Name: ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: למדו לנתח סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה בשיטה חיה וכמותית. הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופיית קונפוקל ובדיקה ציטופלואורומטרית לזיהוי ROS ברקמות שלמות ובתאים בודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה במעבדת מאסימו סנטורו מגיעה מ-HFSP, Marie Curie Action, Telethon ו-AIRC. אנו מודים לדפנה גייס ולאמיליאנו פניירי על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

1. הכנת הכלים ופתרונות עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון המים דגים. הפוך פתרון מניות על ידי המסת 2 גרם של &#39;אושן מיידי &quot;מלחי ים ב50 מיליליטר של מים מזוקקים. הוסף 1.5 מיליליטר מים דגי המניה לליטר מים מזוקק 1 להכין מוכנה להשתמש במי דגים (ריכוז סופי 60 מיקרוגרם / מלחי ים מיליליטר). החיטוי מוכן לשימוש במי דגים לפני השימוש. פתרון זה משמש כמדיום עובר דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן methylcellulose להרכבת עובר. ממיסים 1.5 גרם של methylcellulose ב50 מיליליטר מים דגי סטרילי. להקל על הפירוק על ידי שימוש במגנט על צלחת ומערבבים. פירוקה של האבקה המלאה עשוי לארוך מספר שעות. בדוק את הפתרון לבהירות וaliquot לתוך צינורות קטנים. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודשים ולהפשיר aliquots בשימוש. צנטריפוגה methylcellulose ב950 XG במשך 5 דקות לפני השימוש. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים של aliquots. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של tricaine / 3 מ-aminobenzoate אתילמלח ethanesulphonate (פתרון מניות) על ידי המסת 200 מ&quot;ג tricaine ב100 מיליליטר מים ולהתאים את ה-pH ל 7.0 באמצעות טריס-HCl M 1 (pH 9). אחסן את המניה הזו ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 30 ימים. זהירות: tricaine היא רעילה. השתמש על פי הנחיות בטיפול מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרימת עקה חמצונית בעוברי דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון חמצון לזירוז סטרס חמצונים הגנרית: הפוך 50 מיליליטר של תמיסת חמצון על ידי הוספת H 2 O פתרון 2 מניות (מי חמצן; 100 מ&quot;מ) למים דגים. השתמש H 2 O 2 של ריכוז סופי בין 2 מ&quot;מ ו100 מיקרומטר. הכן את הפתרון הזה, זמן קצר לפני השימוש בו. פתרון החמצון יכול להיות מיושם גם ההר ROS-זיהוי שלם ושיטות ROS איתור מתא בודד. אין לאחסן את הפתרון הזה. זהירות: H 2 O 2 היא מסוכנת, ומזיק על ידי שאיפה, ואם בלע. מגע עם חומר דליק עלול לגרום לשריפה. ידית מתחת למכסת מנוע קטר וללבוש מצו מתאימיםציוד מגן onal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון חמצון לזירוז סטרס חמצונים הנגזר מיטוכונדריה: בצע פתרון חמצון המניה (5 מ&quot;מ) על ידי המסת 3.9 מ&quot;ג rotenone ב2 מיליליטר של sulfoxide דימתיל (DMSO). שמור פתרון זה בטמפרטורת חדר בחושך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פתרון מניות rotenone ל10 מיליליטר מים דגים כדי להפוך מוכן לשימוש פתרון. השתמש rotenone בריכוז שבין 5-50 מיקרומטר. אין להשתמש בrotenone בריכוזים גבוהים יותר מאשר 100 מיקרומטר. בריכוזים מתאימים, פתרון חמצון זה יכול להיות מיושם על שני ההר ROS-זיהוי שלם ושיטות ROS איתור מתא בודד. זהירות: Rotenone הוא רעיל ומסוכן. להתמודד על פי הצהרות זהירות מתאימות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום ללחץ חמצוני על ידי גן לדפוק למטה: Knock-למטה ביטוי גני nrf2a בעוברי דג הזברה על ידי microinjection morpholino כפי שדווח בעבר על ידי Timme-Laragy א ואח&#39;, 2012 38.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום אוקסידative מתח לאחר נזק לרקמות: לייצר שולי פצע בסנפיר הזנב של עוברי דג הזברה ב72 hpf כפי שתואר בעבר על ידי Niethammer ואח&#39;, 2009 39.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לשיטת ROS איתור תא בודד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לגילוי ROS כללי: ממיסים את הבדיקה המולקולרית ROS רגישה גנריים בHBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס) על מנת להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: בין 2.5-10 מיקרומטר). פתרון זה חייב להיות מוכן זמן קצר לפני השימוש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לגילוי ספציפי הנגרם על ידי ROS המיטוכונדריה: זמן קצר לפני השימוש, לפזר בדיקה ROS רגישה המיטוכונדריה עם DMSO מה שהופך את פתרון מניות 5 מ&quot;מ. ממיסים פתרון מניות בHBSS כדי להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: בין 2.5-10 מיקרומטר). הערה: הימנע מחשיפה לאור וחמצן של פתרונות עובדים ROS איתור ופתרונות המניות שלהם. להגן על הצינור מפני אור על ידי שימושרדיד אלומיניום. אל תאחסנו או בדיקות שימוש חוזר מומסים בHBSS. אחסן את פתרונות המניות ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודש. התראה: טפל בבדיקות מולקולריות וDMSO מתחת למכסה המנוע קטר בהתאם להנחיות מתאימות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לכל שיטת ההר ROS-זיהוי: ממיסים את הפתרון גנרי ROS רגיש מניית הבדיקה (התייצב בDMSO) בHBSS כדי להכין פתרון עובד (טווח ריכוז: 2.5-5 מיקרומטר). הימנע מחשיפה לאור וחמצן. להגן על הצינור מפני אור. הכן את הפתרון הזה לפני השימוש. אין לאחסן מחדש או להשתמש בפתרון זה. התראה: טפל בבדיקות מולקולריות מתחת למכסה המנוע קטר בהתאם להנחיות מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 25 מיליליטר של Stop פתרון על ידי הוספת 10 מיליליטר של סרום שור עוברי ל15 מיליליטר של PBS 1X. שמור על תמיסה סטרילית. אחסן את הפתרון הזה ב 4 ° C. פתרון זה נדרש אך ורק לתא בודד - שיטת זיהוי ROS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החממה באוויר דג הזברה ב28 &amp;# 176; ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צנטריפוגות ב 4 ° C למשך שיטת ROS איתור תא הבודד. </li></ol> 2. זיווג של דגים למבוגרים ובחירה של עוברי דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג דג הזברה מבוגר ההגדרה חוצה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 40. בחר את הקו המהונדס המתאים בהתאם לצרכי ניסוי ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים