השימוש בגז כרומטוגרפיה לנתח הלחנה שינויים של חומצות שומן ברקמות חולדה כבד במהלך הריון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הרכב חומצות השומן של הכבד. זה מושג על ידי שקילה תחילה של דגימת כבד והומוגניזציה שלה. השלב השני הוא לחלץ את כל השומנים מדגימת הכבד ההומוגנית.

לאחר מכן, מחלקות השומנים הבודדות כגון אסטרי כולסטרול מופרדות באמצעות מיצוי פאזה מוצקה. השלב האחרון הוא יצירה וגזירה של מחלקות השומנים לאסטרי מתיל של חומצות שומן. בסופו של דבר, כרומטוגרפיית גז משמשת כדי להראות כיצד הרכב חומצות השומן של רקמות יכול להשתנות בעקבות התערבות תזונתית או להיות מושפע משינויים במצב הפיזיולוגי כגון הריון.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הרכב חומצות השומן ברקמות, ניתן ליישם אותה גם על סוגי דגימות אחרים כגון שמן, זרעים ומזונות. בדרך כלל, משתמשים חדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות מכיוון שחלקים מסוימים של הפרוטוקול דורשים מיומנות ידנית וזקוקים לתרגול, כגון איסוף חוזר של שלבים עליונים ותחתונים. ידגימו את ההליך חנה, פיסק ואנט ווסט, טכנאית ודוקטורנטית מהמעבדה שלנו.

ראשית חותכים כ -100 מיליגרם כבד קפוא ושוקלים את הרקמה. מניחים את הטישו לתוך צינור פלסטיק בדלי קרח ומוסיפים 0.5 מיליליטר קר כקרח, 0.9% נתרן כלורי. לאחר מכן הומוגניזציה של הרקמה והעבירו לצינור מכוסה בורג זכוכית.

השתמש ב-0.3 מיליליטר נוספים של 0.9% נתרן כלורי כדי להעביר את כל הרקמה שנותרה לצינור הזכוכית המכוסה בבורג. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוגרם של כולסטרול הטה דשן סטנדרטי מומס בשניים לאחד, כלורופורם יבש למתנול לשפופרת, ואחריו חמישה מיליליטר נוספים של אותה תמיסת ממס המכילה 50 מיליגרם לליטר של בוטילאט הידרוקסי טולואן. לאחר הוספת מיליליטר אחד של נתרן כלורי מולארי אחד, מכסים את הצינור ומערבבים היטב את הדגימה על ידי מערבולת עד שהיא נראית אחידה.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב 1000 פעמים G למשך 10 דקות עם הפסקה נמוכה בטמפרטורת החדר. בסיום, אסוף את השלב התחתון באמצעות זכוכית מעבר לפיפטה שלה והעביר אותה לצינור זכוכית חדש עם מכסה בורג. לאחר מכן יבש את הדגימה מתחת לחנקן בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס.

בשלב זה, חבר את מיכל ה-SPE למשאבת ואקום והנח מחסנית SPE אמינו פרופיל סיליקה SPE על המיכל. הנח צינור זכוכית חדש עם מכסה בורג שכותרתו TAG ו-CCE במתלה המיכל מתחת לעמודה כדי לאסוף את השבר הראשון. ממיסים את תמצית השומנים הכוללת במיליליטר אחד של כלורופורם יבש ומערבבים את הדגימה על ידי מערבולת.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה לעמוד באמצעות פיפטת משחת זכוכית ואפשרו לנוזל לטפטף לתוך צינור מכסה הבורג תחת כוח הכבידה. כאשר הנוזל כבר לא מטפטף מהעמוד, הסר את הנוזל שנותר בוואקום. לאחר מכן, הסירו את שבר ה-TAG וה-CE על ידי שטיפת העמודה פעמיים עם מיליליטר אחד של כלורופורם יבש בוואקום.

כאשר כל הנוזל רמז מהעמודה, יבש את שבר ה-TAG וה-CE מתחת לחנקן ב-40 מעלות צלזיוס. הנח מחסנית SPE חדשה של אמינו פרופיל סיליקה על מיכל ה-SPE והנח צינור זכוכית עם מכסה בורג במגש המיכל מתחת למחסנית כדי לאסוף את הפסולת. שוטפים את העמוד במיליליטר אחד של הקסאן יבש שלוש פעמים בוואקום.

לאחר כיבוי הוואקום, יש לשטוף את העמוד במיליליטר אחרון של H hexane תחת כוח הכבידה. לאחר החלפת צינור הפסולת בצינור זכוכית חדש עם מכסה בורג המסומן ce, ממיסים את שבר ה-TAG וה-CE המיובש במיליליטר אחד של הקסאן יבש ומערבבים את הדגימה על ידי מערבולת. לאחר מכן העבירו את הדגימה לעמוד באמצעות מעבר זכוכית או פיפטה, ואפשרו לנוזל לטפטף דרך העמוד תחת כוח הכבידה.

כאשר הנוזל כבר לא מטפטף מהעמוד, הסר את הנוזל שנותר בוואקום בוואקום. שטפו את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של הקסאן יבש כדי לשטוף את ה-CE ולייבש את השבר שנאסף תחת חנקן ב-40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר טולואן יבש לשבר CE המופרד וערבב את הדגימה על ידי מערבולת.

