Name: תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: למד שיטות הזרקה של צבעים, DNA ותאים בלבבות עכבר עובריים לחקירת גורל תאים ותפקוד גנים. טכניקות אלו מאפשרות מניפולציה מדויקת של תאים וגנים בסביבה פיזיולוגית אמיתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים הקרן Leducq (מיטרלי) וNationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (מענק ANR Specistem) למימון מחקר זה.

1. הכנה נהלי בעלי חיים לקבל אישור מועדת אתיקה של בעלי חיים ופעל בהתאם להנחיות מוסדיות לעבודה עם וירוס, HuESC ו / או iPSC (כאשר רלוונטי), כמו גם טיפול בעכבר, קבלת עוברי עכברים, וביצוע ניתוחי עכבר. להזדווגויות מתוזמן, היום של התקע נחשב יום עוברי 0.5 / 0.5 ימים לאחר coitum-(E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי Microinjection: עבור לשעבר רחם microinjection, למשוך טפטפות זכוכית (צינורות נימי ורוסיליקט הקוטר חיצוניים 1.2 מ&quot;מ) באמצעות חולץ פיפטה / beveller לקבל מיקרומטר קוטר 1 או 10 פנימי קצה וצורת קצה חדה וחרוטים להזריק DNA או תאים, בהתאמה. זריקות בתיווך אולטרסאונד, שימוש מותאם אישית מחטים סטריליות, אשר יש קוטר חיצוני / פנימי (OD / ID) של 1.14 mm/0.53 מ&quot;מ, עם טיפ 50/35 OD מיקרומטר / זהות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי מלאות סיליקון: הכן סיליקון כפי שמתואר במדריך. למלאצלחת פטרי זכוכית נקייה 60 קוטר מ&quot;מ עם שכבת אלסטומר של ~ 1 סנטימטר. למנוע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים: שמור את כל מכשירי ניתוח סטרילי לפני ובמהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ה-DNA: הוסף 3 DNA מיקרוגרם ו12 μl Opti-ממ בצינור אחד. הוסף 3 Lipofectamine μl 2000 ו12 μl Opti-ממ בצינור אחר. דגירה במשך 5 דקות ב RT ולערבב את שני הפתרונות. השתמש באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תא: הכן השעיה של 10 6 תאים / מיליליטר DMEM (של Dulbecco נשר בינוני, גלוקוז גבוה ו50% בסרום חולדה). 50 μl של השעיה תא הסופית הוא מספיק ל8-10 עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוע הכנה: השתמש בניאון הירוק CDCFDA-SE ב25 מ&quot;ג / מיליליטר DMSO. הכן 20 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C. לדלל 1:100 / 1:200 בתמיסת מלח או PBS סטרילי לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת וירוס: השתמש-GFP-לבטא PGK lentivirus דור 3 rd מסחרי עם כייל של ~ 10 9 -10 10 טרהnsducing יחידות / מיליליטר DMEM. להכנת lentivirus, ראה Tiscornia et al. 14 ללבוש ציוד מגן אישי ולהשתמש בבטחה ובלהיפטר מנגיף. </li></ol> 2. אוסף של E9.5 וE10.5 עוברים לvivo הזרקה אקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בהריון ביום עוברי 9.5 או 10.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את החזה והבטן של העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע הגחון כדי לפתוח את הבטן ולאחזר את קרן הרחם ב RT ב-PBS ולהעביר אותו אחרי שני שוטף PBS לצלחת פטרי המלא בסיליקון עם מדיום M16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את קרן הרחם עם סיכות חרקים לשכבת סיליקון כך שצד vascularized של הרחם הוא בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את פני השטח של הרחם עם מלקחיים בסדר, וכובע של decidua ב1 מ&quot;מ מתחת לפני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשלוף את העובר בצק החלמון ע&quot;י פרישת קירות decidua. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העוברים על 37 מעלות; C בM16 בינוני לפני הזרקת תא. להזרקה, כל עובר מועבר לצלחת סיליקון מלאה בינוני M16 מראש חימם על 37 ° C. </li></ol> 3. DNA או הזרקת תאים תחת סטראו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את פיפטה הזכוכית מהחלק האחורי עם מזרק המילטון ולנער את פיפטה כדי להסיר בועות בקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פיפטה על בעל microinjection; להגדיר את הלחץ החזק ל50 (DNA) או 30 (תאים) hPa, ולחץ ההזרקה 150 ל( DNA) ל300 (תאים) hPa. קבע את זמן הזרקה ל0.2 שניות (DNA) או 0.5 שניות (תאים). הגדרות אלה עשויות להשתנות מעט בהתאם לסוג של microinjector ופיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העובר לתחתית סיליקון דרך שק החלמון בלי לגעת בעובר