הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא להשיג תמונות פלואורסצנציה ברזולוציית-על (super resolution) השופכות אור על היבטים חשובים של ארגון שלפוחיות ברזולוציה שאינה ניתנת להשגה במיקרוסקופיית פלואורסצנציה רגילה. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציית נוירונים של ההיפוקמפוס עם DNA המקודד עבור כימרות של מטעני שלפוחיות, הניתנות להמרה פוטוכימית. בשלב השני, נאספות תמונות גולמיות של דגימות דלילות באמצעות מערכת מיקרוסקופיית רזולוציית-על.

בשלב הבא, התמונות הגולמיות מעובדות כדי להפיק תמונת רזולוציה-על (super resolution). בשלב הסופי, הנתונים מכומתים כדי להבהיר את ארגונן של הוזיקולות. לבסוף, ניתן להשתמש בפרופילי קו של עוצמת הנקודות (puncta) כדי להשוות את המרחק בין הוזיקולות לרוחב הוזיקולה, ובכך לקבוע האם הוזיקולות קרובות מספיק כדי ליצור צבר באמצעות הליך זה.

ניתן להשתמש במיקרוסקופיית לוקליזציה המופעלת על ידי פוטו-צבע בודד (palm) כדי לחקור את ארגונם של אברונים ברוב סוגי התאים בתרבית. כדי להפעיל את מערכת הדימוי ברזולוציה גבוהה לרכישת תמונות, התחילו בהפעלת המתח למנורת הקשת. לאחר מכן, הפעילו את מתגי המחשב ורכיבי המערכת בשלט הרחוק של ספק הכוח.

העבירו למצב on לאחר שהטאבלט לשליטה במיקרוסקופ נדלק, הדליקו את המחשב והפעילו את התוכנה. הרחיבו את חלון סטטוס האתחול כדי לוודא שהמערכת נטענת כסדרה, ובחרו באפשרות start system בדיאלוג ההתחברות. כדי למקם את הדגימה לצורך ויזואליזציה, פתחו את הפנלים הקדמי והעליון של ארון הבטיחות ללייזר והטו את זרוע האור המועבר כדי לגשת לבמה ולעדשות האובייקטיב.

בשלב הבא, יש להניח שמן על עדשת ה-alpha plan APO Chromat 100 x total internal reflection, fluorescence או turf. לאחר מכן, בחרו בעדשה בעלת הגדלה נמוכה לצורך שלב המיקוד הראשוני. כעת, התקינו את הדגימה על הבמה והעלו את העדשה לכיוון הדגימה.

ניטור מיקום העדשה באמצעות פונקציית X, Y, Z בטאבלט הבקרה. יש להפסיק כאשר העדשה נמצאת בטווח המיקוד. לצורך ויזואליזציה של הדגימה וכיוון עדין של המיקוד.

הורד את זרוע התאורה וסגור לחלוטין את פאנלי הגישה. לאחר מכן, בלשונית האיתור (locate), לחץ על סמל הרחבת העין כדי להציג תרשים של נתיב האור; בחר ב-trans on וודא שהתרשים מראה אור מועבר מהנורה הפוגע בדגימה. הבט דרך העיניות והבא את התאים למצב פוקוס תוך שימוש בטאבלט הבקרה כמדריך.

לאחר מכן, כדי לזהות את התאים המבטאים את ה-DRA two, בחרו באור רפלקסיבי (reflected light) ובמסנן המתאים לצפייה בפליטה ירוקה מ-den two. סרקו את לבישת הזכוכית (cover slip) באמצעות אור רפלקסיבי בעוצמה נמוכה עד למציאת תא בהיר ובריא, ולאחר מכן הגדירו את התוכנה לרכישת נתוני ה-palm. עברו ללשונית הרכישה (acquisition), והשתמשו במנהל הניסוי כדי לטעון את תצורת רכישת ה-palm הניסויית המתאימה.

כאשר מופיע התפריט הקופץ עם שאלה לגבי הפעלת הלייזרים, לחץ על yes. לאחר מכן, התמקד בתמונת התא במישור המצלמה. בחר רק בערוץ ה-488. כוונן את פרמטרי הרכישה, כגון ה-E-M-C-C-D gain, ולאחר מכן בחר ברכישה רציפה (continuous acquisition).

בשלב הבא, כוון את התצוגה לבהירות הרצויה והזז את העדשה עד שהתמונה על המסך תהיה ממוקדת. לאחר מכן, כדי לאסוף תמונת שדה רחב (wide field) קונבנציונלית, לחץ על כפתור ה-snap ושמור את התמונה. כדי להגדיר תאורה מבוססת turf בערוץ 488, בחר turf בכפתור ה-epi turf.

כדי למטב את התאורה המבוססת על השטח (turf), בחרו ברכישה רציפה (continuous acquisition) וכוונו את זווית תאורת השטח עד שהרקע יחשיך בפתאומיות וניתן יהיה למקד את הדגימה במישור אחד בלבד. עברו לערוץ 561 כאשר הלייזר של 405 ננומטר כבוי. הגדירו את הגבר (gain) של ה-E-M-C-C-D לכ-200 ואת זמן החשיפה לכ-50 מילישניות.

בחרו במסנן הפליטה המעביר אור באורך גל אדום והגדירו את עוצמת הלייזר לכ-40%. בדקו שוב את זווית ה-turf עבור ערוץ ה-561. כדי להפחית את הרקע, האירו את הדגימה עד שהרקע דוהה. השתמשו בערוץ ה-561 כאשר רק לייזר ה-561 פעיל.