הוסף מיליליטר אחד של מגיב מתילציה שהוכן בעבר לדגימה המומסת בטולואן יבש. לאחר מכן מכסים היטב את הצינור ומערבבים מחממים בעדינות את הדגימה למשך שעתיים בחום של 50 מעלות צלזיוס. לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת נטרול.

לאחר מכן, הוסף אחד של הקסאן יבש לדגימה לאחר מערבולת צנטריפוגה הדגימות ב -250 פעמים G למשך שתי דקות עם הפסקה נמוכה בטמפרטורת החדר. בסיום, אסוף את שלב התהילה העליון והעביר אותו לצינור זכוכית חד פעמי חדש ללא מכסה בורג. יבש את דגימת התהילה שנאספה מתחת לחנקן ב-40 מעלות צלזיוס.

לאחר הכנסת צינור פסולת למיכל SPE וג'ל סיליקה, מחסנית SPE על המיכל, שטפו את העמוד שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של הקסאן יבש תחת ואקום ומיליליטר אחד של הקסאן יבש תחת כוח הכבידה. לאחר פינוי הפסולת שוטף. הוסף צינור פסולת חדש למיכל, ולאחר מכן ממיס את דגימת התהילה CE במיליליטר אחד של הקסאן יבש.

לאחר ערבוב הדגימה על ידי מערבולת, העבירו אותה לעמוד באמצעות מעבר זכוכית או פיפטה. לאחר שהנוזל טפטף דרך העמוד תחת כוח הכבידה, שטפו את העמוד שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של הקסאן בוואקום. לאחר מכן, הסר את שטיפת הפסולת והנח צינור חדש ללא מכסה בורג שכותרתו CE fame למיכל.

מחק את שבר התהילה של CE עם שני מיליליטר אחד של 95 עד חמישה הקסאן יבש לאתר אתיל d. לאחר מכן יבש את השבר שנאסף תחת חנקן ב-40 מעלות צלזיוס, ממיס את השבר המיובש ב-75 מיקרוליטר הקסאן יבש, ומערבב את הדגימה על ידי מערבולת לאחר ערבוב הדגימה על ידי מערבולת. העבר אותו לבקבוקון דגימה אוטומטי של GC לאחר חזרה על השלב הקודם.

נתח את הדגימה בכרומטוגרף גז אם הפרוטוקול מבוצע בהצלחה. יש לקבל כרומטוגרמה עם פסגות סימטריות ברורות ומוגדרות היטב ועם רעשי רקע מינימליים כפי שמוצג כאן. אם התרחש זיהום, הכרומטוגרמה תציג פסגות נוספות ותציג פסגות לא סימטריות או מוטות כפי שמוצג כאן.

זיהום מכולסטרול חופשי יתרחש בעת ריצת תהילה שמקורה ב- CE אלא אם כן הכולסטרול מוסר. השימוש בתערובת כיול מוכנה מאפשר לזהות את התהילה במדגם. תערובת הכיול מופעלת באמצעות אותן הגדרות מכשיר כמו הדגימות, כך שניתן להשוות את הכרומטוגרמה לדגימה ולשיאים המזוהים על סמך זמני השמירה שלהם כפי שמוצג כאן.

שיא 16 האפס מודגש כאן כדי להמחיש את ההשוואה של זמני השמירה מתערובת הכיול בכרומטוגרמה העליונה לחומצות השומן. בעקבות הדגימה התחתונה, המאפשר תיוג נכון של אזור שיא חומצות השומן משמש לחישוב אחוז חומצות השומן הספציפיות בתוך הסך הכל. לאחר איסוף הנתונים, כדאי לבדוק אותם לאיתור חריגים כפי שמוצג כאן.

לאחר מכן ניתן לחקור דגימות חריגות ולחזור על המיצוי ו/או הניתוח במידת הצורך. כפי שמוצג כאן, תהילה בתוך CE כבד חולדה מתוארת כאחוז מסך חומצות השומן בתוך CE הכבד. נתונים אלה מתארים את חומצות השומן CE בכבד של חולדות בתוליות או בהריון שהוזנו במשך 20 יום באחת משלוש דיאטות שונות.

ניתוח סטטיסטי באמצעות שני גורמים Innova מגלה השפעות משמעותיות של תזונה והריון על השיעור של מספר חומצות שומן, כמו גם דיאטה משמעותית על ידי אינטראקציות הריון. לשם המחשה, תכולת החומצה האונית של CE בכבד בחולדות בהריון מושפעת יותר מתזונה מאשר זו של נקבות בתולות. טכניקה זו מאפשרת להשלים 20 דגימות ביום מההתחלה ועד הסוף אם היא מבוצעת כהלכה.

לאחר השליטה, אצווה של דגימות יכולה להגדיל את התפוקה ולהכפיל את הכמות המעובדת בשבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את הרכב חומצות השומן של מחלקות שומנים בודדות באמצעות מיצוי פאזה מוצקה וכרומטוגרפיה של גז. אל תשכח שעבודה עם ממיסים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסי אדים ולבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.