Name: ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: חקור שיטת CCMS לזיהוי חלבונים המיקשרים ל-cyclic di-GMP בחיידקים באמצעות ספקטרומטריית מסה. השיטה משפרת ספציפיות ומאפשרת תנאי שטיפה קשים לניתוח אינטראקציות חלבוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאלברטו ריינדרס על עבודתו באופטימיזציה של תנאי CCMS עבור P. aeruginosa. אנו מודים גם לפבלו מנפרדי על ההערות של חלבוני P. aeruginosa. עבודה זו נתמכה על ידי מענק Sinergia של הקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNF) CRSII3_127433.

1. הכנת lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול P. תאי aeruginosa בLB לOD הרצוי. הערה: לקבלת הדרכה: להשתמש ≈ 100 מיליליטר תרבות / מדגם לתרבויות שלב נייחים ו -500 ≈ cultur מיליליטר / מדגם לתרבויות שלב יומן (600nm OD = 0.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 5000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ז Resuspend 0.5-1 של גלולה במאגר תמוגה 1 מיליליטר (6.7 מ&quot;מ MES, 6.7 מ&quot;מ HEPES, 200 מ&quot;מ NaCl, 6.7 מ&quot;מ כץ, 1 DDT מ&quot;מ, pH 7.5) ולהוסיף מעכבי פרוטאז (מיני מלא, ללא EDTA) וכן כDNaseI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse את התאים על ידי 3 מעברים דרך תא לחץ צרפתי, ב -20,000 psi (ראה חומרי רשימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultra-צנטריפוגה lysate התא בg x 100,000 עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את supernatant (עבור לשלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר 1x חיץ תמוגה על ידי pipetting מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flash-להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי ולאחסן ב -20 ° C עד משמשים ללכידתו של חלבונים בממברנה (ראה שלב 3). </li></ol> 2. ההסרה של נוקלאוטידים חינם ג-di-GMP ואחרים (שבר מסיס בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור desalting PD10 (חומרים לראות רשימה) עם 10 מיליליטר של חיץ תמוגה הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant (≈ 1 מיליליטר) על PD10 על מנת להסיר נוקלאוטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם 4 מיליליטר חיץ תמוגה הקרה (500 צעדי μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השברים מרוכזים ביותר, כפי שנקבע על ידי assay ברדפורד, וברכתם. </li></ol> 3. גלולה Resuspension וsolubilization (שבר ממברנה בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב500 עד 1,000 μl של חיץ לכידת 1x (ללא חומר ניקוי) (ראה טבלה 1). הערה: גלולה קשה resuspend. מומלץ פיפטה עד ראשונה ומטה עם טפטפת לכ resuspend גלולה, אז להשתמש במזרק 27 G לhomogenize הפתרון טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (או O / N) על גלגל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בg x 100,000 עבור שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר supernatant. </li></ol> מדידת ריכוז חלבון 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד (על ידי assay BCA לשבריר הקרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ריכוז החלבון הכולל עד 10 מ&quot;ג / מיליליטר. </li></ol> 5. לכידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 300 מיקרוגרם של חלבון עם 1 מ&quot;מ מהתמ&quot;ג, GTP, ATP, CTP, ו -20 μl של חיץ לכידת 5x (100 מ&quot;מ HEPES, 250 מ&quot;מ כץ, 50 מ&quot;מ MgAc, גליצרול 5%, pH 7.5) (טבלת 1). התאם את נפח התגובה ל -100 μl עם H 2 O. הערה: הנפח הכולל כולל את הנפח של CDG-CC וג-di-GMP במקרה של שליטת התחרות (ראה שלב 5.3 וטבלה 2). הערה: כל הניסויים בוצעו בשנת 200 ורצועות l 12-צינור PCR (Thermo Scientific); # 181. הערה: לשבריר הקרום, לוודא תמיד לשמור על ריכוז DDM מעל ריכוז micelle הקריטי (0.01% w / v) עד שלב solubilization החלבון ב 8 M אוריאה (שלב 7.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גלגל מסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיקרומטר CDG-CC (ריכוז סופי). הערה: כוללת שליטה ללא CDG-CC (המכונה בשם &quot;שליטת חרוז&quot;), ושליטה בתוספת 1 ​​מ&quot;מ ג-di-GMP (&quot;שליטת תחרות&quot;) (ראה טבלה 2). הערה: ריכוז CDG-CC יכול להיות מותאם 1-10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות (O / N לשבריר הקרום) על גלגל מסתובב, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיבוב קצר, קישור צולב על ידי הפעלה של מחצית התגובה של CDG-CC עם אור UV למשך 4 דקות, באמצעות CaproBox (ראה חומרי רשימה, λ = 310 nm, irradiance ≥10 mW / cm², מרחק מהמקור = 2 סנטימטר). הערה: להסיר את המכסה של הרצועות cross-linking לפני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl 5x חיץ לשטוף (5 M NaCl, 250 מ&quot;מ טריס, pH 7.5) ו -50 μl של חרוזים מגנטיים streptavidin גם מושעים, בעדינות homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על גלגל מסתובב. </li></ol> 6. שלבי כביסה הערה: (מגנט: ראה חומרי רשימה). התחל עם לכידתו של חרוזים המגנטיים במכסה רצועת PCR, עם המגנט. לאחר מכן להחליף את רצועת PCR על ידי אחד חדש המכיל את פתרון הכביסה הבא. הסר את המגנט וresuspend את החרוזים, דגירה 2 דקות. ספין למטה ולהחליף את המכסה על ידי מכסה טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי כביסה (חלק מסיס בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6 פעמים ב 200 חיץ הכביסה μl 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם אחת בכיתת ח HPLC 200 μl 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6 פעמים ב 200 אצטוניטריל 80% μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים בH הכיתה HPLC 200 μl 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדי כביסה (membraחלק ne בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים ב 200 חיץ הכביסה 1x μl DDM + 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + 0.025%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם ב -200 כביסה חיץ 1x μl DDM + .0125%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים ב200 μl 100 מ&quot;מ ABC (אמוניום ביקרבונט, NH 4 CO 3) + 2 M אוריאה. </li></ol></li></ol> 7. הכנת מדגם MS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים (ישירות במכסה) ב -20 μl 100 מ&quot;מ ABC (100 מ&quot;מ ABC + 8 M אוריאה לשבריר הקרום) ולהעביר לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק קרום רק: לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, רועד ב 500 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl 200 מ&quot;מ TCEP (טריס (2-carboxyethyl) phosphine) ולדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, רועד ב 500 סל&quot;ד. להתקרר עד 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של מוכנים טרי 400 מ&quot;מ iodoacetamide ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, רועדt 500 סל&quot;ד ובחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl 0.5 -acetyl-ציסטאין M N ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, רועד ב500 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק קרום רק: להוסיף μl 1 ליס-C ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם טריפסין ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת ב 500 סל&quot;ד (לעטוף בParafilm כדי למנוע התייבשות). הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה. הערה: חלק קרום רק: להוסיף 100 מ&quot;מ ABC כדי להתאים את ריכוז האוריאה ל&lt; 2 M לפני תוספת של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה ספין למטה הצינורות ולאסוף החרוזים עם המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש (חזור על שלב זה אם חרוזים הם עזבו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl 5% TFA (חומצת trifluoroacetic) + 1 μl 2 M HCl (15 μl 5% TFA + 5 μl 2 M HCl לשבריר הקרום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות המצב C18 MicroSpin (קבוצת קן, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) 150 עם μl אצטוניטריל (ספין 20 שניות ב2,400 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוהlibrate עמודות C18 2 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA (ספין 20 שניות, 2,400 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מדגם ספין 2 דקות, 2,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן הזרימה דרך על הטור ולחזור על שלב ספינינג (2 דקות, 2,000 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים 150 עם μl 0.1% TFA, 5 אצטוניטריל% (20 שניות, 2,400 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח צינור חדש וelute פעמיים עם 150 0.1% TFA μl, אצטוניטריל 50% (2 דקות, 2,000 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את פפטידים במהירות-VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב -40 μl 98% 2 O, אצטוניטריל 2%, 0.15% חומצה פורמית H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 שניות Sonicate (מחזור דופק 0.5, 100% משרעת; ראה חומרי רשימה) וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל&quot;ד (צנטריפוגות benchtop). מערבולת 10 שניות, וספין למטה 5 שניות, 12,000 סל&quot;ד. העבר בבקבוקון HPLC לניתוח LC-MS / MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא ב -20 ° C. הערה: ניתן לאחסן הדגימות ב -20 ° C בשלב זה. </li></ol> 8. LC-MS / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> equipp לרוץ ננו-LC (מערכות ננו-LC)ed עם טור RP-HPLC (75 מיקרומטר x 37 סנטימטרים) ארוז עם שרף C18 (Magic C18 AQ 3 מיקרומטר) באמצעות שיפוע ליניארית מ -95% (0.15% חומצה פורמית, אצטוניטריל 2%) ממס ו -5% B ממס ( אצטוניטריל 98%, 0.15% חומצה פורמית) עד 35% B ממס על 60 דקות בקצב זרימה של 0.2 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את פפטידים באמצעות LC-MS / MS (ספקטרומטר מסת לחץ כפול LTQ-Orbitrap ולוס, מחובר למקור יון electrospray). הערה: מצב רכישת נתונים הוקם כדי להשיג רזולוציה גבוהה אחד MS לסרוק בחלק FT של ספקטרומטר המסה ברזולוציה של 60,000 FWHM אחריו סריקות MS / MS במלכודת היון ליניארי של 20 יונים אינטנסיביים ביותר. כדי להגביר את היעילות של ניסיונות MS / MS, מודוס הקרנת המדינה הטעון התאפשר להוציא שלא הוקצה וביחידים גובה יונים. ניתוק מושרה קנוניה היה מופעל כאשר המבשר עלה 100 ספירת יון. משך ההדרה הדינמי נקבע ל -30 שניות. זמן הצטברות היון נקבע ל -300 אלפיות שניים (MS) ו -50msec (MS / MS). </li></ol> חיפוש 9. Database <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את P. aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים באמצעות דף הבית של צמח השדה <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את ספקטרום MS הגלם לתוך קבצים גנריים קמע (MGF) באמצעות כלי MassMatrix ההמרה <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">(http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש קובץ MGF זה באמצעות גרסת 2.3 קמע נגד פ aeruginosa צמח השדה-מסד נתונים המכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בעיכול טריפסין סיליקון ואחרי ליזין וארגינין (אלא אם כן אחריו פרולין) לסבול שתי החמיצו שסעים בפפטידים tryptic באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים חיפוש באתר על מנת לאפשר methionines המושחר (15.99491 Da) כשינויים וcarboxyamidomethylation (57.021464 Da) של שאריות ציסטאין כשינוי קבוע משתנים. לקמע חיפושינוing סריקות ברזולוציה גבוהה, להגדיר את הסובלנות ההמונית מבשר על 15 עמודים לדקה ולהגדיר את הסובלנות ההמונית הבר 0.6 Da. לבסוף, קבע את החלבון FDR עד 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את חיפושי הקמע של פ ניסויי aeruginosa CCMS לפיגום (Proteomesoftware, גרסה 3), להגדיר את הפרמטרים להשגה קרוב FDR חלבון ל -1%, ולחלץ כוללת ספירת הרפאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות הנציג שהוצגו במאמר זה, השתמשנו במבחן T לזווג להשוות את הניסוי עם שליטת התחרות, ונחשבו ללהיטים עם ערך p להלן 0.1, ויחס ספירת רפאים מעל 2 (להתנסות ספירת רפאים / רפאים שליטת תחרות רק ספירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנתונים ניתן לייצא בכל תוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. </li></ol> 10. כימות ללא תווית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הקבצים הגולמיים לתוכנת Progenesis LC-MS (קוי Dynamics, גרסת 4.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע יישור LC-MS וזיהוי תכונה בsetti ברירת המחדלמהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים בפורמט MGF מProgenesis LC-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש את ספקטרום MS / MS באמצעות הקמע נגד פ צמח השדה מסד נתוני aeruginosa מכילים קדימה וערכי חלבון הפוך דמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבא את תוצאות החיפוש באתר לProgenesis LC-MS ולמפות את הזדהויות פפטידים לתכונות MS1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת נתונים (חישוב רמות משמעות, יחסים לקפל-שינוי) את תסריט ProteinSQAnalysis של SafeQuant שימש (סף: ערך q להלן 0.1, יחס ספירת רפאים מעל 2). </li></ol>