ומניחים אותם לתוך צלחת 90 ​​מ&quot;מ עם מדיום מים דגים / עובר. שמור על ביצים ב28 ° C עד עוברים יתפתחו ויגדלו לשלב ההתפתחותי הרצוי (למשל, 48 hpf, 72 hpf; hpf: שעות שלאחר הפריה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך לפיתוח עוברים. אל תכלול את כל ביצים מופרה או עובר לא מפותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עוברים על ידי הוספת 1 מיליליטר של tricaine (פתרון מניות) ב50 מיליליטר מים דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עוברי ניאון Tg תחת סטראו. </li></ol> 3. טיפול בעוברים עם אוקסידנט סוכן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לפחות 30 עוברים בין 48 שעותPF ו72 HPF למצב שונה. שטוף עוברים פעמיים עם מים דגים טריים על מנת להסיר tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול עוברי ניאון לשלוש מנות. שים לא יותר מ 30 עוברים / צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הכביסה ולהוסיף 10 מיליליטר של פתרון החמצון או 10 מיליליטר מים דגים כפתרון שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר במשך 10 דקות לשעה 1 ב28 ° C. תקופת הדגירה תלויה ברמה של סטרס חמצונים להיות מושרה ברקמות ספציפיות. תקופות קצרות הן הטובות ביותר כתאים מושפעים מלחץ חמצוני בהדרגה לעבור מוות של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עובר לתוך צלחת חדשה המכילה HBSS ועוברים שטיפה על ידי מתערבל. HBSS טרום חם ב28 ° C. </li></ol> 4. ההר שלם ROS איתור שיטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר לאחר טיפול חמצון ולשים לא יותר מ 10 עוברים בשפופרת קטנה. לשטוף עם HBSS ככל האפשר. להגן על הצינור מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת ROS איתור לצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר בחושך במשך 15 דקות ב28 ° C כדי למנוע חשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך זמן הדגירה להכין שקופיות זכוכית לניתוח עובר שלם. שים 300 μl של methylcellulose בשקופית זכוכית &quot;דיכאון&quot; ופרש אותה על משטח הזכוכית עם קצה פיפטה. למנוע בועות בזמן שחרור methylcellulose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף זמן הדגירה, להסיר באופן מיידי את פתרון ROS איתור ולשטוף פעמיים עם 2 מיליליטר של HBSS. שטוף עוברים על ידי צינור היפוך כמה פעמים. אל פיפטה או מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים לשאוב לתוך זכוכית פיפטה פסטר. עוברי עמדה ליד הפתח של פיפטה ובעדינות להוציא אותם לתוך methylcellulose. להתמצא העוברים כראוי עם קו ניילון דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את הקרינה של עוברי שליטה עם עוברים שטופלו. לחלופין, לתקן את הפרמטרים של סטראו הקרינה או מיקרוסקופ confocal, כך שכל העוברים הם צילמו באמצעות אותוהגדרות הדמיה. </li></ol> 5. שיטת ROS איתור תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל מצעד: 3.5. לוודא שיש לפחות 35 עוברים לכל מצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים לתוך צלחת חדשה. הסר מים דגים עד כמה שניתן. הוסף 10 מיליליטר של קר כקרח PBS 1X ו400 μl של קוקטייל מעכבי פרוטאז. ידני dechorionate עוברים עם מלקחיים ולהסיר את שק החלמון עם מחט עדינה. הערה: הסרת שק חלמון מבטיחה דגימות נקיות לניתוח FACS הבא. ניתן להימנע בשלב זה על פי מכשיר FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים-yolked דה לתוך צלחת 24 גם multiwell (15 עוברים / טוב) ולהסיר את כל המים הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של HBSS, 30 P collagenase μl, 50 μl טריפסין-EDTA בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize עוברים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם טיפ חזק פיפטה (1,000 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על C ° 28 עבור 20 דקות וhomogenize דגימות על ידי pipetting כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק disr רקמהuption ידי התבוננות aliquot של homogenate במיקרוסקופ המתחם. להקל על השעיה תא בודדת על ידי pipetting. אל דגירה עובר במשך יותר מ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 200 μl של להפסיק פתרון. מערבבים על ידי pipetting בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההשעיה תא לתוך צינור מראש צונן עם תחתית צמודה. שמור צינור על קרח ולהימנע מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 250 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השלב העליון ותאים מחדש להשעות עם HBSS הקר כקרח בעדינות על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ולוודא שיש לך את אותו המספר של תאים בכל הדגימות שלך. אל תשתמשו בפחות מ -2 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב250 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ולהשעות את גלולה עם 1 מיליליטר של HBSS המקורר קרח המכיל את הבדיקה ROS רגישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות בחושך. להשתנות זמן דגירה על פי הרמה של סטרס חמצונים וכדי לאהוא הרגישות של הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים לצינור FACS. שמרו צינורות על קרח ולהימנע מחשיפה לאור לפני ניתוח FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיין תאים עם סדרן הקרינה המופעל תא (FACS). אורכי גל נקבע בהתאם לקרינת Tg רקמות (לדוגמא, ה-GFP) ואת ספקטרום עירור / פליטה של החללית המולקולרית המשמשת לזיהוי ROS (למשל, בדיקות ROS רגישות המיטוכונדריה ספציפיות, בדיקות ROS רגישות גנריות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי, למדוד את כל הדגימות באותה ההפעלה הניסיונית על ידי יישום אותן הגדרות FACS. לחשב את אחוז תאי ניאון כממוצע של משכפל ביולוגי שונה. לנתח לפחות שתי חזרות לכל מצב. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שלבים קריטיים ההליך לגילוי עקה חמצונית בעוברי דג הזברה שתוארו במסמך זה כולל שתי שיטות שונות. שיטת ההר ROS איתור כולו היא בעיקר assay איכותי לROS איתור, ואילו בשיטת ROS איתור התא הבודד מאפשרת מדידות כמותיות ספציפיות יותר (איור 1). שני השיטות מציעות דרך קלה ומהירה כדי להעריך את in vivo ROS איתור על עוברי דג הזברה. עם זאת, שניהם יציגו כמה שלבים קריטיים. <p class="jove_step" style=";text-a...

