Name: אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למד אפיון ביטוי גנים בתאי גזע עוברי אדם בודדים באמצעות RT-PCR כמותי ברמת תא בודד. שיטה זו חושפת את ההטרוגניות באוכלוסיות תאי הגזע ומסייעת לחוקרים להבין את מנגנוני הבקרה הגנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).

1. הכנת פלייט 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1 μl של תא בודד DNase1 לתא בודד 9 μl תמוגה פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הפתרון מעורב 10 μl בכל טוב של 96 היטב צלחת ה-PCR. </li></ol> 2. ניתוק hESCs לטיהור FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק Oct4 :: שורת תאי EGFP ES מצלחת 60 מ&quot;מ עם 1 מיליליטר Accutase עבור 20 דקות, על 37 מעלות צלזיוס, שנוטרלו עם תקשורת ES אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אוכלוסיית תאים ב 1 מיליליטר FACS חיץ ולהתאים את התא ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת התא דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצינור בקרח לפני מיון תא. </li></ol> 3. תמוגה של תא בודד מטוהר-FACS בבאר כל הצלחת 96 היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את המדגם עבור תאים חיוביים EGFP על סדרן תא עם מפעיל מיומן. שים את התא הבודד לפתרון Lysis/DNase1 תא בודד בצלחת PCR 96 היטב. במידת צורך, 9צלחת 6 היטב עם מדגם יכולה להיות מאוחסנת ב-80 ° C מקפיא עמוק פחות מחודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות 5 דקות ב RT לתמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של להפסיק פתרון כדי לעצור את תגובת תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 2 דקות ב RT. </li></ol> 4. הפוך תמלול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לכל aliquot 0.5 μl של 20 מיקרומטר SMA-T15, SMA-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl חיץ 5X, 2 μl DTT, μl ההפוך transcriptase 1, וdNTP μl 1 היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שעתוק לאחור בCycler תרמית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תכנית התרמית על 42 מעלות צלזיוס × 90 דקות ולהשבית טרנסקריפטאז הפוך על 85 מעלות צלזיוס × 5 דקות. </li></ol></li></ol> 5. הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של מגיב ExoSAP-IT לכל דגימה עיבד הפוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ו80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית מגיב ExoSAP-IT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובת PCR wה-i SMA-P2 (2 ננומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של תערובת תגובת PCR לכל דגימה הפוכה עיבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את ההגברה, בהיקף של 20 מחזורים של denaturation (94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות), חישול (57 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות), וסיומת (68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). </li></ol> 6. QRT-PCR ביצועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2X SYBR גרין PCR מיקס מאסטר, 1 μl cDNA הגברה, 2 פריימרים ננומטר, ו7 מים μl היטב כל אחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את התכנית ואחרי 95 מעלות צלזיוס במשך 3 שניות, C ° 60 ל30 שניות x 40 מחזורים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בשני עותקים לטעויות טכניות. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרופיל גנטי תא בודד יכול להיות כלי עיקרי לחזות את הפונקציונליות של תא בודד או אוכלוסייה שלמה. עקב מגבלות טכניות, ניתוח פרופיל הגנטי כולו הוגבל לממוצע אוכלוסייה. שינויים בדפוסי ביטוי גנים והרמות בין תאים הבודדים והאוכלוסיות הוצעו לגרום לפרשנות מוטעה. ניתן למצוא היבטים תאיים מגוונים כגון בhESCs וההטרוגניות שלהם גורמת ליכולת שונה בעדינות לשמירה על pluripotency ותהליך מפרט גורל. פיתחנו ומאומתים על כמותיים תא בודד RT-...

