אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור פרופיל של רמות ביטוי גנים של תאי גזע עובריים אנושיים בודדים באמצעות תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותי של תא יחיד, או R-T-P-C-R. זה מושג על ידי שימוש תחילה במיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים כדי למיין תאים בודדים לכל באר של צלחת 96 באר המכילה מאגר ליזה של תאים. השלב השני הוא תמלול RNA הפוך כדי ליצור CDNA מליזטים של תא בודד.

לאחר מכן, ה-CDNA מוגבר על ידי תגובת שרשרת פולימראז. השלב האחרון הוא לבצע R-T-P-C-R כמותי על ה-CDNA המוגבר. בסופו של דבר, בדיקה זו שימושית לחקר ביטוי גנים באוכלוסיות הטרוגניות כגון תאי גזע עובריים אנושיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני כלי מלאכותי כמותי של תא בודד קיים הוא ששיטה זו, EEG וחזקה יותר לפני טיהור הפקס. תאי הגזע העובריים האנושיים של OCT 4 EGFP או Hess מנותקים מצלחת ה-60 מילימטר. מוציאים את כל המדיום, מוסיפים מיליליטר אחד של אקוטן ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לנטרל אקוטן עם מיליליטר אחד של צנטריפוגת מדיה ES אנושית כדי לגלול את התאים לאחר השלכת תאי ההשעיה הסופרנטנטים במאגר הפקס ולהתאים את הריכוז לאחת כפול 10 לששת התאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו את דגימת התא דרך צינור מכסה מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר. אחסן את הצינור על קרח לפני מיון התאים.

התחל הליך זה על ידי הכנת תערובת מאסטר המכילה מיקרוליטר אחד של תא יחיד D Ns אחד ותשעה מיקרוליטר של תמיסת ליזה של תא בודד. עבור כל אחד, העבירו היטב 10 מיקרוליטר מתמיסת התערובת לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות לתוכנית ניתוח פקס, סדרן התאים למיון תאים חיוביים בודדים של EGFP לבארות של צלחת ה-PCR של 96 בארות לאחר מיון התאים, דגירה על הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לליזה של תאים. כדי לעצור את תגובת הליזיס, הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת עצירה ודגר בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף תחילה לכל באר של צלחת 96 הבאר Eloqua של 0.5 מיקרוליטר של 20 פריימרים מיקרומולריים SMAT 15 ו-SMAA. מחממים את הדגימות בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר של חמישה x buffer, שני מיקרוליטר DTT, מיקרוליטר אחד של טרנסקריפטאז הפוך ומיקרוליטר אחד של D ו-tps.

לכל באר בצע שעתוק הפוך במחזור תרמי. הגדר את התוכנית התרמית על 42 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, ולאחר מכן 85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. כדי לנטרל את הטרנסקריפטאז ההפוך לאחר השלמת השעתוק ההפוך, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של מגיב אקסו לכל דגירה של דגימת CDNA ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לעכל גלישות אוליגונוקלאוטידים עודפות, ואחריהם 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

כדי לנטרל את מגיב האקסו, הכינו את תערובת תגובת ה-PCR עם שני ננו מולר של פריימר SMAP שני. הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR. לכל דגימה מתומללת הפוכה.

בצע את ההגברה המורכבת מ -20 מחזורי דנטורציה, כריעה והארכה לאחר הגברה של הדגימות בוצעו שתי קבוצות של תגובות R-T-P-C-R כמותיות בלוחות נפרדים לאישור תוצאות R-T-P-C-R לכל באר מ -2 לוחות באר 96 הוסף 10 מיקרוליטר של שני x ירוק סייבר. מאסטר PCR מערבב מיקרוליטר אחד של CDNA מוגבר, שני פריימרים ושבעה מיקרוליטר מים. הגדר את התוכנית ל-95 מעלות צלזיוס למשך שלוש שניות, ולאחר מכן 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.

במשך 40 מחזורים, מדרגת הכריעה מוסרת כדי להפחית את שגיאת הפריימר. במחקר זה, כמויות מיקרוגרם של סך ה-RNA של הס דוללו לרמות ננו ופיקוגרמה כדי להעריך את השונות הטכנית וזיהוי ההבדל בכמויות נמוכות של R-T-P-C-R כמותי של הגן G-A-P-D-H בוצע באמצעות MR. NA של קליפות מאוגדות מדוללות באופן סדרתי מ-10 ננוגרם למיקרוליטר ל-0.1 פיקוגרם למיקרוליטר. כל נקודה מציגה את ערך ה-CT של mRNA מדולל סדרתי ו-mRNA של תא בודד הממוין לפי פקס.

נצפה מתאם בין כל דגימה לתוצאות QR TPCR עם מספר תאים בודדים המראים ערכי CT דומים. פקס שימש למיון ובחירה של תאים חיוביים חזקים של EEG FP מקו HESC של מדווח OCT 4 EGFP. התוצאות מראות אוכלוסייה חיובית ל-EGFP של כ-60% בהשוואה לאוכלוסייה השלילית כדי לאמת עקביות בין קבוצות שונות של תגובות שעתוק והגברה הפוכות.

ליזטים של תאים בודדים מטוהרים בפקס חולקו לשניים והפרוטוקול הוחל על כל מחצית לצורך השוואות אצווה. נצפה מתאם מובהק בין ערך ה-OCT 4 CT של כל מחצית של ליזטים של תא בודד. הצגת מפת חום של ביטוי גן קליפה בודדת מראה רמה עקבית וחזקה של ביטוי OCT 4, אך רמות משתנות של גן סמן תאי גזע אחר, NAN og יחד עם התוצאות שלנו מדגימות כי בדיקת ביטוי גנים של תא בודד זו שימושית לחקר הטרוגניות אוכלוסייה של תאי גזע פלוריפוטנטיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את ה-QITP עבור טרנסקריפטום תא בודד כראוי.