סטרס חמצונים מוגדר באופן ספציפי כתנאי הנובע ממצב חיזור סלולארי לא מאוזן. תגובות חיזור מורכבות המתרחשות באופן שיגרתי בתוך תאים לקבוע את חיזור המדינה הסלולרית. תגובות חיזור מורכבות מכל התגובות כימיות מורכבות בהעברת אלקטרונים בין האטומים של מולקולות ביולוגיות ייצור חיזור וחמצון של מולקולות (כלומר תגובות חיזור). התגובות הללו הן זרז על ידי מינים מופעלים באופן אלקטרוני (כלומר מינים פרו חמצוני-), המתאפיינים בחוסר יציבות מבנית קיצונית והפעלה ספונטנית של אלקטרונים לא מאוזנים שיחליפו עם ביומולקולות השכנה. תגובות לא סדירות אלה לגרום לניזק לדנ&quot;א, carboxylation חלבון, וחמצון שומנים בדם, וסופו של דבר להוביל למוות של תאי 1. הרמות גבוהות של סטרס חמצונים כבר הקשורות להזדקנות וההתפתחות של מצבים פתולוגיים שונים 2. יש סטרס חמצוניםדווח להיות אחראי לשינויים בכלי הדם בסוכרת ומחלות לב וכלי דם 3,4. זה גם משחק תפקיד קריטי בניוון עצבי במחלת אלצהיימר ופרקינסון 5. יתר על כן, סטרס חמצונים הוכח כגורם קריטי בשלטון התקדמות סרטן ואירועים גרורתי 6,7. בנוסף, תגובות דלקתיות והחיסוניות עשויות לעורר לחץ חמצוני ותמיכה נוספת 8. בתאים חיים, מינים הפרו חמצוני נגזרים מהחמצן (ROS; מיני חמצן תגובתי) או חנקן (RNS; מיני חנקן תגובתי). ROS כולל הידרוקסיל רדיקלי, אניון superoxide (OH). (O 2 -), ומי חמצן (H 2 O 2). RNS העיקרי הוא תחמוצת חנקן (NO).. סדרה של מינים תגובתי משניים יכולה להיות שנוצרה על ידי אינטראקציות ספונטניות between ROS וRNS או מתכות בחינם יוני 9. לדוגמא, אניון סופראוקסיד מגיב עם תחמוצת חנקן ליצירת peroxynitrate (ONOO -), ואילו H 2 O 2 מגיב עם Fe 2 + יוצר רדיקלים הידרוקסיל. ROS וRNS, בשל יכולתם להגיב עם כמה ביומולקולות, נחשבים איום מסוכן לשמירה על מדינת חיזור הפיזיולוגית 10. כדי לשמור על תאי מדינת חיזור מצוידים בסדרה של רעלים מולקולות נוגד חמצון ואנזימים. סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), Catalase, peroxidase גלוטתיון וPeroxiredoxins בעצם מהווים האנזימטית-הארסנל נוגד חמצון המספק הגנה תאית ממינים פרו חמצוני כוללים H 2 O 2, OH וOONO -. 11. גם מולקולות נוגדת חמצון כמו הוויטמין C ו-E, פוליפנולים וCoenzymeQ10 (CoQ10) הן בעלי חשיבות קריטית כדי להרוות ROS ודה המסוכנת שלהםrivatives 12,13. עם זאת, ייצור מוגבר של ROS וRNS, או חוסר תפקוד במערכת נוגד החמצון, מסיט את חיזור המדינה הסלולרית לסטרס חמצונים 14. חוץ מהקונוטציה השלילית שלהם, ROS יכול לשחק תפקידים פיסיולוגיים שונים בתאים ממוצא שונה. תאים בדרך כלל מייצרים ROS כמולקולות איתות לתווך אירועים ביולוגיים נורמלים כגון הגנת מארחת ותיקון פצע 15-17. מינים תגובתי בדרך כלל מיוצרים בתאים על ידי אנזימים תאיים כגון NOX (NADPH אוקסידאז) וXO (Xantine אוקסידאז) בתגובה לגורמי איתות, גורמי גדילה, ותנודות תאיים של רמות סידן 18,19. זה כבר דווח כי ROS עשוי דיפרנציאלי לווסת את פעילותם של גורמים גרעיניים חשובים כגון p53 או מרכיבים תאיים כגון ATM-kinase, רגולטור של התגובה לנזק לדנ&quot;א 20. באנלוגיה ROS מאוד להשפיע איתות הסלולר על ידי תיווך החמצון דואר ואיון של phosphatases החלבון טירוזין (PTPs), אשר הוקם כמכרעת בויסות העברת האותות 21. יתר על כן, שיטות proteomic מבוססים להוכיח כי RNS כן הם אחראים לשינויים חלבון מסוימים ושינויים של איתות מולקולרית. RNS להגיב עם קבוצות תיאול ציסטאין שינוים לS-nitrothiols (SNO) ומפעילות מסלולים מולקולריים במקביל למצבים פתולוגיים כגון מחלות דלקתיות ואוטואימוניות 22,23. מאז ניסויי תרבית תאים באופן חלקי בלבד לשכפל מספר רב של גורמים הפועלים בvivo, זה הוא עניין רב לבצע מחקרי חיזור במודלים של בעלי החיים 24,25. כדי להשיג זאת, דג הזברה כבר נחשב מודל בעלי חיים בעלי חוליות מתאים ללמוד דינמיקת סטרס חמצונים 26. דג הזברה היא מודל למערכת חדשה המעניקה מספר יתרונות ללמוד אירועים תאיים וגנטיים בdev חוליותelopment ומחלות. אשכולות גדולים של עוברים יכולים להיות שנוצרו וזמינים שבועיים