<ol><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signalling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signalling in bacteria.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((You%27ve+come+a+long+way%3A+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">You've come a long way: c-di-GMP signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).</li>
<li>Schirmer, T., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mechanistic+determinants+of+c-di-GMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).</li>
<li>Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+their+options+open%3A+acute+versus+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li>
<li>Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+cyclic+di-GMP-specific+phosphodiesterase+and+its+allosteric+control+by+GTP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP.</a> J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).</li>
<li>Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP+signaling+in+bacteria%3A+recent+advances+and+new+puzzles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles.</a> J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).</li>
<li>Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+the+PilZ+domain+protein+PA4608+complex+with+cyclic+di-GMP+identifies+charge+clustering+as+molecular+readout%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout.</a> J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).</li>
<li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRP%2FFNR+family+protein+Bcam1349+is+a+c-di-GMP+effector+that+regulates+biofilm+formation+in+the+respiratory+pathogen+Burkholderia+cenocepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia.</a> Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).</li>
<li>Hickman, J. W., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FleQ+from+Pseudomonas+aeruginosa+as+a+c-di-GMP-responsive+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor.</a> Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).</li>
<li>Sudarsan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitches+in+eubacteria+sense+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.</a> Science. 321, 411-413 (2008).</li>
<li>Lenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+methyltransferases+and+other+S-adenosyl-L-homocysteine-binding+Proteins+by+Capture+Compound+Mass+Spectrometry+%28CCMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Köster, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Düvel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+to+identify+c-di-GMP+binding+proteins+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).</li>
<li>Christen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+cyclic+di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.</a> J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).</li>
<li>Balasubramanian, D., Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analyses+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa.</a> Human genomics. 3, 349-361 (2009).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).</li>
<li>Baraquet, C., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+diguanosine+monophosphate+represses+bacterial+flagella+synthesis+by+interacting+with+the+Walker+A+motif+of+the+enhancer-binding+protein+FleQ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).</li>
<li>DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+as+a+high-throughput+assay+to+identify+nuclear+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+receptor+signaling%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands.</a> Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59, 301-315 (2013).</li>
<li>Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+messenger+bis-%283%E2%80%98-5%E2%80%99%29-cyclic-GMP+and+its+PilZ+domain-containing+receptor+Alg44+are+required+for+alginate+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cyclic+diguanylate+in+the+non-catalytic+EAL+domain+of+FimX+induces+a+long-range+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change.</a> J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טיפול מיוחד יש לנקוט במספר צעדים לפרוטוקול. ריכוז החלבון הוא פרמטר קריטי בריכוז של 10 מ&quot;ג / מיליליטר להיות קשה להגיע כאשר תאים גדלים בתנאי גידול ספציפיים (למשל biofilms או גרסאות מושבה קטנות). לפיכך, resuspension גלולה צריכה להתבצע בהיקף נמוך של מאגר תמוגה. יכולים להיות ירידת ריכוזי חלבון עד 8 מ&quot;ג / מיליליטר. בהשוואה לשיטה שפורסמה על ידי Nesper et al. 1, הוספנו נוקלאוטידים שונים לתגובת הלכידה כדי למזער הלכידה הלא ספציפית של חלבוני נוקלאוטיד מ...

