רצף ברקוד מופעל של Tetrads: BEST

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מספר רב של צאצאים רקומביננטיים מהכלאת שמרים באופן המשמר את המידע על כך אילו צאצאים נגזרו מאותה טטרה מקורית. הדבר מושג תחילה על ידי טרנספורמציה של זן הדיפלואי ההטרוזיגוט שבו נעשה שימוש בהכלאה באמצעות ספריית פלסמידים המכילה ברקוד ספציפי לטטרה ומדווח פלואורסצנטי ספציפי לספורולציה. השלב השני הוא העברת התאים המסומנים בברקוד למצע ספורולציה.

פעולה זו מאפשרת לתטרות להיווצר ומשרה את הביטוי של הרפורטר הפלואורסצנטי GFP בתטרות, אך לא בתאים שאינם עוברים ספורולציה. לאחר מכן, ממייין FACS מפריד את התטרות המסומנות פלואורסצנטית משאר התאים ומעביר אותן ישירות לצלחת אגר, שבה השכבה החיצונית של התטרות מעוכלה אנזימטית. השלב הסופי הוא שימוש בחרוזי זכוכית כדי להפריד ולהפיץ את הנבגים של התטרות המעוכלות על פני שטח צלחת האגר, מה שמאפשר לכל נבג להקים מושבה בודדת.

בסופו של דבר, הזנים שהתקבלו בשיטה זו יעברו גנוטיפיקה באמצעות פרוטוקול ריצוף DNA רב-מופעל (multiplexed) בעלות תפוקה גבוהה, אשר יקרא את הברקוד הטטרה-ספציפי של כל זן. הברקודים משמשים לאחר מכן לזיהוי כל אחד מארבעת הזנים שנוצרו מאירוע מיאוטי בודד. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דיסקציה ידנית של טטראדים באמצעות מיקרו-מניפולטור, הוא שחוקר אחד יכול לבודד כמה אלפי צאצאים רקומביננטיים תוך מספר שעות בלבד.

תאי השמרים הדיפלואידיים ששימשו במחקר זה עברו בעבר טרנספורמציה עם ספרייה של פלסמידים בעלי ברקוד, כפי שמתואר במאמר הנלווה, ואוחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להחזיר את התאים מהמצב הקפוא. גדלו אותם למשך לילה בחמישה מיליליטר של YPD בתוספת 200 מיקרוגרם למילליטר G418 בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ערבול. למחרת, שטפו את התאים מהתרביות של הלילה שלוש פעמים ב-PBS ולאחר מכן השעיקו מחדש את התאים לנפח סופי של שני מיליליטר במצע ספורולציה, בתוספת 200 מיקרוגרם למילליטר.

ערבבו את תרביות הספורולציה בטמפרטורת החדר. עקבו אחר התקדמות הספורולציה מדי יום עד להפסקת היווצרותן של טטראדים חדשים. בדרך כלל, תהליך זה נמשך בין יומיים לארבעה ימים מרגע שהתרביות מכילות טטראדים בשלים ומספר קטן יחסית של דיאדים.

הוציאו את התרביות מהערבול והשאירו אותן בטמפרטורת החדר למשך שבעה ימים לפחות לפני מיון הטטראדות. ההיבט המאתגר ביותר של פרוצדורה זו הוא השגת הפרדה טובה של הספורות. מצאנו באופן אמפירי כי השארת התרביות שעברו ספורולציה בטמפרטורת החדר ללא ערבול למשך שבוע לפחות לפני מיון הטטראדות משפרת משמעותית את הפרדת הספורות.

ניתן לזהות ולבודד את הטטרדות מתרבית הספורולציה באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting) או FACS, מכיוון שהפלסמידים בעלי ברקוד בתאים הדיפלואידיים נושאים גם חלבון GFP מותאם ספציפי לספורולציה. הפרוטוקול המתואר כאן פותח עבור FACS Aria II. כדי להתחיל בהליך זה, טענו את התרבית שעברה ספורולציה לממיין ה-FACS והגדירו שני שערים (gates) של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צידי (side scatter) כדי להוציא פסולת, תאים ש뭉וצקים ותאים מרובים לטיפה.

