תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי
17 באפריל 2014
אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הזרקה של תאים מתים, או DNA בלבבות עכברים עובריים. על מנת לחקור שומן בתא או לתמרן באופן מקומי את ביטוי הגנים, זה מושג תחילה על ידי ניתוח העוברים מעכברה בהריון וחשיפת הלב העוברי. לאחר מכן, צבע או תאים של DNA מוזרקים לאזור העניין הממוקד בלב.
לאחר הדגירה של העובר, מוציאים את הלב ומכניסים אותו לתרבית. לבסוף, גורלם של תאים מוזרקים או מסומנים נקבע באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, גורלם של תאים מוזרקים, מסומנים או מהונדסים גנטית מנוטר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופ אור ואפי פלואורסצנטי החושף את החשיבות התפקודית של גנים ותאים ספציפיים במהלך התפתחות הלב.
היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו טרנסגנזה בעכבר, הוא שאנו יכולים להזריק באופן מקומי ומדויק תאים מעבדתיים או לשנות גנטית in vivo. זה מאפשר לחקור תאים אלה בסביבה המתאימה. נדגים את ההליך הזה אני ואמילי אאר, דוקטורנטית ממעבדה.
לאחר הכנת ציוד, ריאגנטים ותמיסות, על פי פרוטוקול הטקסט, אספו עוברים E 9.5 ו-E 10.5 מעכברה בהריון שהורדמה על ידי שימוש תחילה באתנול 70% כדי לעקר את החזה, לבצע חתך בקו האמצע הגחוני כדי לפתוח את הבטן ולהחזיר את קרן הרחם לפני העברתה ל-PBS בטמפרטורת החדר. לאחר שתי שטיפות נוספות ב-PBS, העבירו אותו לצלחת פטרי מלאה בסיליקון. עם מדיום M 16, השתמש בסיכות חרקים כדי להצמיד את קרן הרחם לשכבת הסיליקון כך שהצד כלי הדם של הרחם יהיה מתחת.
לאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים כדי לחתוך את פני הרחם ולכסות את הנשיר במילימטר אחד מתחת לפני השטח. פרשו את דפנות הדצידואה והחזירו בעדינות את העובר בשק החלמון. אחסן אותו ב-M 16, בינוני ב-37 מעלות צלזיוס לפני הזרקת התאים לביצוע זריקות.
ראשית, השתמשו במזרק המילטון כדי למלא פיפטה מזכוכית מאחור בדנ"א או בתאים, ונערו את הפיפטה כדי להסיר בועות. בקצה, הנח את הפיפטה על מחזיק המיקרו-הזרקה והגדר את המזרק לפי ההגדרות הבאות. לאחר מכן, הצמד את העובר לתחתית הסיליקון דרך שק החלמון מבלי לגעת בעובר עצמו.
לאחר מכן זהה את אזור הלב ופתח את השק ממש מעל אזור זה. הוסף ארבעה סיכות סביב העובר כדי למנוע כל תנועה במהלך הזרקת התאים. באמצעות המניפולטור המיקרו המוגדר לידני, מקם לאט את קצה הפיפטה בזווית של 45 מעלות מעל קרום הלב, ממש מעל אזור הלב שיש להזריק.
העבירו את הפיפטה לאזור העניין, הפעילו את ההזרקה והוציאו את הפיפטה במהירות האפשרית. ודא שהלב פועם כראוי לאחר הזרקת ה-DNA או התא באמצעות פרוטוקול ההזרקה המתואר בסרטון זה כדי לחקור את מעבר האפיתל למזנכימה ו-E 9.5 אקספלן VC הוזרק עם S-H-R-N-A המווסת חלבון הנדרש למעבר מזנכימלי אנדותל של תאים אנדוקרדיאליים. לעובר הביקורת הוזרק וקטור עמוד שדרה ריק, כמו כן, תאים אנדותליים קדם-מסתמיים שמקורם בתאי HUES המבטאים GFP תחת שליטת מקדם SOX 9 הוזרקו ל-A VC ב-E 10.5, ולאחר מכן 48 שעות של תרבית לב מושתלת.
תאים אלה רוכשים סמנים של EMT, כגון פריוסטין, בדומה לתאים האנדוקרדיאליים האנדוגניים. גישות ex vivo שהודגמו כאן הן קלות יחסית, אך מוגבלות למעקב מקסימלי לטווח קצר של 48 עד 72 שעות. עם זאת, הליך ההזרקה מונחית האולטרסאונד המתואר בפרוטוקול הטקסט מספק גישה מאתגרת יותר מבחינה טכנית, אך עם אפשרות למעקב ארוך אפילו לאחר הלידה ברחם.
הזרקת הרחם של צבע או וקטורים נגיפיים לתיוג תאים באזורי לב ספציפיים מוצגת כאן. בשיטה זו ניתן להשיג תיוג ספציפי של תאים אפיקרדיאליים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים או וירוסים, וניתן להרחיב את השיטה עם תאים או הזרקות חלופיות. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטה כמו תרבית בריו על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ההשפעה ארוכת הטווח של גן, מולקולה או קריאת רשימה ארוכה, כגון מורפוגנזה של רקמות לאחר התפתחותו.
טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית של הלב והגנטיקה. זה מאפשר לנו לחקור גם את עולם הגנים החדשים כדי לחקור את גורל התא האנושי בהקשר העוברי הנכון. זה שימושי מאוד כאשר קו עכבר טרנסגני אינו זמין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטות להזרקת צבעים, וקטורי DNA, וירוסים ותאים לתוך לבבות של עוברי עכבר לצורך ניטור גורל תאים ופנוטיפ. הטכניקות ישימות החל מהיום העוברי (E)9.5 ושלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת גורל התאים והבעת גנים היא קריטית במהלך ההתפתחות הלבבית.
- מודלים של עוברי עכברים מספקים תובנות לגבי תהליכים תאיים.
- טכניקות הזרקה מאפשרות מניפולציה ממוקדת של תאים וגנים.
- טכניקות ניטור כוללות מיקרוסקופיה לצורך ניתוח מפורט.
מטרת המחקר
- לחקירת גורלם של תאים מוזרקים והשינויים הפנוטיפיים שלהם.
- לביצוע מניפולציה מקומית של ביטוי גנים בלבבות עובריים.
- לשיפור ההבנה של התפתחות הלב ותפקוד גנים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הוצאה של עוברים מעכברים הרयों.
- חשיפת לבבות עובריים להזרקות ממוקדות.
- הזרקת DNA, צבעים או תאים לאזורים ספציפיים בלב.
- דגירה ותרבית של לבבות לאחר ההזרקה.
תוצאות עיקריות
- בוססו טכניקות הזרקה מוצלחות עבור חומרים שונים.
- גורל התאים נוטרה ביעילות באמצעות מיקרוסקופיה.
- החשיבות התפקודית של גנים ספציפיים נחשפה במהלך ההתפתחות.
- התקבלו תובנות לגבי תפקידם של תאים מושתלים ותאים אנדוגניים.
מסקנות
- השיטות מספקות מסגרת למחקר של התפתחות הלב.
- ניתן להתאים את טכניקות ההזרקה לצרכים ניסיוניים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על ממצאים אלו כדי לחקור תפקודי גנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סימון תאים ישיר והזרקה מיקרוסקופית ללבבות של עוברי עכברים מאפשרים מיפוי גורל מדויק ובחינה פונקציונלית של תוצרי תאי גזע בהקשר רלוונטי פיזיולוגית. גישה זו נותנת מענה לפער התרגומי בין תוצאות דיפרנציאציה in vitro לבין פוטנציאל התפתחותי in vivo, ובכך תומכת ברמת ביטחון ניבוי גבוהה יותר באישור יעדים לבביים מוקדמים. השיטה ממוקמת אסטרטגית לצורך הפחתת סיכונים בטיפולים תאיים מועמדים ובמחקרי תפקוד גנים במסלולי גילוי פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תאי מקור (progenitors) המופקים מתאי גזע בסביבה עוברית טבעית לצורך תיקוף תפקודי של מטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות למניפולציה גנטית מקומית ומעקב אחר שושלות תאים (lineage tracing) ברקמה לבבית מתפתחת.
- מאפשר חקירה מונחית-השערה של תפקוד גנים ותאים במהלך אורגנוגנזה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק פלטפורמה לתיקוף של ריאגנטים לסמן ומעקב אחר תאים במערכת מורכבת ורלוונטית פיזיולוגית.
- מאפשר החדרה הדירה של צבעים, וקטורים נגיפיים או shRNAs לאזורי לב מוגדרים לצורך קבלת תוצאות כמותיות.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות לניתוח גורל תאים ונדידה באמצעות מיקרוסקופיה מתקדמת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות למעקב ארוך טווח אחר גורל תאים ותפקוד גנים בתוך הרחם (in utero).
- מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי תמיכה ברציפות ממחקרים התפתחותיים ex vivo למחקרים in utero.
- מפחית סיכונים בקידום טרנסלציונלי על ידי אספקת ראיות לשילוב תאים ולרכישת פנוטיפ in vivo.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
תהליך העבודה של מיקרו-הזרקה וסימון זה משתלב בממשק שבין הגילוי המוקדם, תיקוף המטרה ופיתוח מודלים פרה-קליניים למחקר לבבי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מנגנוני של תפקודי גנים ותאים בהתפתחות הלב.
- סריקה: מאפשרת הובלה ניתנת לשחזור, ספציפית לאזור, של חומרים ניסיוניים לצורך מיפוי גורלי כמותי.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות מבוססות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי של גורל תאים וביטוי גנים.
- מחקר תרגומי: מקלה על ביצוע מחקרים ארוכי טווח ברחם (in utero) להערכת תוצאות התפתחותיות ותפקודיות של התערבויות מועמדות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לאיברים ולהקשרי התפתחות אחרים לשימוש רחב במחקר ופיתוח (R&D).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במחקרי גורל תאים ותפקוד גנים על ידי מינוף מודלים רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי מיקרו-הזרקה וסימון לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתוני תיקוף robust in vivo בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של התערבויות גנטיות ותאיות עבור תוכניות פיתוח לבבי.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה עוברית, מיקרו-הזרקה וטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות.
- נדרשת גישה לציוד ייעודי כגון מיקרו-מניפולטורים ומערכות הזרקה מודרכות באולטרסאונד עבור מחקרי in utero.
- נדרש סטנדרזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סימון, הזרקה והדמיה להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- התאמה למערכות איברים אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה ותיקוף של הפרוטוקול.
- תרבית ex vivo לטווח קצר מגבילה את משך המעקב, בעוד שגישות in utero מעלות את המורכבות הטכנית.
