Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת
26 ביולי 2014
Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין דגימה ל-cryo TEM על ידי חילוץ למלה קרן יונים ממוקדת מדגימה בתפזורת קפואה קריוגנית. זה מושג על ידי צלילה ראשונה, הקפאת הדגימה בחנקן נוזלי והרכבתה בתוך קרן היונים הממוקדת קריו SEM. השלב השני הוא לחתוך LA Melo דק עם קרן היונים ולהעביר אותו לרשת TEM באמצעות מניפולטור ננו מקורר.
לאחר מכן, רשת ה-TEM מועברת ממחזיק ה-SEM למחזיק ה-TEM בתחנת העברה. השלב האחרון הוא העברת מחזיק ה-TEM ל-cryo TEM להמשך ניתוח. בסופו של דבר, ה-cryo TEM משמש להצגת תמונות ברזולוציה גבוהה, טומו גרהם או מפות רנטגן של הלמלה שחולצה.
טכניקה זו תאפשר לנו לנתח חומר רך ברזולוציה אולטימטיבית במיקרוסקופ אלקטרוני ההולכה על ידי בחירה מראש של מקום הניתוח על ידי מיקרוסקופיות אחרות כגון מיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ אלקטרו סורק. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו Mac cryo Microtomy, הוא שנמנעים מחפצי הכנה כגון דחיסה והיווצרות def של הדגימה. ראשית הרכיב שתי רשתות TEM עבור דגימות קרן יונים ממוקדות.
על מחזיק ההעברה של SEM, אבטח את הרשתות על ידי הידוק הברגים המתאימים בעזרת מברג וסגור את התריסים, הרכיב בדל דגימה המתאים לדגימה והוסף חלק מהדגימה. לדוגמה, השתמש בפיפטה כדי להניח טיפות על בדל שטוח. לאחר מכן התקן את מחזיק העברת ה-SEM על התקן העברת הוואקום או VTD.
לאחר הוספת חנקן נוזלי לתחנת הרפש ושאיבה מטה, פתח את התחנה וצלול להקפיא שוב את משאבת מחזיק ההעברה של SEM כלפי מטה עד להשלמת הרתיחה והרפש מתקבל שוב. לאחר מכן, החזר את מחזיק העברת ה- SEM לתא הוואקום של ה- VTD ואטום אותו. אוורור את תחנת הרפש ואת תא הכנת הקריו Airlock אוורור את נעילת האוויר החיצונית.
לאחר מכן התאם את אטם ה-VTD למנעול האוויר של תא הכנת הקריו והמשאבה. כאשר מגיעים לרמת ואקום טובה, מדוד את סיכת נעילת האוויר כדי לפתוח את האיטום של ה-VTD ואת נעילת האוויר החיצונית. לאחר מכן הכנס את מחזיק ההעברה של SEM.
לאחר מכן, השתמש בסכין קרה כדי לפתוח את מכסי המגן של חריצי רשת TEM. כבה את המתח הגבוה בקרן היונים הממוקדת SEM ופתח את נעילת האוויר הפנימית. לאחר מכן השתמש ב-VTD כדי להעביר את מחזיק ה-SEM לתא הדגימה.
ברגע שמחזיק ה-SEM נמצא בשלב הקר, נתק את ה-VTD על ידי דחיפה וסיבוב. החזר את מוט ה-VTD עד הסוף לתוך תא הוואקום VTD וסגור את נעילת האוויר הפנימית, נעילת האוויר החיצונית ואטם ה-VTD. בשלב זה, מחממים את גז המבשר ל-24 עד 26 מעלות צלזיוס ומקמו את מערכת הזרקת הגז או מחט ה-GIS לגובה של כמילימטר אחד מעל פני הדגימה.
תוך כדי הדמיה עם קרן האלקטרונים, פתח את שסתום הגז למספר שניות. לאחר מכן רפא את המשקע מעל אזור העניין, או ROI באמצעות קרן יונים של 1000 פיקו אמפיר בהגדלה נמוכה. לאחר הריפוי, הטה את הדגימה ל-52 מעלות כך שהמשטח יהיה בניצב לקרן היונים.
טחנה משם. שתי תעלות טרור. משני צידי ה-ROI הטה את הדגימה לאחור לאפס מעלות והשתמש בקרן היונים כדי לחתוך את הצדדים ואת הצד התחתון של הלמלה, וודא שסימני החיתוך עוברים דרך כל הלמלה.
