Name: Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: למדו הכנת דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית באמצעות אלומת יונים ממוקדת. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של חומרים רכים תוך מזעור פגמי הכנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה זכה לתמיכה מפרויקט QNano http://www.qnano-ri.eu שממומן על ידי תשתיות המחקר של הקהילה האירופית במסגרת תכנית FP7 נפחים (מענק מס &#39;אינפרא 2010-262,163). אנו מודים גם למועצת המחקר Formas לתמיכה כספית.

<ol><li>Echlin, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEchlin%2C+P+%22Low+Temperature+Microscopy+and+Analysis%22">Low Temperature Microscopy and Analysis</a>. , Plenum Press. New York. (1992).</li>
<li>Rubino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+focused-ion-beam+lift-out+method+for+cryo+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy.</a> J. Struct. Biol. 180, 572(2012).</li>
<li>Studer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285(2001).</li>
<li>Umrath, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooling+bath+for+rapid+freezing+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy.</a> J. Microsc. 101, 103(1974).</li>
<li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212, 34(2003).</li>
<li>Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElder%2C+H+%22Cryo+fixation.+Techniques+in+Immunocytochemistry%22">Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry</a>. , Academic Press. London. (1989).</li>
<li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiannuzzi%2C+LA+%22Introduction+to+Focused+Ion+Beams%22">Introduction to Focused Ion Beams</a>. , Springer. New York. (2005).</li>
<li>Marko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy.</a> Nat. Methods. 4, 215(2007).</li>
<li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+frozen-hydrated%2C+vitreous+lamellas+from+cells+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 172, 180(2010).</li>
<li>Rigort, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).</li>
<li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue%3A+electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> J. Struct. Biol. 153, 1(2006).</li>
<li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> J. Microsc. 131, 1(1983).</li>
<li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+improved+focused+ion+beam+milling+of+cryo-prepared+life+science+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens.</a> J. Microsc. 226, 263(2007).</li>
<li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73(2013).</li>
<li>Wätjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu+out-diffusion+in+kesterites%E2%80%94A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902(2013).