ג-di-GMP הוא שליח שני מרכזי המשמש את רוב החיידקים לשלוט בהיבטים שונים של הצמיחה והתנהגותם. לדוגמא, c-di-GMP מסדיר התקדמות תא מחזור, תנועתיות והביטוי של exopolysaccharides וadhesins משטח 2-4. באמצעות התיאום של תהליכים כאלה ג-di-GMP מקדם היווצרות biofilm, תהליך אשר מזוהה עם זיהומים כרוניים של מגוון רחב של חיידקים פתוגניים 5. ג-di-GMP הוא synthetized על ידי אנזימים הנקראים cyclases diguanylate (DGCs) כי נמל תחום GGDEF קטליטי 4. DGCs כמה בעלי אתר מעכב שלמטה מסדיר את פעילות cyclase על ג-di-GMP מחייב. השפלה של c-di-GMP היא זרז על ידי שני סוגים שונים של phosphodiesterases (PDEs) חסה או EAL קטליטי או HD-גיפ תחום 6,7. רוב חלבוני מפעיל הידועים כי ישירות לאגד ג-di-GMP שייך לאחד משלושה סוגים של חלבונים: קטליטיתחומים ברית פעילים GGDEF או EAL ותחומים פילץ, מתגים מולקולריים קטנים שעוברים שינויי קונפורמציה על ג-di-GMP מחייב 8. חלבוני DGCs, PDEs ופילץ מאופיינים היטב וניתן לחזות תחומיהם בסיליקון ויחסית בשלום. עניין מיוחד מתמקד כעת על זיהוי של סוגים חדשים של effectors ג-di-GMP. effectors חלק ג-di-GMP עם מוטיבים שונים מחייבים תוארה כזה לאחרונה כCRP Bcam1349 / FNR משפחת החלבון בBurkholderia cenocepacia או FleQ רגולטור תעתיק בפ aeruginosa 9,10. בנוסף, riboswitches ג-di-GMP ספציפי זוהו לאחרונה ומוצג לשלוט ביטוי גנים באופן c-di-GMP תלוי 11. המוטיבים ג-di-GMP המחייב של effectors שונה רק בצורה גרועה נשמרת ביצוע תחזיות bioinformatic של חלבונים כגון קשות. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו שיטה ביוכימית, המבוסס על השימוש בSPE ג-di-GMPבשילוב מגרש לכידת cific עם ספקטרומטר מסת 1,12,13. יש לנו לאחרונה מהונדס מתחם לכידת ג-di-GMP trivalent רומן (CDG-CC, איור 1) 1. פיגום כימי זה מורכב מ: 1) מחצית ג-di-GMP שימש כפיתיון כדי ללכוד ג-di-GMP מחייב חלבונים, 2) קבוצה תגובתי UV-photoactivatable נהגה לחצות קישור CDG-CC לחלבונים מחויבים ו 3) ביוטין לבודד את החלבונים שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה. CDG-CC ניתן להשתמש ישירות ובאופן ספציפי כדי ללכוד effectors ג-di-GMP מתערובת מורכבת של מקרו-מולקולות כlysates תא. מתחם לכידת מבוסס וגישות המבוססות פרוטאומיקה כימיות בעבר כבר דיווחו להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים, למשל Caulobacter crescentus, typhimurium serovar enterica סלמונלה וP. aeruginosa 1,14. במאמר המתודולוגי הזה,אנו מספקים בתיאור מעמיק של הליך CCMS באמצעות תמציות של פ aeruginosa כדוגמא. מחקר זה קובע CCMS ככלי רב עוצמה ורב לזהות ביוכימית רכיבי רומן המעורב באיתות מולקולה קטנה.