התקין. צפה באזור של הלב ולפתוח את השק רק מעל אזור זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 סיכות סביב העובר כדי למנוע כל תנועה במהלך הזרקת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micromanipulator (למצב ידני), slowlמיקום Y קצה פיפטה בזווית של ° 45 מעל קרום הלב, בדיוק מעל האזור של הלב שהוא להיות מוזרקים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את פיפטה לתוך האזור של עניין ולעורר את הזריקה. קח את פיפטה מהר ככל האפשר. ודא הלב פועם כהלכה לאחר הזרקת ה-DNA / תא. </li></ol> 4. עובר, לב מבודד, וexplant תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות עוברי E9.5 ב25% בינוניים M2 ו75% בסרום עכברים, השלימו עם פניצילין / סטרפטומיצין, מראש חימם על 37 מעלות צלזיוס וחומצן עם 40% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מדיום תרבות מיליליטר בשפופרת זכוכית 25 מיליליטר, בעדינות להוסיף את העובר, וחמצן עם 40% O 2 לפני הברגת הכובע על הצינור. דגירה עד 36 שעות על 37 מעלות צלזיוס בעוד סיבוב או טלטול (30 סיבובים / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הזמן הרצויה (למשל 24hr), לנתח את לבם בזהירות עם מלקחיים בסדר, בלי לגעת בלבם, על ידי דה הראשוןcapitating העוברים; הלב הוא קל לבלו על ידי משייכתו החוצה באמצעות מערכת יצוא דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מבודדת לב עבור שעות נוספות 36-48 DMEM עם FCS 50% על הוספת Matrigel מצופה נקבעה ב12 גם צלחת. ראה דאייר ופטרסון (2013) לפרוטוקול משופר של לב תרבות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את כל explant של האזור של עניין. כדוגמא, לנתח את תעלת atrio-חדרית (AVC) ותרבותה ל48 ​​שעות על קולגן סוג 1 ג&#39;ל 16. </li></ol> 5. הזרקה מונחה אולטראסאונד שבלב n רחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה של מכשיר אולטרסאונד וmicroinjector: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת אולטרה סאונד ברזולוציה גבוהה עם מתמר 40 MHz והתקנת microinjection על מעקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את עוצמת הזריקה על microinjector ב69 NL לכל זריקה. ראה מדריך לmicroinjection של היצרן עבור תכנות microinjector. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת microiהתקנת njection והזרקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח micropipette זכוכית בmicroinjector. כדי להבטיח הזרקה, מעיל ראשון יעיל בצד הפנימי של פיפטה עם שמן מינרלים על ידי aspirating עד הנפח המקסימאלי. ואז להוציא את השמן שוב, ומשאיר 1-2 מ&quot;מ של שמן בתוך המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב injectate עד לעצמה המרבית. היזהר שלא לגעת במשטחים עם קצה המחט כמו זה יהיה להקהות את החוד ולעשות זריקה קשה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצב את קרן הרחם המכילה את העוברים במהלך הזרקה, השתמש בצלחת פטרי עם הותאם חור באמצע (2.5 ס&quot;מ קוטר), מכוסה על ידי קרום סיליקון דק עם שסע קטן לחתוך במרכז, ולמקם אותו מעל אתר החתך . לייצב את צלחת פטרי על שולחן הטיפול של עכבר על ידי מיקום 3-4 גושים של חימר מתחת לשולי הצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך הזרקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן של עכבר בהריון (בשלב העוברי הרצוי) לפני anestheSIA להסרת שיער. פנק את הבטן עם סוכן הסרת שיער כימי להסרת שיער שייר ולחטא עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בהריון עם החמצן / isoflurane באמצעות מסיכת הפנים. השתמש isoflurane 3-5% ב100% חמצן להרדמה ראשונית, ואחריו 1-1.5% במהלך השאר של ההליך. ודא שהעכבר הוא מורדם כראוי על ידי בעדינות צובט כפות ו / או בזנבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את עכבר פרקדן על שולחן הטיפול של עכבר (שנקבע לחום על 37 מעלות צלזיוס) ולכסות את העיניים עם חומר סיכה על מנת למנוע התייבשות של הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ג&#39;ל האלקטרודה על האלקטרודות וידביק את כפות לאלקטרודות כדי לפקח על קצב לב, קצב נשימה, ואק&quot;ג. מקם מדחום רקטלי כדי לפקח על טמפרטורת גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא תחילה שהעכבר הוא בהריון על ידי הדמיה וסופר את העוברים על ידי אולטרסאונד. החל