לצרכי ניסוי. יתר על כן הבהירות יוצאת דופן האופטית של עוברי דג הזברה, כמו גם גודלם הזעיר, מאפשר הדמיה תא בודדת ומעקב דינמי באורגניזמים שלמים 27. בעשור האחרון, מספר לא מבוטל של מוטציות דג הזברה כבר נוצר למודל מצבים פתולוגיים אדם כגון סרטן ומחלות גנטיות 28-31. והכי חשוב, מספר רב של קווים מהונדסים הופק כדי לאפשר הזדמנויות נרחבות של מניפולציות גנטיות וביולוגיות 32. לדוגמא, קווי דג הזברה רקמות ספציפיות מהונדסים מנוצלים באופן קבוע במחקרי vivo. קווים אלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של אמרגן שנבחר, המציע את היכולת לזהות תאים בודדים in vivo, כמו גם את המבנה האנטומי שהם מהווים. מספר מחקרי טוקסיקולוגי כבר השתמשו tהוא דג הזברה כדי להעריך את השפעת vivo של כימיקלים על הומאוסטזיס חיזור, מה שמראה את התאמתם של חוליות זו כמודל חיה לתחום של גילוי תרופות וסטרס חמצונים 33-35. למרות כמה בדיקות ניאון נבדקו כדי לפקח על סטרס חמצונים בזחלי דג הזברה 36,37, אין מבחני הוקמו כדי לזהות ולמדוד את הרמות של סטרס חמצונים ברקמות דג הזברה ותאי חיים. כאן אנו מתארים הליך לכימות in vivo של סטרס חמצונים בתאים חי של עוברי דג הזברה. כל כלי הדמיה, FACS מיון, בדיקות ניאון ותנאים פרו חמצוני משולבים כדי ליצור assay פשוט לאיתור והכימות של מיני חמצוני בעוברים ורקמות דג הזברה.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מי חמצן</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>אין לאחסן דילולים</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>מתיל תאית</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>אינסטנט אוקיינוס אקווריום תערובת מלח ים</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה רגישה ל-ROS של Cgeneric: מגיב אדום עמוק של CellROX</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה רגישה ל-ROS ספציפית למיטוכונדריה: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>ממיסים בקבוקון אחד עם 13 &mu; l של DMSO</td></tr><tr><td>הידרואתידין</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>הכן תמיסת מלאי של 5 מ"מ ב-DMSO.&nbsp;</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-בנזיל-7-(2-בנזוקסזוליל)תיו-1,2,3-טריאזולו(4,5-d)פירימידין</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>ממיסים את האבקה ב-DMSO; דילויט במי דגים</td></tr><tr><td>פרופידיום יודי&nbsp;</td><td>בדיקות מולקולריות (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)&nbsp;</td><td>בדיקות מולקולריות (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td>: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); קוביאשי et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>קולגנאז P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>להמיס את האבקה ב-100 מ"ג/מ"ל ב-HBSS סטרילי. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז מלא</td><td>ROCHE</td><td></td><td>ממיסים טבליה אחת ב-1 מ"ל מים</td></tr><tr><td>0.5% טריפסין-EDTA (10x), ללא פנול אדום</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>הכן תמיסת עבודה אחת לפני השימוש</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מורכב&nbsp;</td>מיקרוסקופ סטריאו <td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם תאורת פלואורסצנט</td><td>מצלמת Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr> תוכנת <tr><td></td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>לרכישת תמונות פלואורסצנטיות</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי</td><td>BD FACSצנטריפוגת קליבור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>צינורות <td>FACS של Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plate&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי מעוקרות ולא מטופלות 90 מ"מ</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