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td> <td>מנורות UV בשילוב עם בלוק קירור קירור של 96 לוחות, עבור</td></tr><tr><td>ביואנליטיקס</td><td>caproMag</td> caprotec <td>הכלול בערכת ההתחלה של CCMS</td><td>לטיפול קל בחלקיקים מגנטיים ללא פיפטינג</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>על פי בקשה</td><td>הערכה מכילה את תרכובת לכידת c-di-GMP, c-di-GMP (לבקרת התחרות), חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין, מאגר לכידה ומאגר כביסה</td></tr><tr><td>עמודי התפלה חד פעמיים PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>רצועות PCR 12 צינורות</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v סוניקטור עם טכנולוגיית אולטרסאונד VialTweeter</td><td>Hielscher</td><td>UIS250v ו-VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>תא לחץ צרפתי מיניאטורי</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-gmp חלבונים מפעיל

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

התקדמות ניכרת נעשתה בעשור האחרון לזיהוי והאפיון של אנזימים מעורבים בסינתזה (cyclases diguanylate) והשפלה (phosphodiesterases) של השליח השני ג-di-GMP. בניגוד לכך, מעט מידע זמין לגבי המנגנונים המולקולריים ומרכיבים תאיים שדרכו מולקולת איתות זה מסדיר מגוון רחב של תהליכים תאיים. רוב חלבוני מפעיל הידועים שייכים למשפחת פילץ או הידרדרו cyclases diguanylate או phosphodiesterases שויתר על קטליזה ואמצה פונקצית מפעיל. לכן, כדי להגדיר טוב יותר את רשת ג-di-GMP הסלולרי במגוון רחב של חיידקי שיטות ניסיוניות נדרשות לזהות ולאמת effectors רומן שאמין בתחזיות סיליקון ולהיכשל. יש לנו לאחרונה פיתחתי תרכובת רומן לכידת ספקטרומטריית מסה (CCMS) המבוססת על טכנולוגיית ככלי רב עוצמה לביוכימית לזהות ולאפיין מחייבים חלבוני c-di-GMP. טכניקה זו כבר דווחה בעבר להיות ישים למגוון רחב של אורגניזמים 1. כאן אנו נותנים תיאור מפורט של הפרוטוקול שאנו מנצלים לחקור רכיבי איתות כזה. כדוגמא, אנו משתמשים Pseudomonas aeruginosa, הפתוגן אופורטוניסטי שבי ג-di-GMP משחק תפקיד קריטי בשליטת ארסיות וbiofilm. CCMS זיהה 74% (38/51) של הרכיבים הידועים או צפויים של רשת ג-di-GMP. מחקר זה מסביר את הליך CCMS בפירוט, וקובע אותה ככלי רב עוצמה ורב-תכליתי לזהות רכיבי רומן מעורבים באיתות מולקולה קטנה.