ג&#39;ל אולטרסאונד על הבטן ומקם את סריקת הראש מעל לשלפוחית ​​השתן. לשם עקביות, לדמיין את שלפוחית ​​השתן ראשון,ולספור עוברים בצד השמאל וקרן רחם תקין, החל מהעמדה של שלפוחית ​​השתן. ודא שלב עוברי מכה כרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם העכבר הוא בהריון, מקם את צלחת פטרי מעל אתר חתך העתיד עם חימר. לחץ על הצלחת מעט על הבטן, כך שהמנה היא במגע ישיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת ולעקר את הבטן שוב. ביצוע חתך קו האמצע הגחון 1.5-2 סנטימטר, כ 0.75-1 ס&quot;מ מעל הנרתיק, כדי לפתוח את הבטן והצפק. הימנע מפגיעה באיברים פנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exteriorize השמאל או קרן רחם תקין עם מלקחיים, בעדינות למשוך אותו דרך קרום סיליקון של המנה, ולייצב את הצלחת על החימר שוב. למנוע נרחב מושכים או מניפולציה, שכן דבר עלול לגרום לדימום של כלי הרחם והמוות בטרם עת של האישה ו / או עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את העוברים שוב על מנת להבטיח רישומים נאותים של עוברים שהוזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ג&#39;ל אולטרסאונד על uקרנות terine לתמונת הלב ועל מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת העובר הראשון שהוזרק. בדקו מכות נורמליות של הלב העוברי ולשמור תיעוד של את כיוון הגולגולת, הזנב ושמאל וימין של העובר. במידת צורך, למקם מחדש את קרן הרחם מעט כדי להבטיח כיוון נכון. אם זה מוכיח קשה, על מנת להעביר את העובר הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את הרחם בזהירות עם מחט microinjection כדי למקם את המחט בזווית של ° 45 מעל העובר, מעט מחוץ לקרום הלב (איור 3). לתיוג של תאי epicardial, תמונת הלב בארבעה חדר תצוגה ולמקם את המחט כך שיצביע לכיוון חריץ atrio-חדרית (איור 3). אם הזווית צריכה להיות מותאמת, לשלוף את המחט, ולמקם מחדש. לא להתאים את הזווית עם המחט בתוך הרחם, שכן זה עלול לשבור את המחט. למנוע ניקוב רקמות אחרות, כגון גפיים או שליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את המחטעל קיר קרום הלב ולנקב אותו עם תנועה עדינה, אבל מהירה. באופן כללי, לא תהיה התנגדות מסוימת, אבל הזזת המחט מהר מדי עלולה לגרום לקצה המחט לנקב את הלב עצמו. טיפ צריך בסופו של דבר בחלל קרום הלב של גרוב atrio-חדרית. במקרה של דימום קרום הלב, תאי דם יהיו גלויים כתבנית כמו שלג לבנה. אם זה המקרה, להפסיק להזריק את העובר ולעבור לעובר אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק injectate. הזרק מקסימאלי 700 NL אל תוך חלל קרום הלב כדי למנוע השפעה שלילית על התפתחות לב. לפקח על ההזרקה הנכונה על ידי נפיחות קלה, זמנית של שק קרום הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, למשוך את המחט החוצה ולאשר כי injectate עדיין יכול להיפלט כדי להבטיח שהמחט לא הייתה סתומה על ידי ברי רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם מחדש את שולחן טיפול לתמונה ולהזריק את העובר הבא. שמור את מספר העוברים המוזרקים למקסימאליים 3-4 (בקרן רחם אחת) כדי למנועהרחיב את ההרדמה, כדי לאפשר לעוברי שליטה בקרן הרחם מתנגדת, וכדי להבטיח שההליך לא הפריע התפתחות עוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהזריק את המספר הרצוי של עוברים, להסיר ג&#39;ל אולטרסאונד העודף ומניח בעדינות את קרן הרחם בחזרה לתוך הבטן בתנוחה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הבטן האימהית באמצעות שכבה אחת של תפר להצפק ואת שרירי בטן, ושכבה שנייה של תפר לעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את העכבר עם המנה הראשונה של תרופות לשיכוך כאבים. השתמש בזריקה אחת של 0.05-0.1 דקות מ&quot;ג / קילוגרם עצירות 15 לפני סיום הרדמה ושלוש זריקות נוספות עם 12 מרווחי שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את ההרדמה ולנטר את העכבר להתאוששות נאותה מההליך. בית העכבר בהריון בכלוב נפרד למשך הרצוי של מעקב. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li>
<li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li>
<li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+the+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li>
<li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vix.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