צריכה להיות אוכלוסייה של תאים פלואורסצנטיים, אשר בשימוש במבנה הדיווח PS two GFP כוללת דיאדות (dyads) וטטראדות (tetrads); הגדירו שער (gate) של GFP לעומת FSC כדי לכלול אירועים פלואורסצנטיים אלו. בהתאם לרקע של הזן, ייתכן שיהיה צורך להוסיף שער נוסף כדי להסיר גושים הכוללים טטראדות ותאים אחרים. בחנו היסטוגרם FSC של האירועים הפלואורסצנטיים.

בדוגמה זו, האירועים בשיא השמאלי הם בעיקר טטראות (tetras), והאירועים בשיא הימני הם בדרך כלל טטראות עם ניצן צמוד; יש להחיל שער (gate) סופי הכולל אירועים עם FSC נמוך יותר שהם בעיקר טטראות, כפי שמסומן על ידי הפסים האדומים. יש לבדוק את יעילות משטר השערים על ידי מיון של כ-1,500 טטראות על עלית מיקרוסקופ וספירת הפרופורציה של טטראדות ביחס ללא-טטראדות. באמצעות מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast) בהגדלה של 400 פעמים, ניתן להעריך במדויק את אחוז הטטראדות על ידי ספירה של כ-200 אירועים ממוינים בלבד, אך מיון של כ-1,500 מקטין את זמן החיפוש אחר תאים על עלית המיקרוסקופ.

תמונות שדה בהיר אלו הן בהגדלה של 600 פעמים. הן מציגות דוגמאות של טטראדות (tetrads) בצד שמאל ושל אי-טטראדות בצד ימין לאחר מיון העובדות. יש לבדוק מעת לעת שהמיין מדווח במדויק על מספר האירועים, על ידי מיון 25 טטראדות על עלית מיקרוסקופ ובחינת התאים שבטיפה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של 400 פעמים.

בטיפה צריכות להיות 25 טטרדות. חזרו על הפעולה שלוש או ארבע פעמים כדי להעריך את השונות של מכשיר ה-fax באותו ריצה. הכינו את צלחות האגר לפרוצדורה זו על ידי חימום של מספר הצלחות הרצוי (YPD פלוס G ארבע) למשך לפחות 1.5 שעות באינקובטור בטמפטורה של 37 °C הממוקם ליד ממיין ה-fax.

מאפיין מרכזי של פרוטוקול המיון הוא היכולת לכוון במדויק טטראדים שמוינו ב-fax למיקום ספציפי על פלטת אגר הכוללת מאגר של תמיסת X. כדי לעשות זאת, ראשית הניחו פלטת סימון (landmark) של 96 בארות ביחידת השקיעת התאים האוטומטית של המיין. לאחר מכן, הכינו תכנית מיון שתמיין 25 טטראדים לבערה אחת מתוך 96.

מיון בפורמט של 25 טטרות לצלחת מניב מושבות מופרדות היטב. בחרו באבור שנמצא קרוב למרכז הצלחת. לדוגמה, אבור D5.

העבירו ערימה של 10 צלחות אגר מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius אל המיון. קחו צלחת אגר אחת והוסיפו בעזרת פיפט 25 µL של תמיסת zy על האגר, קרוב למרכז הצלחת. לאחר מכן, הניחו את הצלחת על צלחת ה-landmark בעלת 96 בארות, כאשר טיפת ה-X מיושרת עם המטרה.

הבאר הזו נבחרה קודם לכן. באר D5. התחילו את המיון והניחו 25 טטרה במרכז טיפת ה-zy על פיתח האגר.

הוציאו את הפלטה וכסו אותה. חזרו על תהליך המיון עבור כל פלטה, עד ש-25 טטרדים ימוינו לתוך טיפות zamo בכל פלטה בערימה. החזירו את ערימת הפלטות המכילות טטרדים למדגרה בטמפרטורה של 37 degree Celsius.