אוכלוסיות eukaryote רוב גבוהות יותר הן הטרוגנית וכך עם ניתוח של אוכלוסייה נקוותה, הוא לעתים קרובות קשה לפרש תכונות הסלולריות שלהם. תאים בודדים בתוך אוכלוסייה עשויים להיות מעט שונים, והבדלים אלה יכולים להיות השלכות חשובות עבור הנכס והתפקוד של כל האוכלוסייה 1, 2. במיוחד, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ידועים להיות הטרוגניות, מה שגורם לרמות שונות של pluripotency ופוטנציאלים מגוונים למפרט שושלת בעדינות דרכים ייחודיות 3, 4. לדוגמא, ניתן להשתמש בם פני השטח אנטיגנים תא שונים כדי לסווג את תאי גזע pluripotent מובחנים, 5 וקבוצת אוסטין סמית מוצעת רמות שונות של pluripotency בתאי גזע העובריים של עכברים, המבוססים על המורפולוגיה, הנטייה והתלות של מסלול איתות 6 הבידול שלהם. תופעה זו הייתה שיערו בעובר אנושיתאי גזע NIC 7. בעוד שהמחקרים הכוללים בוצעו בין קווים שונים בתאי גזע, ולא בתאי גזע אחד בודדים, זה יכול להיות מאוד מעניין לנתח את הרמות של pluripotency שונים ברמת התא הבודד, אשר באופן פוטנציאלי משפיעה על יכולות ההבחנה שלהם כלפי כל שושלות התאים סומטיים. הטרוגניות תאית ומולקולרית יכולה להיות מוכתבת על ידי פרופיל שעתוק, אשר נקראה &quot;transcriptome התא הבודד &#39;ומדגישה גישות חדשות לכימות רמות ביטוי הגנים 8-10. לניתוח של רמות ביטוי הגנים בתאים בודדים, פיתחנו פרוטוקול פשוט, אבל חזק של תא הבודד RT-PCR. אנחנו אישרו את היעילות ואת הכדאיות של הפרוטוקול שלנו על ידי השוואת כל מחצית lysates תא הבודד, כמו גם RNAs הכולל דילול סדרתי של hESCs, וכתוצאה מוריאציות טכניות מינימליות והבדלים. יתר על כן, אנו משמשים קו כתב גנטי לבודד עמ הומוגניתopulation של hESCs באמצעות מערכת מיקוד גן. הווקטור התורם למיקוד לוקוס Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro לבנות) וזוג פלסמידים Talen שימש 11. וקטור התורם וזוג פלסמידים Talen הוכנסו hESCs (H9, WA09) באמצעות nucleofection ופרוטוקול בחירה משובט והתחזוקה של hESCs בוצע על בסיס פרוטוקול השגרה שלנו 12. אנחנו אישרו שורת כתב זה גנטי לבטא EGFP לביטוי Oct4 בOct4 :: EGFP hESCs. התוצאה שלנו מוכיחה כי hESCs הבודד (מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים מאוד EGFP) להחזיק רמות גבוהות של ביטוי Oct4, אבל רמות של ביטוי Nanog שונות. לכן, assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי ללמוד heterogeneities אוכלוסייה של תאי גזע pluripotent.

<table><tbody><tr><td>96 בארות PCR צלחת</td><td>ארה"ב מדעית</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>אמביון תאי ליזה ערכת</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Reverse Transcriptase</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה Taq DNA פולימראז High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ dNTP MixPCR כיתה</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR אוניברסלי 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS מאגר</td><td></td><td></td><td>45 מ"ל PBS, 5 מ"ל AMEM, 100 &mu; l DNase, פילטר מעוקר</td></tr><tr><td>35 &mu; צינורות כובע מסננת תאים m BD</td><td>Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי rt-pcr

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

ההטרוגניות של אוכלוסיית תאי גזע פוגעת בהבנה מפורטת של ביולוגיה של תאי גזע, כגון הנטייה הבידול שלהם כלפי שושלות שונות. Assay transcriptome התא בודד יכול להיות גישה חדשה ללנתח וריאציה בודדת. פיתחנו שיטת qRT-PCR תא הבודד, ואישרתי כי שיטה זו עובדת היטב במספר פרופילי ביטוי גנים. ברמת תא בודדת, כל תא גזע עוברי אנושי, מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים EGFP, יש ביטוי גבוה בOct4, אבל רמת ביטוי Nanog שונה. assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי לחקור heterogeneities אוכלוסייה.