רמות גבוהה של מיני חמצן מגיבים (ROS) עלולות לגרום לשינוי במצב חיזור הסלולרי למצב עקה חמצונית. מצב זה גורם לחמצון של מולקולות (שומנים בדם, ה-DNA, חלבונים) ומוביל למותם של תאים. סטרס חמצונים גם משפיע על ההתקדמות של כמה מצבים פתולוגיים כגון סוכרת, Retinopathies, ניוון מוחיים, וסרטן. לפיכך, חשוב להגדיר בכלים כדי לחקור תנאי עקה חמצונית לא רק ברמה של תאים בודדים, אלא גם בהקשר של כל האורגניזמים. כאן, אנו רואים את עובר דג הזברה כשימושי במערכת vivo לבצע מחקרים כאלה ומציגים פרוטוקול למדידת לחץ חמצוני in vivo. ניצול של בדיקות ROS ניאון וקווי ניאון מהונדסים דג הזברה, אנו מפתחים שתי שיטות שונות למדידת לחץ חמצוני in vivo: ט) &quot;שיטה כל עובר ROS איתור&quot; למדידה איכותית של סטרס חמצונים וii) &quot;תא בודד שיטת ROS זיהוי &quot;למדידות כמותיות של סטרס חמצונים. בזאת, אנחנו מדגימים את יעילותם של הליכים אלה על ידי הגדלת לחץ חמצוני ברקמות על ידי סוכני חמצון ושיטות פיסיולוגיות או גנטיות. פרוטוקול זה הוא נוח למסכים גנטיים קדימה וזה יעזור לי יחסי כתובת סיבה ותוצאה של ROS במודלים של בעלי חיים של פתולוגיות הקשורות ללחץ חמצוני כגון הפרעות נוירולוגיות וסרטן.

