוטופלסטים השלמים.

מלאו את המבחנה ב-W five buffer וסובבו בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-100 $\times$g עם האצה והאטה איטיות. כדי לשקע את הפרוטופלסטים, הסירו בזהירות את הנוזל העליון ותלו את המשקע. בערך ב-200 µL של W five buffer, בהתאם לכמות הפרוטופלסטים.

כדי להכין דגימת פרוטופלסטים לבדיקה במיקרוסקופיה סורקת בלייזר, ראשית הניחו שני פסי דבק קטנים במרחק של כשני סנטימטרים זה מזה על זכוכית מיקרוסקופ. טפטפו 20 µL מתמיסת הפרוטופלסטים בין הפסים והניחו בזהירות זכוכית כיסוי מעליהם. פסי הדבק ימנעו מהפרוטופלסטים להימעך על ידי זכוכית הכיסוי.

להכנת דגימת עלה שלמה עבור מיקרוסקופיית סריקה בלייזר, חתוך פיסה של סנטימטר אחד מהעלה והנח אותה על זכוכית כיסוי כאשר הצד התחתון של העלה פונה כלפי מעלה. הוסף כ-30 µL של מים. הנח זכוכית כיסוי מעל וקבע אותה היטב באמצעות סרט דביק משני הצדדים.

הדמיה מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזרי קונפוקאלי מדגם MICCA TCS SP five להגדלה. השתמש בעדשת אובייקטיב בעוצמה של 63 x עם גליצרין כמדיום ההדמיה, והשתמש בתוכנת Leica application suite advanced fluorescent לצורך הערכה. כוון את לייזר Argonne ל-30% ואת הספק הלייזר ב-488 nanometers לעוצמה של 18%. כדי לנטר את האות ב-515 nanometers, כוון את רוחב פס הפליטה של גלאי ה-PMT הראשון לטווח שבין 495 ל-550 nanometers.

לניטור אוטופלואורסצנציה של כלורופיל. הגדירו רוחב פס פליטה של גלאי PMT שני בין 650 ל-705 ננומטרים. לניטור אות M cherry, השתמשו בלייזר HENI 5 61.

הגדירו את עוצמת הלייזר ל-18% ואת רוחב פס הפליטה של גלאי PMT שלישי מ-587 עד 610 ננומטרים. ודאו כי התמונות מכל ערוצי גלאי ה-PMT נלקחות עם אותן הגדרות הגבר (gain). ההגבר צריך להיות בין 800 ל-900 כדי להוציא אותות רקע.

רכשו תמונות בפורמט זה, ברוחב ובגובה של 1024 על 1024 פיקסלים ובמהירות סריקה של 100 hertz. עבור Z stackings, השתמשו במרחק מקסימלי של 0.5 microns בין כל שכבה. במחקר זה, נעשה שימוש בשיטת ה-BFC כדי לנטר את האינטראקציה של השפרוני המולקולרי הציטוזולי HSP 90 עם חלבוני העגינה לממברנה TPR seven ו-TPR 64.

כפי שמוצג בסכימה זו, Venus מצומד לחלק הציטוזולי של TPR seven, השוכן ברשתית האנדופלזמית, או ל-64, השוכן במעטפת החיצונית של הכלורופלסט. Hs.P 90 מותח במיזוג לקצה ה-N עם SCFP, מה שמאפשר אינטראקציה של דומייני ה-TPR של talk 64 ו-TPR seven עם הקצה ה-C של HSP 90. SCFP לבדו מובע בציטוזול כביקורת שלילית כדי לאמת את המיקום של קומפלקס החלבון TPR seven HS P 90. TPR seven ו-HS P 90 הועברו בטרנספורמציה משותפת עם סמן ER.

הפלוורסצנציה נוטרה בעלים שלמים כביקורת. SCFP לבדו בוטה יחד עם TPR seven וסמן ה-ER. בכל התמונות המוצגות, סרגל קנה המידה מייצג 10 microns.

הפאנלים שמשמאל מראים פלואורסנציה משוחזרת בירוק שנבדקה באורך גל של 515 ננומטר. סמן ה-ER מופיע באדום. בפאנלים האמצעיים מוצג מיזוג של שני האותים ובפאנלים הימניים מוצג המיזוג.

אות משוחזר עבור TPR7 יחד עם HSP90 נוטר במיקום חופף לסמן ה-ER, אשר הופיע בצבע צהוב. לעומת זאת, לא נוטר אות עבור TPR7 ובביקורת השלילית ששימשה כ-CFP. בדוגמה הבאה, חלבון הכלורופלסט Tox64 בוטא יחד עם HSP90 כביקורת.

Tox 64 בטא and בביטוי משותף עם SCFP לבדו. כפי שנעשה בעבר, נ monitored פלואורסצנציה משוחזרת בירוק באורך גל של 515 nanometers. הפאנלים המרכזיים מראים אוטופלואורסצנציה של כלורופיל שנבדקה באורך גל של 480 nanometers.

החפיפה באדום של שני האותים מוצגת בפנלים הימניים. פלורסצנציה משוחזרת נצפתה בתאים המבטאים במשותף את tox 64 ו-HSP 90, אך לא בתאים המבטאים במשותף את tox 64 ו-SCFP לבדם.

מכיוון שהמיקום המדויק של tox 64 ו-HSP 90 קשה לקביעה בתמונות מיקרוסקופיות של עלים שלמים, בודדו פרוטופלסטים מעלי טבק שעברו חדירה (infiltration) לצורך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כבעבר, נבחנה פלואורסצנציה משוחזרת באורך גל של 515 nanometers, אוטופלואורסצנציה של כלורופיל נבחנה ב-480 nanometers, ותמונות מיזוג (overlay) נוצרו כפי שמוצג בתמונת מיזוג זו, שבה ניתן לזהות את tox 64 ו-HSP 90 כמבנים דמויי טבעת המקיפים את הכלורופלסט.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי תכנון הקונסטרוקטים שלכם, טרנספורמציה של עלי טבק, והדרך הטובה ביותר להדמיות של האות הפלורסצנטי המעיד על האינטראקציה בין שני החלבונים המדוברים.