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה הוא הסתגלות ולא פשוטה לקירור של הכנת מדגם FIB / TEM הסטנדרטי המשמשת במדעי חומר ב RT. השיטה מייצרת דגימות TEM ללא עיוות מכאנית וסימני סכין (החסרון העיקרי של microtomy), אם כי מסוך עלול להתרחש אם מדגם השטח הוא הומוגניות. זה יכול להיות מופחת על ידי cryo-תצהיר של שכבת מכסת (בעבודה זו Pt היה בשימוש), נרפאה עד שהוא חלק וייחוד 13. ניתן להכין דוגמאות עם רכיבים של קשיות שונות מאוד, כמו גם ללא הסיכון שהם יישברו תחת לחץ במהלך הכנה. לחצים פנימיים עדיין עשויים לגרום lamella הדק לכופף או תלתל, ובמקרה זה בגודל של הסעיף צריך להיות מופחת. חסרון בהשוואה לשיטה אחרת הוא האפשרות לשנות את המבנה הביולוגי עקב חשיפה לאלומת היונים והשתלה אפשרית של היונים במדגם. חסרונות אלה להתרחש גם ב RT עבור prepar המדגםation במדע חומרים 15. הם יכולים להיות מופחתים על ידי מילוי הדליל בצעד ליטוש סופי במתח המאיץ הנמוך ביותר ליונים (500-1,000 V). צעד ליטוש עדין מאוד זה יהיה להסיר את השכבה הפגועה מlamella. בשל אופייה של cryo-בתצהיר (שלבים 3.5, 3.10 ו3.13), חלקים גדולים של המדגם יהיו מכוסים, ובכך חוסמים את הנוף של פני השטח המקוריים. זה עשוי להקשות כדי לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה, אלא אם כן סימונים מרובים נמצאים בשימוש כפי שהוצעו בשלב 3.3. במהלך שלבים 4.5 ו4.7 סיכוני lamella דקים שבאו במגע עם אוויר. זו יש להימנע כפי שהוא עלול לגרום ללחות באוויר בצורת גבישי קרח על פני השטח של המדגם, אולי עד כדי טשטוש תכונות חשובות. עליך לבצע פעולות אלה מהר ככל האפשר, אבל באותו הזמן טיפולו הכושל במהלך ההעברה עלול לגרום לאובדן של המדגם זהעצמי. מומלץ שהמשתמש נוקט צעדים אלה באמצעות רשתות TEM ריקות לפני ניסיון על מדגם אמיתי הוא עשה. במדעי חומר, מכשיר FIB הפך את השיטה הראשית של הכנת מדגם TEM בתוך עשור של המסחור שלה. שכן הוא יכול לשמש כמעט על כל דגימה, הוא מסיר את הצורך להתאים את טכניקת ההכנה לסוג של מדגם. אנו מאמינים באותו יכול לקרות בקירור, הודות להליך המפורט כאן. היישום שלה לדגימות גדולות יותר הוא עדיין כפוף ליכולת Cryo-לשמר אותם במצב מזוגג, אבל טכניקות כגון צניחה-הקפאה או בלחץ גבוה הקפאת 3,5 יכולות להוכיח להיות הפתרון האופטימלי לבעיה זו.

בפרוטוקול זה cryo-FIB/SEM משמש להפקת דגימות TEM מאזור מסוים של המדגם, זוהה בעבר עם דיוק גבוה על ידי ניתוח SEM. ניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים (סריקה או העברת) של דגימות ביולוגיות הוא טכניקה שגרתית המשמשת למחקר ואבחון. SEM הוא די מהיר וקל להעסיק ולפרש, אבל מידע מתקבל רק ממדגם השטח ועם רזולוציה בטווח 1.5 ננומטר. יש TEM ברזולוציה גבוהה יותר, אך קשה יותר ליישום, ניתוח התמונה הוא פחות ישיר ואילו מידע בתפוצה רחבה מתקבל, דגימות צריכה להיות דלילה אלקטרוני שקיפות (פחות מ כ -500 עבה ננומטר). בעיה נוספת היא שדרישות הוואקום של אותם מכשירים נסבלות לעתים רחוקות על ידי דגימות המכילים מים. ברוב המקרים, דגימות ביולוגיות צריכים להיות קבועות או כימי (החלפת מים עם, למשל, פולימרים) או מיובש. בשני המקרים, שינויים משמעותייםמורפולוגיה ומבנה של הדגימה צפויה להופיע. הכנת Cryo TEM של דגימות התייבשות גורמת לשינויים כימיים מינימאליים והיא מייצרת דגימות קרובה ככל האפשר למצב הטבעי שלהם, במיוחד אם vitrification קרח מתקבלת 1-6. FIB נעשה שימוש נרחב להכנת דגימות TEM ליתרונות הרבים שלה 7. עד כמה שם: השימוש ביונים עתירה אנרגיה בשכיחות כמעט נורמלית ממזער את השפעת השינויים בשערי כרסום ההפרש הקשורים לחומר; ניתן לבחור את האזור שחולץ מן המדגם בתפזורת עם דיוק תת מיקרון; כמות קטנה מאוד של חומר מופק. כמה התפתחויות טכניות האחרונות התאפשרו באמצעות FIB גם להכנת מדגם TEM בקירור 2,8-10. ישנם מספר יתרונות על פני שיטת ההכנה המסורתית של cryo-microtomy 11,12 משמש בעיקר לדגימות חומר רך, כגון חוסר העיוות מכאנית של lamella הפרוס,העדר סימני סכין והאפשרות להכנת דגימות מורכבות עם ממשקים קשים / רכים או רכיבים.