לשעבר פרוטוקולי ההזרקה תוך לב vivo שתוארו לעיל נועדו לשמור על תפקוד שריר הלב לפחות 48 שעות באמצע הבמה עוברים (E9.5-E11.5) עכבר. הזרקת גישות אלה מאפשרים להזרקה ממוקדת במרחב של ה-DNA או תאים. כמה דוגמאות שמוצגים איורים 1-3 לספק הוכחה של קונספט להתוויית vivo לשעבר ובמנגנונים מולקולריים vivo של תהליכים התפתחותיים המתרחשים באזורים של הלב מוגבלים, כגון EMT של תאי endocardial או epicardial. והכי חשוב, פרוטוקולים אלה מספקים הזדמנות לעקו...

לפני יותר מעשור, בתאי גזע עובריים אנושיים (HuESCs) כבר נגזרו מבלסטוציטים אנושי 1. מאז, תאים אלה הפכו את הנושא של תחום חשוב של מחקר המתייחס לשאלות שלא סופקו בביולוגיה התפתחותית אנושית. HuESCs לי יתר סיפק תקוות ברפואת רגנרטיבית. בשנים האחרונות, תאים אנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) כבר נוצרו מהתאים סומטיים מטופל ספציפי, המספקים מודלים של מחלה גנטית 2. רבים בפרוטוקולי מבחנה להתמיינות של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה כלפי שושלות תאים שונות, כוללים שושלות לב 3, כבר דיווח. התאים מובחנים לעתים קרובות phenotyped על ידי ניתוח של RNA וביטוי חלבון, immunostaining, ו / או בבדיקות תפקודיות מבחנה. עם זאת, נגזרים בתאי גזע pluripotent צריך להיות ממוקם בסביבה עוברית תקינה על מנת לבדוק אם הם רוכשים את cel מלאגורל ליטר של עמיתו העוברי שלהם ובין אם הם לשחזר את התפקוד vivo באמיתי בתגובה לאותות אזוריות. בעוד הנדסת רקמות היא מבטיח, זה עדיין לא מספק את כל הרמזים ידועים ובלתי ידועים של הראוי in vivo מתפתחים רקמה עוברית 4,5. תא תיוג עם צבעים או וקטורי רטרווירלי בעוברים, לרבות עוברי עכברים, הביא מידע חשוב באשר למקור העוברי של שושלות תאים במהלך התפתחות לב 6. לדוגמא, לצבוע הזרקה אל תוך חלל קרום הלב של עוברי עכברי vivo לשעבר, ואחריו תרבות במבחנה של לבבות בודדים, שימש לתווית תאי epicardial וצאצאיהם 7. עם זאת, צבע ותיוג תא רטרווירלי כבר מיושמים בעיקר לעוברי עכברים מוקדמים עם איברים עדיין מפותחים, או עוברי עופות, שהם יותר נגישים בקלות 8. יוצא מן הכלל הוא במוח, שהוא קל יותר למקד בדוארmbryos 9,10. גישה כזו טרם יושמה אל לב העכבר העוברי הפועם. כדי להשלים את התיוג ישיר עם צבעים או וירוס ולבצע שושלת התחקות בעוברי שלב מתקדמים יותר בעכבר ועכברים בוגרים, גישת תיוג תא כבר בשילוב עם ניתוח של עכברים הטרנסגניים באמצעות טכנולוגית Cre / לקס. גישת Cre / קס 11 עם זאת תכונות מסוימות מגבלות עקב הספציפיות spatiotemporal של אזורי רגולציה גנומית להשתמש בכונן ביטוי של recombinase, ואת היעילות של רקומבינציה Cre / קס 12. יתר על כן, גישה זו אינה מתייחסת באופן מלא על השאלות הספציפיות של רכישה מונעת נדידת תאים של גורל תא כפי שהוא יכול רק לתייג מבשר לאחר ההפעלה של אזור הרגולציה להשתמש בכונן ביטוי Cre. כמו כן, לא ניתן להחיל על עוברים אנושיים לסוגיות אתיות ברורות. בהתחשב במגבלות אלה, עיצבנו סדרה של p החדשrotocols להזרים מגוון של סוכני תיוג תא כגון צבעי ניאון, וירוס, מאפנני ביטוי גנים כגון shRNAs ווקטורי תיוג תא מבוסס ה-DNA, או בתאים בעובר של העכבר בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח באזורים ממוקדים של לב. זריקות ה-DNA / התא להשתמש סטראו ומכשיר microinjection פשוט בשילוב עם vivo לשעבר תרבות עובר עד 48 שעה, או לב מבודד או תרבות explant עוברית ל48-72 שעה. גם אנו מדווחים פרוטוקול microinjection תיווך אולטרסאונד בלב העוברי של עכברים ברחם. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפיתוח של עוברים 13 ומאפשרת מעקב ארוך טווח של injectates ו / או תאי שכותרתו. מצאנו כי גישות אלו לשמר את התפקוד של האיברים ולספק סביבה ייצוגית יותר מאשר בדיקה במבחנה של פוטנציאל של תאי גזע. הוא גם מספק את ההזדמנות כדי לעקוב אחר נדידהכותרתו של ו / או הזריק תאים כדי לפקח על גורלם. סופו של דבר, זה אמור להניב הבנה טובה יותר של דפוסים רקמה אזוריים ותהליכים ביולוגיים מרכזיים.