על ידי יישום השיטה שתוארה כאן, אנו יכולים בקלות למדוד ולזהות סטרס חמצונים (ורמות ROS) ברקמות עוברי דג הזברה. לאחר חציית דג הזברה מבוגר, ביצים נאספות ואפשרו לפתח ב28 C ° 72 הודעה hr הפריה (hpf). על מנת לגרום ללחץ חמצוני, אנו מציעים שתי גישות שונות: 1) טיפול בעוברים עם ריאגנטים פרו חמצון חזקים או 2) ההשקעה בROS קידום לאחר פגיעה ברקמות. בגישה הראשונה, שהעסקנו שני חומרים כימיים שונים, בהתאם לצרכים הספציפיים: מי חמצן ...

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול למדידת מתח חמצוני בעוברי דג זברה חיים. הליך זה מאפשר זיהוי מיני חמצן תגובתיים (ROS) הן ברקמות עובר שלמות והן באוכלוסיות תאים בודדים. פרוטוקול זה יבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים כאחד.

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד באופן איכותני וכמותי עקה חמצונית בעוברים חיים של דגי זברה. זאת משיגים על ידי הוספת תמיסה חמצונית לעוברים שהוכנו להשראת עקה חמצונית, או על ידי יצירת שולי פצע בסנפיר הזנב של העובר. לאחר מכן, העוברים מעובדים לזיהוי עקה חמצונית באמצעות שיטת תא בודד או באמצעות שיטת הרכבה מלאה (whole mount).בשלב הבא, מדגריים את הדגימות עם גשש לזיהוי Ross. התוצאות יכולות להראות את מידת העקה החמצונית ואת רמת ה-Ross בהתבסס על מיקרוסקופיה קונפוקלית של דגימות שלמות או ניתוח ציטופלואורומטרי של תאים בודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון immuno Fluor לסממני עקה חמצונית, הוא שהיא מאפשרת זיהוי גולמי בהקשר של אורגניזם חי וכמימות ברמת רקמות בודדות.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום המחקר הבסיסי, כגון חקירת תנאי עקה חמצונית בהקשר של מצב פתולוגי. אנשים שאינם מנוסים בשיטה עלולים להיתקל בקשיים עקב נזק מקרי לרקמה, מכיוון שגששים מולקולריים רגישים במצבם הגולמי עלולים להוות מקור לא רצוי לחומציות. בנוסף, מכיוון שרמות גבוהות של עקה חמצונית עלולות להוביל למוות תאי, בעוד שרמות נמוכות מדי עשויות להיות קשות לזיהוי ללא ניסיון וניסויים, סוגיות אלו יבואו לידי ביטוי רק במהלך העבודה. בעת הכנת התמיסה להשראת עקה חמצונית במיטוכונדריה המורכבת מ-rot known ב-DMSO, יש להשתמש בתמיסת stock של rot known בריכוז שבין 5 ל-50 µM, ולעולם לא מעל 100 µM, שכן rotten known הוא רעיל ומסוכן.יש להקפיד על אמצעי הזהירות המסומנים. תמיסת הגשש לזיהוי חורי Mount Ross לא תחשף לאור או לחמצן במהלך הכנתה, ויש להכינה באופן טרי עבור שיטת זיהוי Ross בתא בודד. יש להכין תמיסת עצירה של FBS ב-PBS ולשמור אותה בטמפרטורה של 4°C.הכנות נוספות כוללות כיוון של דגגירת האוויר של דגי הזברה ל-28 °C, ועבור שיטת התא הבודד, קירור הצנטריפוגה ל-4 °C. ביצוע ההכלאות של דגי הזברה, איסוף העוברים וההרדמה הושלמו. באמצעות מתודולוגיה סטנדרטית, אספו את העוברים הרלוונטיים בין 48 ל-72 שעות לאחר ההפריה.לאחר הרדמת העוברים, שטפו את חומר ההרדמה פעמיים, ולאחר מכן העבירו את העוברים לשלוש צלחות, כאשר בכל צלחת לא יעלו על 30 עוברים, לצורך זיהוי גולמי של תא בודד. אספו לפחות 35 עוברים לכל תנאי במספר צלחות. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת מחמצן או תמיסת ביקורת שלילית.הוסיפו 10 milliliters של מים, ולאחר מכן המתינו 10 עד 60 דקות בזמן שהעוברים מדגירים בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. כמו כן, חממו מראש HBSS לטמפרטורה של 28 degrees Celsius לצורך השטיפה. לאחר הדגירה, העבירו את העוברים לצלחית חדשה המכילה HBSS חמים וסובבו בעדינות.לאחר מכן, המשיכו לזיהוי Ross בשיטת whole mount או בתא בודד. אפשרות פיזיולוגית יותר היא השראת עקה לאחר פגיעה ברקמה באמצעות טכניקת פציעת סנפיר הזנב שתוארה על ידי NI Tomer וחב'. לאחר הטיפול בחומר מחמצן, העבירו קבוצות של עד 10 עוברים למבחנות קטנות.