כדי לאסוף את נתוני ה-PALM, הפעל את הלייזר בנתיב 405 ננומטר עבור ערוץ 561 וכוונן את עוצמת לייזר ה-405 לכ-0.01%. כדי לנטר את תמונת ה-PALM המחושבת במהלך הרכישה, הרחב את תפריט אפשרויות העיבוד המקוון וסמן "online processing palm" כדי לבצע עיבוד עם פרמטרים ברירת מחדל. לחץ על "start experiment" כדי להתחיל את הרכישה; במהלך איסוף הנתונים, נטר חזותית את המרת הפוטונים תוך הגברת עוצמתו של לייזר המרת הפוטונים ב-405 ננומטר. כאשר המרת הפוטונים השנייה מתחילה לפחות.

כאשר ההמרה הפוטוכימית אינה עולה יותר בעקבות הגברת עוצמת הלייזר, לחצו על finish current step. כדי לסיים את הניסוי, שמרו את הקובץ. כדי לעבד את התמונות השמורות, לחצו על לשונית processing, הרחיבו את תפריט method, והרחיבו את תפריט המשנה palm.

בחר שוב ב-palm מתוך ארבעת תתי-האפשרויות. בחר את התמונה המתאימה כך שתופיע בחלון התצוגה. הרחב את פרמטרי השיטה ולחץ על select כדי להזין את התמונה, הרחב את שדה ההגדרות ובחר ב-default כדי לבצע איתור ומיקום של שיאים (peak finding and localization) באמצעות אפשרויות ברירת המחדל.

לחצו על apply בלשונית העיבוד (processing) כדי לחשב את תמונת ה-palm, שתופיע בלשונית נפרדת בחלון התצוגה כדי לסנן רכיבים שנדגמו בצורה לקויה בנתונים. השתמשו במשפט דגימת נייקוויסט (nyquist sampling theorem) ובכלי הסרת חריגי ה-palm (remove palm outliers) כדי למחוק שיאים באזורים שבהם המרווח הממוצע בין השיאים, d קטנה, גדול מדי מכדי להבחין בvesicle בעלת קוטר, D גדולה, עם תמונת ה-palm בחלון התצוגה, לחצו על select כדי להזין את התמונה ולחצו על apply. התמונה החדשה תופיע בלשונית נפרדת בחלון התצוגה כדי לסנן פלואורופורים (fluorophores) שמיקומם לא היה מדויק.

עברו ללשונית מסנני ה-PAL, הגבילו את הפלורה המקובלת. ארבע רשויות לוקליזציה לסיגמה של פחות מ-35 nanometers. כדי לבחור מצב תצוגה לתמונת ה-PAL, עברו ללשונית הרינדור של ה-PAL, בחרו רזולוציית פיקסלים ואת מצב התצוגה הרצוי.

בתמונה זו, מוצג באדום תוצר סופי מייצג של PALM, שהתקבל מדימוי ועיבוד של וסיקולה בעלת ליבה צפופה (dense core vesicle או DCV) עצבית. הקואורדינטות הלטרליות של ה-fluorophores הממוקמים, המוצגים בלבן, מוצגות באמצעות מצב התצוגה Centro, ותמונת הרזולוציה-העל של הוסיקולה הקשורה מוצגת באמצעות מצב התצוגה Gaussian. בדמות שנייה זו, מוצגות תמונות מקבילות של שדה רחב (widefield) בירוק ו-PALM באדום של הסומה והבליתים הפרוקסימליים של נוירון היפוקמפלי בן שמונה ימים in vitro המבטא tpa, a danger two.

מאפיינים חשובים של התמונות כוללים התאמה רחבה של אחד-לאחד וחפיפה בצהוב בין הנקודות (puncta) לבין תמונות ה-conventional וה-palm. הגודל הקטן משמעותית של נקודות ה-palm והפירוק המזדמן של נקודה אחת ב-widefield למספר נקודות ב-palm. כאן מוצגת תמונת palm של D cvs לאורך חלק מזרוע אחת של נוירון היפוקמפלי שני המבטא tpa.

מוצג DENDRA two. שימו לב לקוטר הקטן ולמראה ההומוגני של הנקודות (puncta), ולתצפית הנדירה בנקודות הצמודות זו לזו, המייצגות אשכולות משוערים של DCV. באיור סופי זה, מתווה שיטה כמותית פשוטה לקביעה אם שתי וסיבובות (cvs) או יותר קרובות מספיק כדי להוות אשכול.

פרופילי קו של עוצמות הנקודות (puncta) נוצרים כפי שמוצג בגרפים, ואותם ניתן להשתמש כדי לכמת את ההפרדה בין ה-DCV ואת רוחב ה-DCV. אם ההפרדה עולה באופן משמעותי על הרוחב, ה-DCV אינם באים במגע זה עם זה. לעומת זאת, אם ההפרדה דומה בקירובה לרוחב, ה-CV עשויים להיות במגע על בסיס קריטריונים אלה; ה-CV בתמונה זו סווגו כלא נמצאים במגע, בעוד שה-CV בתמונה זו סווגו כנמצאים במגע בעקבות הליך זה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון PALM בשני צבעים, כדי לחקור את המיקום היחסי של מבנים נפרדים.