הגברה RNA התא בודדת יעילה וחזקה כדי לצמצם את השוני בין תעתיק hESCs, השתמשנו Oct4 :: שיבוט EGFP hESC לטיהור FACS. לאחר מיון Oct4 :: תאים חיוביים EGFP לתוך צלחת 96 היטב, כל תא הוא lysed במאגר תמוגה והמיר פולי (א) + RNA לcDNA באורך מלא באמצעות פריימר SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) ועיגון עם SMA-(ACATGTATCCGGATGTGGG ) על ידי שימוש בטכנולוגית מיתוג תבנית SMART. ...

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאפיין רמות ביטוי גנים של תאי גזע עובריים אנושיים בודדים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי של תא בודד, או R-T-P-C-R. דבר זה מושג תחילה על ידי שימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה כדי למיין תאים בודדים לכל באר של פלטת 96 בארות המכילה באפר ליזיס של תאים. השלב השני הוא ביצוע שעתוק הפוך של RNA כדי לייצר CDNA מליזאטים של תאים בודדים.בשלב הבא, ה-CDNA מוגבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז. השלב הסופי הוא ביצוע quantitative R-T-P-C-R על ה-CDNA המוגבר. בסופו של דבר, בדיקה זו מועילה לחקר ביטוי גנים באוכלוסיות הטרוגניות, כגון תאי גזע עובריים אנושיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני כלי מלאכותי כמותי קיים לתא בודד הוא ששיטה זו, EEG, ועמידה יותר לפני טיהור הפרקסיס. תאי גזע עובריים אנושיים המבטאים EGFP או hES מופרדים מהצלחת בנפח 60 מילימטר. הסירו את כל המצע, הוסיפו 1 mL של Accutane והדגרימו בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות.נטרלו את ה-Accutane באמצעות מיליליטר אחד של מצע human ES, וסובבו בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים. לאחר השלכת הנוזל העליון, השעו את התאים ב-fax buffer והתאימו את הריכוז ל-1×10⁶ תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו את דגימת התאים דרך מסנן תאים של 35 µm למבחנה. אחסנו את המבחנה על קרח לפני מיון התאים.התחילו את הפרוצדורה על ידי הכנת תערובת מאסטר (master mix) המכילה 1 µL של single cell D Ns one ו-9 µL של תמיסת ליזיס לתאים בודדים (single cell lysis solution). העבירו 10 µL מתמיסת התערובת לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים עבור אנליזה של FACS. תכננו את המיון התאי כך שימיין תאים בודדים חיוביים ל-EGFP אל תוך הבאערים של לוח ה-PCR בעל 96 הבאערים. לאחר מיון התאים, דגרו את הדגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לצורך ליזיס של התאים. כדי להפסיק את תגובת הליזיס, הוסיפו 1 µL של תמיסת עצירה (stop solution) ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.כדי להתחיל בנוהל זה, הוסיפו תחילה לכל באר בלוחית 96 הבערים 0.5 µL של Eloqua המכיל 20 µM של פריימרים ל-SMAT 15 ו-SMAA. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 80 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 4 µL של באפר 5x, 2 µL של DTT, 1 µL של reverse transcriptase ו-1 µL של dNTPs.בצעו שכתוב הפוך (reverse transcription) בכל באר באמצעות מחזור תרמי (thermal cycler). הגדירו את התוכנית התרמית ל-42 °C למשך 90 דקות, ולאחר מכן ל-85 °C למשך חמש דקות. כדי לנטרל את השכתוב ההפוך (reverse transcriptase) עם סיום השכתוב ההפוך, הוסיפו 4 µL של exo reagent לכל דגימת cDNA והדגירו ב-37 °C למשך 15 דקות כדי לעכל אוליגונוקלאוטידים עודפים, ולאחר מכן ב-80 °C למשך 15 דקות.