שטוף אותם היטב עם HBSS והגנם מהאור בעזרת נייר אלומיניום. לאחר מכן, הוסף מיליליטר של תמיסת גילוי גולמית לכל מבחנה והדגס את המבחנות למשך 15 דקות ב-28 degrees Celsius בזמן הדגסה. הכן זכוכית למשטח מיקרוסקופ שתכיל הן את ביקרת הבקרה והן את התנאי הניסויי.כסו שקופית עם שקע באמצעות 300 µL של מתילצלולוז. הימנעו מיצירת בועות בעת הזרקת המתילצלולוז. לאחר דגירת העוברים, החליפו במהירות את התמיסה במבחנות ב-2 mL של HBSS והפכו את המבחנות מספר פעמים כדי לשטוף את העוברים.לאחר מכן, שאבו את העוברים אל קצה המיקרו-פיפט והניחו אותם בעדינות על השקופית המטופלת. כוונו את מיקום העוברים באמצעות חוט ניילון דק והמשיכו בניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי. הקפידו לנתח את כל העוברים תחת אותן הגדרות.העבירו את העוברים משטיפת ה-HBSS לצלוחית חדשה, תוך הסרה של כמה שיותר מהתמיסה. כעת בצעו הסרה ידנית של המעטפת (dec oate) מהעוברים. שלב זה הכרחי על מנת לפרק את העוברים לתאים בודדים.בשלב הבא, העבירו את העוברים לפלטה של 24 בארות, כאשר בכל בארה מוכנסים 15 עוברים. באופן אופטימלי, יש למלא שלוש בארות עבור כל תנאי. לאחר מכן, הסירו את כל התמיסה והחליפו אותה ב-300 microliters של HBSS, ב-30 microliters של collagenase p וב-50 microliters של trypsin EDTA.באמצעות טיפ של פיפט של מיליליטר אחד, הומוגניזרו את העובריים על ידי טריטורציה. לאחר שכל הבארות הוכנו, העבירו את הפלטה ל-28 degrees Celsius למשך 20 דקות לפחות; בכל חמש דקות, בצעו טריטורציה לדגימות כדי להבטיח הומוגניזציה טובה. כמו כן, הניחו מספר מבחנות מיקרו-צנטריפוגה על קרח לצורך איסוף הרקמות כאשר יהיו מוכנות.לאחר 20 דקות, קחו דגימה ובדקו תחת מיקרוסקופ שהרקמה התפרקה לתליה של תאים בודדים. אם לא, המשיכו את האינקובציה עד ל-30 דקות בסך הכל. כאשר הרקמה מוכנה, עצרו את התגובה באמצעות 200 µL נוספים של תמיסת עצירה.ערבבו זאת עם TRI באמצעות טיפ פטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, העבירו את תכולת כל באר לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה שקוללה מראש ושמרו את השפופרות הללו על קרח, הרחק מהאור. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-250 GS למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון באמצעות שאיבה. השהה מחדש את משקע התאים ב-HBSS קר במגש קרח באמצעות טריטורציה עדינה, וודא שבסספנסיות ישנם לפחות 2 מיליון תאים. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של תמיסת הגשוש (probe) הרגישה הגולמית.דגרו אותם בטמפרטורת החדר ובחושך למשך כ-three minutes. התאימו את זמן הדגירה באופן אמפירי. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנות fax המוגנות מאור.המשיכו בניתוחי FACS כדי לזהות את הסמן הטרנסגני. פלואורסצנציה ופלואורסצנציה של גשש Ross במהלך הניתוח שלכם. חשבו תמיד את רמות האובדן כעלייה פי (fold increase) בהשוואה לדגימות ביקורת, וזאת כדי לנרמל את הפלואורסצנציה של הרקע.נעשה שימוש בשיטת Mount Ross לצורך בדיקת הצטברות של מימן פראוקסיד באתר פצע. זנבות שלמים ופצועים הושוו לאחר 20 דקות של טיפול בחומר מחמצן. אות לא ספציפי זוהה בשני המצבים.אותו ניסוי בוצע עם טיפול מקדים של העוברים להורדת רמות המימן-פרוקסיד. שימוש במעכב OX VAs 28 70 חשף כי האותות שזוהו אכן היו תלויים בצבירת Ross rot. עוברים שעברו טיפול ידוע בוחנו גם באמצעות whole mount.תחת הגדלה גבוהה ניתן היה לזהות אזורים אנטומיים. הדבר הניב Ross כפי שצוין על ידי ספירת פלואורסצנציה של תאים חיוביים ל-Ross באמצעות פקס, שבוצע לצורך זיהוי של תא בודד של Ross. ניתוח זה בוצע ללא הכללת תאים מתים. ביקורת.נותחו גם תאים ללא טיפול. השוואה של תוצאות אלו הפכה את הכמות של הצטברות Ross לקלה מאוד. הבדיקה מתגלה כמעולה לבחינת כל מספר של מניפולציות ניסיוניות.לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצעה בתוך 90 דקות אם היא מבוצעת כראוי. זכרו כי עבודה עם גששים מולקולריים עלולה להיות מסוכנת ביותר ומצריכה זהירות. יש להשתמש תמיד בכפפות בעת ביצוע הליך זה.