<table><tbody><tr><td>Strata DB 235</td><td>FEI</td><td></td><td>FIB/SEM</td></tr><tr><td>Omniprobe 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Nanomanipulator</td></tr><tr><td>Alto 2500</td><td>Gatan</td><td></td><td>Cryo תא הכנה</td></tr><tr><td>מחזיק קריו דגם 626</td><td>Gatan</td><td></td><td>Cryo העברת TEM מחזיק TEM</td></tr><tr><td>Tecnai F30</td><td>FEI</td><td></td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשמש להכנת דגימות cryo-TEM של נבגי ניז&#39;ר ​​אספרגילוס, אך אשר יכולים בקלות להיות מותאם עבור כל מספר של מיקרואורגניזמים או פתרונות. אנו עושים שימוש בתחנת cryo-העברה בנויה מותאם אישית וחדר הכנת cryo-SEM שונה 2. נבגי לקוחים מתרבות, לצלול, קפוא בחנקן נוזלי רפש ונצפו בcryo-SEM כדי לבחור אזור של עניין. Lamella דקה לאחר מכן הופקה באמצעות FIB, מחובר לרשת TEM ולאחר מכן דליל אלקטרוני שקיפות. הרשת מועברת לבעל cryo-TEM ולTEM ללימודים ברזולוציה גבוהה. בזכות כניסתה של טיפ nanomanipulator מקורר ותחנת cryo-העברה, פרוטוקול זה הוא עיבוד ישיר לטמפרטורת קירור של הכנת FIB בשימוש שגרתית של דגימות TEM. ככזה יש לו את היתרונות של צורך בכמות קטנה של שינויים במכשירים, הגדרות ונהלים קיימים; אני זהזה קל ליישום; יש לו מגוון רחב של יישומים, באופן עקרוני זהה להכנת מדגם cryo-TEM. מגבלה אחת היא שזה דורש טיפול מיומן של הדגימות בשלבים קריטיים, כדי למנוע או למזער את זיהומים.

בעבודה זו עשינו שימוש ב: הקורה כפול FIB / SEM מצויד בnanomanipulator וקאמרי cryo-הכנה; TEM עם בעל cryo-העברה; תחנת cryo-העברת אב טיפוס. Anticontaminator (AC) להבים של חדר cryo-ההכנה וקצה nanomanipulator (NM) שונו על ידי Gatan. עם כל כבוד לקאמרי cryo-הכנה סטנדרטית, להבי AC גדולים יותר כדי לספק גוף קירור גדול יותר לקצה NM. יתר על כן, AC מצויד במהדק לחיבור צמות Cu להחלפת חום עם קצה NM. הפנאומטיקה של FIB / SEM שונו כדי לאפשר NM להיות ולהישאר גם כאשר הוכנסה לתא המדגם פרקה. יש לציין כי הפרמטרים המשמשים בעבודה זו מתאימים ביותר לציוד המפורט לעיל; פרמטרים אלה עלולים צריכים להיות מותאמים בעבודה עם סוגים אחרים של ציוד. כדי לעבוד עם פרוטוקול זה, אמצעי הזהירות הרגילה לטיפול בנושא הקפאה, מערכות חנקן וואקום נוזל צריכהלהיות אחריו. השיטה נבדקה על סוגים שונים של דגימות עם תוצאות טובות, החל מפתרונות או מטריצות פולימר המכילות חלקיקים, לאורגניזם חד תאי לנמטודות. דוגמאות לשלבים השונים של ההליך באים לידי ביטוי בדמויות 1-12 בא נבגי ניז&#39;ר ​​מוכתמים בtetroxide אוסמיום וpermanganate אשלגן. הנבגים הם צילמו לראשונה על ידי SEM (איור 1) לזהות את האתר להפקה. במקרה זה, חתך של כל נבג היה מספיק, אבל זה אפשרי למקם את ההחזר על ההשקעה עבור חילוץ עם דיוק תת מיקרומטר, למשל, פורס תא מסוים במרחק מסוים מקרום התא. ברגע שהתכונה של עניין זוהתה, הצעד הראשון של תצהיר cryo-Pt מיושם (איור 2), כדי להגן על המדגם מנזק קורה מכרסום יון. המדגם מוטה