כדי לבטל את פעילותו של ריאגנט ה-exo, הכין את תערובת התגובה של ה-PCR עם 2 nM של הפריימר SMAP two. הוסף 10 µL מתערובת התגובה של ה-PCR לכל דגימה שעברה שעתוק הפוך.בצעו את ההגברה הכוללת 20 מחזורים של דנטורציה, הצמדה והארכה. לאחר הגברת הדגימות, בוצעו שתי סדרות של תגובות quantitative R-T-P-C-R בלוחיות נפרדות כדי לאשש את תוצאות ה-R-T-P-C-R. לכל באר בשתי לוחות ה-96 בארות הוסיפו 10 µL של two x cyber green PCR master mix, מיקרוליטר אחד של cDNA מוגבר, שני פריימרים ו-7 µL של מים. הגדירו את התוכנית ל-95 °C למשך שלוש שניות, ולאחריהן 60 °C למשך 30 שניות.במהלך 40 מחזורים, שלב ה-kneeling מוסר כדי להפחית את השגיאה של הפריימר. במחקר זה, כמויות במיקרוגרמים של RNA כולל של Hess דוללו לרמות של ננו ופיקוגרמים כדי להעריך שונות טכנית וזיהוי הבדלים בכמויות נמוכות של RNA כולל. RT-qPCR כמותי של הגן G-A-P-D-H בוצע באמצעות mRNA של קליפות מאוחדות שדוללו בסדרה מ-10 ng/µL ל-0.1 pg/µL. כל נקודה מציגה את ערך ה-CT של mRNA שדולל בסדרה ושל mRNA מתא בודד שמופר באמצעות FACS.נצפתה קורלציה בין כל דגימה לתוצאות ה-QR TPCR, כאשר מספר תאים בודדים הראו ערכי CT דומים. נעשה שימוש ב-Fax כדי למיין ולבחור תאים חיוביים ל-EEG FP חזקים משורת תאי HESC בעלי דגמי EGFP ארבעה מסוג OCT. התוצאות מראות אוכלוסייה חיובית ל-EGFP של כ-60% בהשוואה לאוכלוסייה השלילית, על מנת לתקף עקביות בין סדרות שונות של תגובות שעתוק הפוך והגברה.ליזאטים של תאים בודדים ששולפו באמצעות Fax חולקו לשני חצאים, והפרוטוקול הוחל על כל חצי לצורך השוואות בין דגימות. נצפתה קורלציה משמעותית בין ערכי ה-CT של OCT four בכל חצי של ליזאטים של התאים הבודדים. הצגה של מפת חום (heat map) של ביטוי גנים בתא בודד מראה רמה עקבית וחזקה של ביטוי OCT four, אך רמות משתנות של גן סמן לתאי גזע אחר, NAN og. יחד, תוצאותינו מדגימות כי בדיקה זו של ביטוי גנים בתא בודד שימושית לחקר הטרוגניות של אוכלוסיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע נכון את ה-QITP עבור טרנסקריפטום של תא בודד.

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

זיהוי של תאי מוח סרטני ייזום (BTICs), תאים הנדירים בטווח של תכונות הטרוגניות גידול בעלי תאי גזע, מספק תובנה חדשות על היווצרות גידול במוח האנושית. יש לנו מעודנים תנאי התרבות ספציפיים להעשרה לBTICs, ואנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה להעשיר אוכלוסיות אלה עוד יותר. מבחנים עצמי חידוש וניתוח תמליל של התא הבודד RT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע בתאים מבודדים.

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

אנו מתארים שיטה למיון תאי יונקים בודדים ולכמת את הביטוי של עד 96 גנים מעניינים בכל תא. שיטה זו כוללת שימוש בתקני qPCR פנימיים כדי לאפשר הערכה של ספירת תעתיקים מוחלטת.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

למד אפיון ביטוי גנים בתאי גזע עוברי אדם בודדים באמצעות RT-PCR כמותי ברמת תא בודד. שיטה זו חושפת את ההטרוגניות באוכלוסיות תאי הגזע ומסייעת לחוקרים להבין את מנגנוני הבקרה הגנטית.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

גלה סרטונים נוספים