לזהות effectors ג-di-GMP רומן בפ aeruginosa באופן שיטתי בשימוש CCMS לנתח את השברים המסיסים וקרום של פ PAO1 aeruginosa מתח מתרבות שלב יומן (OD 600 = 0.5). כאן אנו לסכם ולדון בתוצאות נציג של מסע הדיג הזה. ארבעה העתקים ביולוגיים עצמאיים היו בשימוש. עבור כל ניסוי שני ריכוזי CDG-CC שונים שמשו (5 מיקרומטר ו -10 מיקרומטר). לחקור לסגולי, ניסויים בוצעו בנוכחותו או היעדריו של 1 ג-di-GMP מ&quot;מ כמתחרה, ולבסוף, עם שליטת חרוז (כלומר ללא CDG-CC) ...

השליח השני c-di-GMP הנפוץ בכל מקום שולט בגדילה ובהתנהגות של חיידקים רבים. פיתחנו טכנולוגיה חדשה המבוססת על ספקטרומטריית מסה של תרכובת לכידה לזיהוי ואפיון ביוכימי של חלבונים קושרים c-di-GMP כמעט בכל מין חיידקים.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

המטרה הכוללת של ניסוי ספקטרומטריית המסה של תרכובת הלכידה היא ללכוד ולזהות חלבונים קושרים GMP מחזוריים. זה מושג על ידי פיצול, תרבית תאים על ידי העיתונות הצרפתית והסרת ה-gmp המחזורי החופשי. באמצעות עמודת PD 10 כשלב שני, תרכובת הלכידה מתווספת ומופעלת על ידי אור UV כדי להצליב קוולנטית את חלבוני ה-GMP המחזוריים הקשורים לתרכובת הלכידה בהיעדר או בנוכחות עודף של GMP מחזורי חופשי.לאחר מכן, תרכובת הלכידה קשורה לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין על מנת לשטוף באופן אינטנסיבי את החלבונים שנלכדו. לבסוף, החלבונים שנלכדו מתעכלים ומוכנים לספקטרומטריית מסה כדי לזהות את הפפטידים שנוצרו לאחר מכן התוצאות מנותחות בסיליקו. היתרון העיקרי של CCMS של השיטות הקיימות שלנו כמו משקעים משותפים, הוא שתרכובת הלכידה משפרת את הלכידה הספציפית של שותפים ישירים ומאפשרת תנאי כביסה קשים הודות לקישור העלויות הקוולנטי.כעת שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי איתות GMP מחזורי חיידקים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון איתות נוקלאוטידים באופן כללי ולמעשה כל מולקולה המונעת לתרכובת הלכידה. לפני תחילת הליך זה, הכינו ולייז תאי אירוגן p דרך תאי לחץ צרפתיים אולטרה אולטרה-צנטריפוגה התא ליזאט ב-100,000 פעמים G למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.לאחר שמירת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם מיליליטר אחד של מאגר x ליזה אחד על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לאחר אולטרה-צנטריפוגה באותם תנאים כמו קודם. הבזק הקפיא את הגלולה בחנקן נוזלי, ולאחר מכן אחסן את הדגימה הקפואה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש ללכידת חלבוני ממברנה. לאחר שטיפה זו עמוד התפלה PD 10 עם 10 מיליליטר של מאגר ליזיס קר.יוצקים את הסופרה נטנט על ה-PD 10 על מנת להסיר נוקלאוטידים, ואז מרוקנים עם ארבעה מיליליטר של מאגר ליזה קר במרווחים של 500 מיקרוליטר. השתמש במבחן ברדפורד כדי לקבוע את השברים המרוכזים ביותר. לאחר מכן אסוף את השברים שנבחרו בצינור 1.5 מיליליטר Resus.השעו את הגלולה המאוחסנת בעבר ב-500 עד 1000 מיקרוליטר של מאגר לכידה אחד ללא חומר ניקוי. הוסף 1% משקל לנפח תמיסת קצה בטא D מולטי פורין בצד לדוגמא. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות על גלגל מסתובב.בסיום, אולטרה-צנטריפוגה של הדגימה ב-100,000 פעמים G למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. בשלב זה, ערבבו 300 מיקרוגרם חלבון עם מילימולר אחד של G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P, ו-20 מיקרוליטר של מאגר לכידה פי חמישה.התאם את נפח התגובה ל -100 מיקרוליטר עם מים. לאחר דגירה של הדגימה בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב, הוסף 10 מיקרומולר של תרכובת לכידת GMP מחזורית. לאחר מכן דגרו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות עבור החלק המסיס או למשך הלילה עבור שבר הממברנה על גלגל מסתובב בחושך.לאחר סיבוב קצר והסרת מכסה, קישור צולב על ידי הפעלת החלק התגובתי של תרכובת לכידת ה-GMP המחזורית עם אור UV למשך ארבע דקות באמצעות קופסת שורת מכסה. לאחר מכן הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר כביסה חמישה x ו-50 מיקרוליטר של סטרפטוקוקוס תלוי היטב AVID בחרוזים מגנטיים. הומוגניזציה עדינה של הדגימה.