<table><tbody><tr><td><חזק>הגדרות/חומרה</מתמר חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 מגה-הרץ</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Eppendorf</td><td>5242</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td>נדרש ללחץ</td></tr> על <tr><td>מערכת המסילה</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>מסובב לסיבוב צינור זכוכית עם עוברים בתוך החממה</td></tr><tr><td>חממה סטנדרטית</td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37 &#176; </td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>C Zeiss</td><td>Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate צינורות נימיים</td> World <td>Precision Instrument</td><td>KTW-120-6</td><td>1.2-&mu; m קוטר חיצוני</td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>סאטר</td><td>דגם P87</td><td></td></tr><tr><td>מחטי מיקרו הזרקה</td><td>Origio-Humagen</td><td>C060609</td><td>OD/ID 1.14 מ"מ/53 מ"מ, עם 50/35 &mu; m OD/ID</td></tr><tr><td>tip מזרקי המילטון&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי</td><td></td><td></td> פטרי <td>בקוטר 10 ס"מ</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>קרום סיליקון</td><td>Visualsonics</td><td></td><td>4.3 x 4.3 ס"מ</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומר להסרת שיער&nbsp;</td>חומר סיכה <td>לעיניים Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Optixcare</td><td>31779</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אלקטרודות (סיגנה)</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Sofsilk 5-0</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אולטרסאונד</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenex Buprenex (בופרנורפין הידרוכלוריד)</td><td>רקיט בנקיזר פרמצבטיקה בע"מ</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>0.05-0.1 מ"ג/ק"ג במי מלח</td></tr><tr><td><חזק>אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיליקון אלסטומר</td><td>דאו קורנינג</td><td>סילגארד 184</td><td></td></tr><tr><td>כלי</td><td>זכוכית למדע משובח בקוטר</td><td></td><td>60 מ"מ</td></tr><tr><td>סיכות חרקים</td> כלי <td>מדע עדינים</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים למדיה ותרבות </חזק> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Medium Life Technologies</td><td>51985026</td><td></td></tr><tr><td>M2 בינוני</td><td>סיגמא</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-640F</td><td>גלוקוז גבוה ו-50% סרום חולדות</td></tr><tr><td>M16 בינוני</td><td>סיגמא</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>סרום עכברוש</td><td>Janvier</td><td>ODI 7158</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140-12</td><td></td></tr><tr><td>חמצן 40%</td> <td>נוזל</td><td></td> אוויר <td>הנדרש לחמצון מדיום תרבית העובר</td></tr><tr><td>סרום</td> <td>עגל עובריפישר</td><td>RVJ35882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מסוג I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>לציפוי מנות תרבית לתרבית אקספלנט</td></tr><tr><td>מנות תרבות</td><td>הולנדית / תפוז</td><td>131020</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מזריק< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDCFDA-SE</td><td>בדיקות אינויטרוגן / מולקולריות</td><td>C1165</td><td>25 מ"ג/מ"ל DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 &#176;C. יש לדלל 1:100-200 במי מלח לפני השימוש.</td></tr><tr><td>לנטי-וירוס המבטא PGK-GFP&nbsp;</td><td></td><td></td><td>~8E9 יחידות תמירה/מ"ל DMEM</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