הביאו את ערימת 10 הצלחות הבאה לממיין וחזרו על הליך המיון. ניתן להפריד את הנבגים לאחר שהצלחות המכילות אגר עם טטרדות עברו אינקובציה ב-37 °C למשך 1.5 שעות. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו 15 עד 25 חרוזי זכוכית סטריליים בקוטר 3 מילימטר לכל צלחת, ונערו את הצלחות כשתי ערימות של חמש צלחות כל אחת למשך שלוש עד חמש דקות.

הפרדה מיטבית של נבגים מושגת על ידי הזזת הפלטות בתנועות קשיחות מצד לצד או מקדימה לאחורה. אין להזיז את הפלטות באופן שגורם לחרוזים להסתובב בשולי הפלטה. השאירו את החרוזים על הפלטות עם סיום הפעולה.

הניחו את ערימת הצלחות, כאשר החרוזים פונים כלפי מעלה, באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C. הוציאו את ערימת הצלחות הבאה מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וחזרו על הליך הפרדת הנבגים באמצעות החרוזים. דגרו את כל הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C ביום שלאחר הפרדת הנבגים.

הוצאו בזהירות את הצלחות מהאינקובטור בטמפרטורה של 30 degrees Celsius מבלי להסיט את חרוזי הזכוכית. על הצלחות אמורות היו להיווצר מושבות קטנות. הסירו את חרוזי הזכוכית על ידי הפיכה זהירה ומהירה של הצלחות מעל מכל עמוק.

הקשה על תחתית הפלטה בעודה הפוכה עשויה לסייע בשחרור חרו지를 שנדבקו אליה. על המכלים להיות עמוקים מספיק כדי לתפוס את החרוזים מבלי לאפשר להם לקפוץ חזרה ולפגוע בפלטת האגר. ספרו את מספר המושבות בכל פלטה והשתמשו במספר המושבות כדי להעריך את יעילות ההפרדה וההשבה של הנבגים.

לדוגמה, 25 טטראדות לצלחת עבור הכלאה עם חיוניות של כמעט 100% עשויות להניב סה"כ 100 מושבות לצלחת, מתוך צלחות בעלות מספר מושבות מספיק, כגון יותר מ-65 עבור חיוניות גבוהה. העבירו תאים מכל מושבה לבאר נפרדת בלוח 96 בארות המכיל YPD נוזלי בתוספת G four 18. כמו כן, רשמו אילו בארות מכילות מושבות מאותה צלחת אגר.

מידע זה ישמש מאוחר יותר כדי לסייע בהקצאת הטטרות. שימוש בתוכנה יכול לשפר משמעותית את המהירות שבה ניתן לבודד נבגים מטטרדות. למרות שבגרסה הנוכחית של השיטה ישנו אובדן מסוים של יעילות בהשוואה לדיסקציה ידנית, נעשה שימוש בהתפלגות בינומית כדי לחשב את השבר הצפוי של טטרדות עם נבג אחד לפחות שהשגיח בהצלחה והפיק 1, 2, 3 או ארבע מושבות, בהסתמך על הפרופורציה של כל הנבגים שהושגו בהצלחה.

גרף זה יכול לשמש כמדריך כללי למספר הזנים שיורכבו בסופו של דבר לשלושה או ארבעה spore tetras כפי שנצפה כאן. מספר ה-tetras השלמים שהופקו עולה ככל שמספר המושבות לצלחת עולה במחקר זה. 25 rads מכל סוג, עם חיות נבגים קרובה ל-100% כפי שנקבע באמצעות דיסקציה ידנית, נזרעו על 149 צלחות אגר.

מספר המושבות המקסימלי שנצפה לצלחת היה 80, מה שמעיד על כך ש-20 נבגים לא הצליחו ליצור מושבות נפרדות. מספר המושבות הממוצע לצלחת היה 62. נאספו ורוצפו 4,354 מושבות מ-61 צלחות שהכילו 65 מושבות או יותר. מתוך 3,700 הזנים שעברו את בקרת האיכות של הריצוף, ניתן היה לשייך חישובית 2,665 מהם, או 72%, לשלוש או ארבע טטראדות של נבגים לאחר עיבוד הנתונים.

ניתן להשתמש בטכניקה זו לעיבוד של יותר מאלף טטראדות בשעה. עם זאת, עבור תהליכים הנמשכים יותר משלוש שעות, תזדקקו לסיוע.