לאחר מכן דגרו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה על גלגל מסתובב. לאחר לכידת החרוזים במכסה בעזרת מגנט, שטפו את השברים המסיסים שש פעמים ב-200 מיקרוליטר של מאגר כביסה X אחד לאחר כביסה פעם ב-200 מיקרוליטר של שטיפת מים בדרגת HPLC שש פעמים ב-200 מיקרוליטר של 80% אצטו ניטריל, ופעמיים ב-200 מיקרוליטר של מים בדרגת HPLC לשטיפת שבר הממברנה חמש פעמים ב-200 מיקרוליטר של מאגר כביסה X אחד והפחתת ריכוזים של שמן קצה בטא D מולטי פוריק בצד. לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים ב-20 מיקרוליטר של אמוניום ביקרבונט 100 מילי-מולרי עבור החלק המסיס ו-100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט בתוספת שמונה אוריאה מולארית.עבור שבר הממברנה, העבירו כל מתלה לצינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר הדגירה של שבר הממברנה, הוסף 0.5 מיקרוליטר של 200 טריס מילימולר. שני קרבוקסי אתיל פוספין לשני השברים ודגירה ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ניעור ב-500 סל"ד.לאחר שהדגימות התקררו ל-25 מעלות צלזיוס, הוסיפו 0.5 מיקרוליטר של 400 מילי-מולר טרי I oto אצטמיד לאחר הדגירה בחושך. הוסף 0.5 מיקרוליטר של 0.5 טוחנת ואצטילציסטאין לכל שבר. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם ניעור ב-500 סל"ד.בשלב זה, הוסף מיקרוליטר אחד של LY C לשבר הממברנה לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס. הוסף שני מיקרוגרם טריפסין לכל דגימה ועטוף אותם בפרפורם כדי למנוע ייבוש. לאחר הדגירה וסיבוב הדגימות, העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור חדש של 1.5 מיליליטר בעזרת המגנט כדי להימנע מאיסוף החרוזים.לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של 5% חומצה טריכלורואצטית ומיקרוליטר אחד של שני חומצה הידרוכלורית מולרית לחלק המסיס, הוסף 15 מיקרוליטר של 5% חומצה טריכלורואצטית וחמישה מיקרוליטר של שני חומצה הידרוכלורית מולרית למצב שבר הממברנה. C 18 עמודות מיקרו ספין עם 150 מיקרוליטר אצטו ניטריל על ידי סיבוב של 20 שניות ב-2, 400 סל"ד. לאחר שהעמודות אוזנו פעמיים עם 150 מיקרוליטר של 0.1% חומצה אצטית טרי פלואורו, טען את הדגימה וסובב במשך שתי דקות.ב-2000 סל"ד, טען מחדש את הזרימה דרך העמודים. לאחר חזרה על הסיבוב ושטיפת העמודים עם 0.1 חומצה אצטית טרי פלואורו ואצטו ניטריל, קח צינור חדש והוציא פעמיים עם 150 מיקרוליטר של 0.1% חומצה אצטית טרי פלואורו, ו-50% אצטו ניטריל. לאחר ייבוש הפפטידים במהירות vac Resus משהה אותם ב-40 מיקרוליטר של 98% מים, 2% אצטיל ניטריל ו-0.15% חומצה פורמית.לאחר שהדגימות עברו סוניקציה למשך 20 שניות, סובב אותן למשך חמש שניות ב-12,000 סל"ד לאחר מערבולת וסיבוב, העבירו את הדגימות לבקבוקוני HPLC לניתוח lc MS MS. רשימת הפגיעה הראשונית מתרבית פאזה של P aerogen log כוללת 768 חלבוני שבר מסיסים ו-433 חלבוני שבר ממברנה לאחר הסרת חלבונים שלא נלכדו במיוחד, הרשימה צומצמה ל-76 חלבוני שבר מסיסים ו-133 חלבוני שבר ממברנה. זה כלל 13 חלבונים מסיסים ו -21 ממברנה מ- P aerogen הידועים או צפויים לקשור צבע מחזורי. GMP.63 החלבונים המסיסים האחרים ו -112 הממברנה הם קוביות מחזוריות משוערות חדשות. חלבונים קושרים GMP, שאינם מכילים את אחד מתחומי הקישור המחזוריים הידועים של GMP. CCMS עם תמציות תאים שנקטפו מתנאי גידול שונים ועם מחזוריות תוך-תאיות שונות.נעשה שימוש גם בריכוזי GMP. בסך הכל, 74% מרכיבי האיתות הידועים או החזויים של p, PO מחזורי אחד, GMP נלכדו. בהתחשב בכך שלפחות תשעה מהגנים הללו הוכחו כמשועתקים בתנאים ספציפיים ושחלקם עשויים שלא לקשור תביעה מחזורית, GMP בכלל, דרגת כיסוי זו עשויה להיות קרובה לרוויה.זה יחד עם ההבחנה שרוב הרכיבים הללו נלכדו בספציפיות גבוהה, טוען בתוקף שטכניקה זו יעילה ועוצמתית. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שבחירת המועמדים החזקים תושג על ידי השוואת ספציפיות הלכידה של אפקטורי DGP נפשיים ידועים. אז בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו Drac, ubi, קישור צולב, סריקה דיפרנציאלית, מיקרו פלואורומטריה או טלמטריה איזותרמית על מנת לאמת קשירה ספציפית של המועמדים למחזור ה-GMP.