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דג זברה מייצג מודל חוליות חזקה שהיה תחת מנוצל למחקרים מטבוליים. כאן אנו מתארים את הדרך מהירה...

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

סרטון זה מדגים בדיקה רגישה ביותר המבוססת על אימונופלואורסנציה לאיתור נזק חמצוני הנגרם על ידי PM2.5 בליבם של עוברי דגי זברה על ידי מדידת רמות 8-OHdG ו- γH2AX, המצביעות על נזק לדנ"א ושברי DNA דו-גדיליים, בהתאמה.

בדיקת Immunofluorescence לזיהוי נזק ל- DNA בתיווך PM2.5 בעוברי דגים

הפרעות גנטיות מסוימות או חשיפה לרעלים עלולות לשבש תהליכי התפתחות תקינים ולהוביל למוות של סוגי תאים ספציפיים. הניתוח של Caspase 3 המופעל על ידי אימונופלואורסצנציה שלמה בעוברי דג הזברה חושף לוקליזציה ספציפית לשלב ולרקמות של תאים העוברים אפופטוזיס באופן ספציפי.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי.  על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ליקויים התפתחותיים חמורים.

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.

שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה

דג הזברה נוצל לאחרונה כמודל לאימות משנים פוטנציאליים של קרינה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים המפורטים לשימוש בעוברים של דגי זברה לניסויי סינון מבוססי קרינה וכמה גישות תצפיתיות להערכת ההשפעה של טיפולים וקרינה שונים.

זחלי דגי זברה כמודל להערכת רדיוסנסיטיזרים או מגינים פוטנציאליים

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרוסקופ אור בעלות נמוכה להערכת מורפולוגיה ותפקוד לב בעוברי דג זברה, המאפשרת הערכה ניתנת לשחזור של רעילות לב התפתחותית ללא צורך במערכות הדמיה מתקדמות.

הדמיית לב תפקודית בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית וניתוח וידאו: יישומים במחקר סביבתי וביו-רפואי

למדו לנתח סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה בשיטה חיה וכמותית. הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופיית קונפוקל ובדיקה ציטופלואורומטרית לזיהוי ROS ברקמות שלמות ובתאים בודדים.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

גלה סרטונים נוספים