בדיקת גורלם של תאי גזע עובריים או נגזרי pluripotent במבחנת פרוטוקולים הובילה לתוצאות שנויות במחלוקת, שאינו משקפים בהכרח in vivo את הפוטנציאל שלהם. רצוי, צריכים להיות ממוקמים בתאים אלה בסביבה עוברית תקינה על מנת לרכוש פנוטיפ מובהק שלהם. יתר על כן, שושלת תא התחקות מחקרים בעכבר לאחר סימון תאים עם צבעים או וקטורי רטרווירלי נשארה מוגבלת בעיקר לעוברי עכברים בשלב מוקדם עם איברים עדיין מפותחים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצבנו פרוטוקולי microinjection סטנדרטיים ותיווך אולטרסאונד כדי להזריק סוכנים שונים באזורים הממוקדים של הלב בעוברי עכברים בE9.5 ושלבים מאוחרים יותר של התפתחות. explant או עוברים עובריים בתרבית ואז או שמאלה כדי לפתח עוד יותר ברחם. סוכנים אלה כוללים צבעי ניאון, וירוס, shRNAs, או תאי גזע ובתאים שמקורם בתא. הגישות שלנו מאפשרות לשימור של פוnction של האיבר תוך מעקב הגירה וגורלם של תאים שכותרתו ו / או בזריקה. ניתן להאריך בטכנולוגיות אלה לאיברים אחרים ויהיה מועיל מאוד כדי לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות בביולוגיה של התפתחות.