ל52 ° להמשיך עם o הצעדים הראשוניםו הטחינה (איור 3): המקרטעת של שתי תעלות משני צידי lamella. המדגם מוטה לאחור ולאחר מכן עוד הסתובב לעזוב רק שני גשרים קטנים המחברים אותו לתפוצה הרחבה (איור 4). Nanomanipulator מקורר הוא הביא במגע עם אמילה (איור 5) ועוד cryo-תצהיר של Pt חיילים אותם יחד (איור 6). אז גשרי חיבור הקטנים הם הסתובבו שם וNM נע lamella בסמוך לאזור החיבור של רשת TEM (איור 7), שבו הוא מולחם עם cryo-תצהיר סופי של Pt (איור 8). NM מכן הופרד מlamella (איור 9), שהוא דלל את אלקטרוני שקיפות עם אלומת היונים (איור 10 ו11). Lamella לבסוף הועברה לTEM (איור 12) שבו הדמיה ברזולוציה גבוהה, ספקטרוסקופיה, טומוגרפיה וטכניקות אחרות can להיות מועסק. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> איור 1. תמונת Cryo-SEM של נבגים של א &#39; ניז&#39;ר, לפני תצהיר Pt. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> איור 2. אותו האזור באיור 1 לאחר בתצהיר Pt אבל לפני הריפוי. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> איור 3. תמונת Cryo-SEM של אותו האזור באיור 2, מוטה 52 º, לאחר בתצהיר Pt וריפוי, עם טחינת תעלה לדרך(ראה שלב 3.7). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> איור 4. Lamella, מוכנה לעילוי-out. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> איור 5. קצה nanomanipulator הקר יוצר קשר עם lamella. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> איור 6. Cryo-תצהיר Pt שני משמש לרתך יחד nanomanipulator וlamella. <i<html> גובה מ&quot;ג = &quot;איור 7&quot; עבור: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; src איור 7. Nanomanipulator הקר משמש להעברת lamella לאזור החיבור של רשת TEM. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> איור 8. קריו בתצהיר משמש פעם נוספת לצרף lamella לרשת TEM. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> איור 9. Lamella נחתך ללא nanomanipulator והוא מוכן כעת לאו אחסון או דילול אלקטרוני שקיפות. = &quot;תמיד&quot;&gt; בתוך עמודים <img alt="איור 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> איור 10. שלב ביניים של הדילול, עם כמה נבגים נראים בחתך. <img alt="איור 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> איור 11 תמונת Cryo-SEM של המדגם לאחר דילול סופי.; רוב הנבגים האחרים היה צריכים להיות הסתובבו משם כי lamella התחילה להתנפח. <img alt="איור 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> איור 12. תמונת cryo-TEM מורכב של lamella. חלק מבדל אל נכללבlamella (החץ שחור).

Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להכין דגימה עבור cryo TEM על ידי הוצאת lamella באמצעות קרן יונים ממוקדת (focused ion beam) מדגימה גושית שהוקפאה בקריוגניקה. דבר זה מושג תחילה על ידי הקפאת טבילה (plunge freezing) של הדגימה בחנקן נוזלי והרכבתה בתוך ה-cryo focused ion beam SEM. השלב השני הוא חיתוך lamella דקה באמצעות קרן היונים והעברתה אל גריד של TEM באמצעות ננו-מניפולטור מקורר.בשלב הבא, רשת ה-TEM מועברת ממחזיק ה-SEM למחזיק ה-TEM בתחנת העברה. השלב הסופי הוא העברת מחזיק ה-TEM למכשיר ה-cryo TEM לצורך ניתוח נוסף. לבסוף, ה-cryo TEM משמש להצגת תמונות ברזולוציה גבוהה, טומוגרמות או מפות קרני X של הלמללה שהוצאה.טכניקה זו תאפשר לנו לנתח חומר רך ברזולוציה מקסימלית במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) על ידי בחירה מוקדמת של נקודת הניתוח באמצעות מיקרוסקופיות אחרות, כגון מיקרוסקופיה של אור או מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון Mac cryo Microtomy, הוא מניעת ארטיפקטים של הכנה, דוגמת דחיסה ועיוות של הדגימה. ראשית, התקינו שתי רשתות TEM עבור דגימות של קרן יונים ממוקדת (FIB).בתושבת ההעברה של ה-SEM, הדק את הרשתות על ידי הידוק הברגים המתאימים באמצעות מברג וסגור את התריסים; התקן בדגמי דגימה (stub) המתאימים לדגימה והוסף חלק מהדגימה. לדוגמה, השתמש בפיפטה כדי להניח טיפות על stub שטוח. לאחר מכן, התקן את תושבת ההעברה של ה-SEM על מכשיר ההעברה בוואקום או ה-VTD.לאחר הוספת חנקן נוזלי לתחנת הריסוס (slushing station) וביצוע שאיבת ואקום (pumping down), פתח את התחנה ובצע הקפאה מהירה (plunge freeze) של מחזיק ההעברה ל-SEM. שאב שוב את הוואקום עד להשלמת הרתיחה והשגת הריסוס (slush) מחדש. לאחר מכן, החזר את מחזיק ההעברה ל-SEM אל תוך תא הוואקום של ה-VTD ואטום אותו. פתח את הוואקום (vent) של תחנת הריסוס ושל תא ההכנה הקריוגנית, ואוורר את מנעול האוויר (airlock) החיצוני.לאחר מכן, התאימו את אטם ה-VTD עם מנעול האוויר של תא הכנת הקריו והמשאבה. כאשר תושג רמת ואקום טובה, השתמשו בפין מנעול האוויר כדי לפתוח את האטם של ה-VTD ואת מנעול האוויר החיצוני. לאחר מכן, הכניסו את מחזיק ההעברה של ה-SEM.לאחר מכן, השתמשו בסכין קרה כדי לפתוח את המכסים המגנים של חריצי רשת ה-TEM. כבו את המתח הגבוה ב-SEM עם קרן יונים ממוקדת ופתחו את תא האטימה הפנימי. לאחר מכן, השתמשו ב-VTD כדי להעביר את מחזיק ה-SEM אל תא הדגימות.לאחר שהמחזיק של ה-SEM נמצא בשלב הקירור, שחרר את ה-VTD על ידי לחיצה וסיבוב. החזר את מוט ה-VTD עד הסוף לתוך תא הוואקום של ה-VTD וסגור את תא השחילה הפנימי, את תא השחילה החיצוני ואת אטם ה-VTD. בשלב זה, חמם את גז הפרוקורסורה ל-24 עד 26 degrees Celsius ומקם את מערכת הזרקת הגז או את מחט ה-GIS בגובה של כמילימטר אחד מעל פני הדגימה.בזמן ההדמיה באמצעות קרן האלקטרונים, פתחו את שסתום הגז למשך מספר שניות. לאחר מכן, בצעו הקשיה של השכבה שהטרסבה מעל אזור העניין, או ה-ROI, באמצעות קרן יונים של 1000 pico ampire בהגדלה נמוכה. לאחר ההקשיה, הטו את הדגימה ל-52 מעלות כך שהמשטח יהיה ניצב לקרן היונים.בצעו כרסום. שתי תעלות טרוריסט. משני צידי ה-ROI, הטו את הדגימה חזרה לאפס מעלות והשתמשו בקרן היונים כדי לחתוך את הצדדים ואת החלק התחתון של הלמלה, תוך וידוא שסימני החיתוך עוברים דרך הלמלה כולה.