capture-compound-mass-spectrometry-powerful-tool-to-identify-novel-c

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

אנו מציגים וריאציה של (immunoprecipitation כמותיים בשילוב עם מציאה) הגישה המהירה שהוצגה בעבר להבחין בין אמת ושקר אינטראקציות בין חלבונים. הגישה שלנו מבוססת...

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

שרשרת פולימראז משופר שיטת פולימורפיזם תגובת הגבלה שבר אורך עבור genotyping מיני נפוחיתיים ידי ספקטרומטריית נוזלי כרומטוגרפיה / מסה מתוארת. טור מונולית סיליקה הפוכה פאזיים מועסק להפרדת amplicons מתעכל. שיטה זו יכולה להבהיר את המוני monoisotopic של oligonucleotides, אשר הוא כלי שימושי לזיהוי רכב בסיס.

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

תיוג מבשר איזוטופים בשילוב ותיוג isobaric (cPILOT) הוא אסטרטגית פרוטאומיקה כמותית המשפר יכול ריבוב מדגם של תגי isobaric. פרוטוקול זה מתאר את היישום של cPILOT לרקמות מתוך שולטת מודל עכבר מחלת אלצהיימר ו wild-type.

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

תיוג איזוטופי משולב ותיוג איזובארי (cPILOT) היא אסטרטגיית מולטיפלקס מדגימה משופרת המסוגלת להגדיל את מספר הדגימות שניתן לנתח בו-זמנית עם תגיות איזובריות זמינות. התאגדות של פלטפורמה רובוטית הגדילה מאוד את התפוקה הניסיונית, הרבייה והדיוק הכמותי.

מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

חקור שיטת CCMS לזיהוי חלבונים המיקשרים ל-cyclic di-GMP בחיידקים באמצעות ספקטרומטריית מסה. השיטה משפרת ספציפיות ומאפשרת תנאי שטיפה קשים לניתוח אינטראקציות חלבוניות.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

גלה סרטונים נוספים