שימוש בפרוטוקולי ההזרקה שתוארו לעיל, יכולים להיות מתויגים תאים ו / או מוזרק ללב העכבר העוברי. כהוכחה של מושג, כמה דוגמאות מוצגות בי פרוטוקול ההזרקה וvivo לשעבר explant AVC, לב מבודד, או תרבות עובר כולו אוחדו (איור 1). איור 1 מציג את ההכנה של העובר לפני הזרקת תא. עובר E9.5 מוסר מdecidua, תוך שמירה על שלמות (איור 1 א) שק חלמון. שק החלמון נפתח בדיוק מעל הלב...

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע הזרקה של צבעי תאים, או DNA, לתוך לבבות של עוברי עכבר. על מנת לחקור גורל תאי או למניפולציה מקומית של ביטוי גנים, הדבר מושג תחילה על ידי הוצאת העוברים מעכברה הרַיה וחשיפת הלב העוברי. לאחר מכן, מוזרקים צבעי DNA או תאים לאזור העניין המיועד בלב.לאחר דגירה של העובר, מוציאים את הלב ומעבירים אותו לתרבית. לבסוף, נקבע גורלם של התאים המוזרקים או המסומנים באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, גורלם של תאים מוזרקים, מסומנים או שעברו שינוי גנטי מנוטר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (אור ו-epi), ובכך נחשפת החשיבות התפקודית של גנים ותאים ספציפיים במהלך ההתפתחות הלבבית.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנסגנזיס בעכבר, הוא היכולת להזריק באופן מקומי ומדויק תאי מעבדה או תאים שעברו שינוי גנטי in vivo. דבר זה מאפשר את חקירת תאים אלו בסביבתם המתאימה. את הפרוצדורה זו נדגים אני ואמילי aar, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה.לאחר הכנת הציוד, הריאגנטים והתמיסות בהתאם לפרוטוקול הכתוב, אסוף עוברים בשלבים E 9.5 ו-E 10.5 מעכברה בהיריון שהורדמה, תחילה על ידי שימוש ב-70% ethanol לסטריליזציה של בית החזה, ביצוע חתך בקו האמצע הוונטרלי לפתיחת הבטן והוצאת קרן הרחם לפני העברתה ל-PBS בטמפרטורת החדר. לאחר שני שטיפות נוספות ב-PBS, העבר אותה לצלוחית פטרי מלא

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

כתב יד זה מתאר טכניקה להדמיה של כלי הדם המתפתחים. כאן השתמשנו ברחם תוך לבבי במיקרו-זריקות לקטין עגבניות עם תווית FITC על עוברי עכברים. באמצעות טכניקה זו, אנו תוחמים את כלי הדם המועברים והלא מחוללים בכל הכליה העוברית.

בזריקות עגבניות-לקטינים הרחם Intra-לב בעוברי עכבר כדי לאמוד את זרימת דם בכליות

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

אנו מתארים פרוטוקול להדמיה נפחית של תאים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי עמוק בתוך לבבות עובריים שלמים ולאחר לידה. תוך שימוש בשיטות ניקוי רקמות בשילוב עם צביעה שלמה, ניתן לדמות תאים בודדים עם תווית חלבון פלואורסצנטי בתוך לב עוברי או לאחר לידה בצורה ברורה ומדויקת.

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

העברת תאים מונחית אולטרסאונד סביב האתר של אוטם שריר הלב בעכברים היא דרך בטוחה, יעילה ונוחה להשתלת תאים.

השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

פרוטוקול זה מציג מסגרת מתודולוגית מפורטת לטרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בהתפתחות לבבות עכברים. נכסי הווידאו המסופקים כאן יקלו על למידה של טכניקה רב-תכליתית זו.

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

למד שיטות הזרקה של צבעים, DNA ותאים בלבבות עכבר עובריים לחקירת גורל תאים ותפקוד גנים. טכניקות אלו מאפשרות מניפולציה מדויקת של תאים וגנים בסביבה פיזיולוגית אמיתית.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

גלה סרטונים נוספים