לאחר השחלת מחט ה-GIS, תמרנו את הננו-מניפולטור עד שקצהו יהיה במגע פיזי עם הלמלה, רצוי בצדה. פתחו את שסתום ה-GIS למשך מספר שניות ועקבו אחר השקיעה הקריוגנית באמצעות דימות רציף עם קרן האלקטרונים. כאשר שוקעה שכבת פלטינה נוספת בעובי של 1 עד 2 מיקרומטר, סגרו את השסתום; לאחר מכן, בצעו ריפוי (cure) לפלטינה רק במספר המיקרומטרים שסביב נקודת המגע של הננו-מניפולטור עם הלמלה.לאחר מכן, השתמשו בזרם גבוה של קרן יונים כדי לחתוך ולהשחרר את הלמלה. תמנו את הננו-מניפולטור בזהירות כדי להוציא את הלמלה מהתעלות ולהעבירה למרחק של לפחות 500 micrometers מעל פני הדגימה. לאחר נסיגת המחט, הנמיכו את במה של הדגימה בכמה מילימטרים והזיזו אותה עד שמי אחת מרשתות ה-TEM תהיה בטווח הראייה.העבירו את אזור ההצמדה על הגריד למצב עבודה והחדירו את מחט ה-GIS. לאחר מכן, תמנו זוירות בזהירות את הננו-מניפולטור כדי להביא את הלמלה המוצמדת למגע פיזי עם אזור ההצמדה בגריד ה-TEM, פתחו את שסתום הגז למשך מספר שניות ובצעו השקעה קריוגנית (cryo deposit) של שכבת פלטינה נוספת בעובי של 1-2 µm; בצעו ריפוי (cure) לפלטינה רק ברדיוס של מספר µm מסביב לנקודת המגע בין הלמלה לגריד ה-TEM. לאחר מכן, השתמשו בזרם גבוה של קרן יונים כדי להפריד את הלמלה מהננו-מניפולטור.הטו את הדגימה ל-52 מעלות והשתמש בקרן הייונים כדי לדקק אותה עד לשקיפות אלקטרונית. לאחר שטיפת תחנת ההעברה הקריוגנית בגז חנקן יבש, הכנס את מחזיק ה-TEM להעברה קריוגנית לחריץ המתאים בתחנת ההעברה הקריוגנית ומלא בחנקן נוזלי. לאחר מכן, טבול מברג, את כלי קיבוע הדגימות של ה-TEM ופינצטה בכוס קריוגנית מלאה בחנקן נוזלי כדי לקרר את קצותיהם לטמפרטורה הרצויה.לאחר התאמת ה-VTD לסניל האוויר החיצוני, העלה את הבמה הקרה לגובה העברה של 16 millimeters. לאחר כיבוי המתח הגבוה, פתח את אטם ה-VTD, את סניל האוויר החיצוני ואת סניל האוויר הפנימי. לאחר מכן, השתמש במוט ה-VTD כדי להינעל למחזיק ההעברה של ה-SEM על ידי לחיצה וסיבוב עם כיוון השעון.בשלב זה, החזירו את מחזיק ההעברה של ה-SEM אל תוך תא ההכנה הקריוגני. השתמשו בסכין הקרה כדי לסגור את המכסים המגנים של רשמי ה-TEM. לאחר מכן, השתמשו במוט ה-VTD כדי להעביר את הדגימה אל תוך תא הוואקום של ה-VTD, סגרו ואטמו את סניף האוויר.לאחר מכן, שחררו את האוויר מתא האטימה החיצוני ונתקו את ה-VTD. התאימו את ה-VTD לפתח ה-SEM של תחנת ההעברה הקריוגנית. תוך כדי שטיפה בחנקן יבש, השתמשו בפין שבתחנה כדי לפתוח את האטם של ה-VTD והחליקו את תומך ההעברה של ה-SEM לתוך הדלת של תחנת ההעברה הקריוגנית.באמצעות מברג מקורר, פתח את אחד המכסים ושחרר את הבורג המתאים, תוך שמירה על רשת ה-TEM במקומה. לאחר מכן, הרם את רשת ה-TEM והנח אותה בתוך מחזיק ה-TEM בעזרת פינצטה מקוררת. לאחר פעולה זו, הדק את רשת ה-TEM למחזיק ה-TEM.באמצעות טבעת המשושה המקוררת, סגרו את התריס של מחזיק ה-TEM להעברה בקריו ונתקו את תחנת ההעברה בקריו ממערכת השאיבה. העבירו את התחנה ואת בקר החימום של מחזיק ה-TEM לסמיכות ל-TEM וחברו אותם מחדש. הגדירו את במה של דגימת ה-TEM להטיה של 70 מעלות מינוס.בשלב הבא, הגדירו את זמן השאיבה הקצר ביותר עבור תא השחור (airlock) עם מחזור אחד בלבד של פירגינג (purging) בגז חנקן יבש. הוציאו את מחזיק ה-TEM מתחנת ההעברה הקריוגנית והכניסו אותו לשלב הראשון של הגוניומטר המוטה, פעולה שתתחיל את מחזור השאיבה. עם השלמת המחזור, הגדירו לגוניומטר לחזור לזווית של אפס מעלות תוך כדי החזקת מחזיק ה-TEM, כדי למנוע ממנו להסתובב יחד עם הגוניומטר.לאחר מכן, הכנס את התומך דרך הגוניומטר עד למיקומו המלא בתוך ה-TEM. לבסוף, מלא שוב את פיית התומך של ה-cryo transfer TEM בחנקן נוזלי. בשיטה זו, נבצע תחילה דימות של נבגי *Aspergillus niger* באמצעות SEM כדי לזהות את אתר המיצוי.חתך רוחבי של כל נבג הוא מספיק, אך ניתן למקם את ה-ROI לצורך מיצוי בדיוק סוב-מיקרומטרי כדי לחתוך תא ספציפי במרחק מסוים מממברנת התא. לאחר זיהוי המאפיין המבוקש, מיושם השלב הראשון של השקיעה בקירור. כדי להגן על הדגימה מפני נזקי קרן במהלך שיוף יוני, הדגימה מוטה ל-52 מעלות, ולאחריה ביצוע sputtering של שני תעלות משני צדי ה-lamella. לאחר מכן, הדגימה מוטה חזרה ונשייפת עוד יותר, כך שנותרים רק שני גשרים קטנים המחברים אותה לגוף הדגימה.הננו-מניפולטור המקורר מובא למגע עם הלמלה, והשקעה קריוגנית נוספת של פלטינום מהדבקתם יחדיו. גשרי החיבור הקטנים נסרות, והננו-מניפולטור מסיט את הלמלה אל אזור החיבור בדרגת TEM, שם היא מהודבקת באמצעות השקעה קריוגנית סופית של פלטינום. לאחר מכן מופרד הננו-מניפולטור מהלמלה, אשר נדחפת עד להגעה לשקיפות אלקטרונית.באמצעות קרן הייונים, הלמלה מועברת ל-TEM, שם ניתן להשתמש בטכניקות של ספקטרוסקופיה בדימוי ברזולוציה גבוהה, טומוגרפיה ושיטות נוספות. שיטה זו תתרום להבנת ממשקי חומר רך בלב במערכות כגון גששים עצביים או שתלים בעצם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הכנת דגימות cryo TEM נטולות ארטיפקטים, שניתן להוציא מאזור ספציפי בדגימת ביולוגית בדיוק סוב-מיקרומטרי.

cryo-electron-microscopy-specimen-preparation-means-focused-ion

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

טכניקות קרן יונים ממוקדת קריוגנית (FIB) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM) יכולות לספק תובנות מפתח לגבי הכימיה והמורפולוגיה של ממשקים מוצקים-נוזליים שלמים. שיטות להכנת מפות ספקטרוסקופיות באיכות גבוהה של פיזור אנרגיה (EDX) של ממשקים כאלה מפורטות, תוך התמקדות בהתקני אגירת אנרגיה.

אפיון בקנה מידה ננומטרי של ממשקים נוזליים-מוצקים על ידי צימוד כרסום קרן יונים ממוקד קריו עם מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת וספקטרוסקופיה

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

למדו הכנת דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית באמצעות אלומת יונים ממוקדת. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של חומרים רכים תוך מזעור פגמי הכנה.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

גלה סרטונים נוספים