לאחר החדרת מחט ה-GIS, תמרן את מניפולטור הננו עד שקצהו נמצא במגע פיזי עם הלמלה, רצוי בצד. פתח את שסתום ה-GIS למשך מספר שניות ועקוב אחר שקיעת הקריו על ידי הדמיה רציפה עם קרן האלקטרונים. כאשר שכבה נוספת של מיקרומטר עד שניים של פלטינה הופקדה בקריו, סגור את השסתום לאחר ריפוי זה של הפלטינה רק במיקרומטרים ספורים סביב הנקודה שבה מניפולטור הננו נמצא במגע עם הלמלה.
לאחר מכן השתמש בזרם קרן יונים גבוה כדי לחתוך את הלמלה ללא תשלום. תמרן בזהירות את מניפולטור הננו כדי לחלץ את הלמלה מהתעלות ולהזיז אותה לפחות 500 מיקרומטר מעל פני הדגימה. לאחר החזרת המחט, הורד את שלב הדגימה בכמה מילימטרים והזיז אותו עד שאחת מרשתות ה-TEM נראית לעין.
העבר את אזור ההצמדה ברשת למצב העבודה והכנס את מחט ה-GIS. לאחר מכן, תמרן בזהירות את מניפולטור הננו כדי להביא את הלמלה המחוברת למגע פיזי עם אזור החיבור ברשת TEM, פתח את שסתום הגז למספר שניות והפקיד בקריו שכבה נוספת של מיקרומטר עד שניים של פלטינה לרפא את הפלטינה רק בכמה מיקרומטרים סביב נקודת המגע בין הלמלה לרשת TEM. לאחר מכן השתמש בזרם קרן יונים גבוה כדי לנתק את הלמלה מהמניפולטור הננו.
הטה את הדגימה ל-52 מעלות והשתמש בקרן היונים כדי לדלל אותה לשקיפות אלקטרונים. לאחר שטיפת תחנת העברת הקריו בגז חנקן יבש, הכנס את מחזיק ה-TEM להעברת הקריו בחריץ המתאים של תחנת העברת הקריו ומלא בחנקן נוזלי. לאחר מכן טבלו מברג, כלי הידוק הדגימה של TEM ופינצטה בכוס קריוגנית מלאה בחנקן נוזלי על מנת לקרר את קצותיהם לטמפרטורה הרצויה.
לאחר התאמת ה-VTD לנעילת האוויר החיצונית, הביאו את ה-Cold stage לגובה העברה של 16 מילימטרים. לאחר כיבוי המתח הגבוה, פתח את אטם ה-VTD, נעילת האוויר החיצונית ומנעול האוויר הפנימי. לאחר מכן השתמש במוט VTD כדי לנעול את מחזיק ההעברה SEM על ידי דחיפה וסיבוב עם כיוון השעון.
בשלב זה, החזר את מחזיק העברת ה-SEM לתא הכנת הקריאו. השתמש בסכין הקרה כדי לסגור את מכסי המגן של רשתות TEM. לאחר מכן השתמש במוט ה-VTD כדי להעביר את הדגימה לתא הוואקום של ה-VTD סגור ולאטום את נעילת האוויר.
לאחר מכן אוורור את נעילת האוויר החיצונית ונתק את ה-VTD. התאם את ה-VTD ליציאת ה-SEM של תחנת העברת הקריאו. בזמן שטיפה בחנקן יבש, השתמש בסיכה בתחנה כדי לפתוח את אטם ה-VTD ולהחליק את מחזיק העברת ה-SEM לתוך העושה של תחנת העברת הקריו.
בעזרת המברג שהתקרר, פתח את אחד המכסים ושחרר את הבורג המתאים, תוך שמירה על רשת ה-TEM במקומה. לאחר מכן הרם את רשת ה-TEM והנח אותה במחזיק ה-TEM באמצעות הפינצטה המקוררת. לאחר מכן, הדק את רשת ה-TEM על מחזיק ה-TEM.
בעזרת טבעת המשושה המקוררת, סגור את התריס של מחזיק ה-TEM להעברת קריו ונתק את תחנת העברת הקריו ממערכת השאיבה. העבר את התחנה ואת בקר החימום של מחזיק ה-TEM ליד ה-TEM וחבר אותם מחדש. הגדר את דגימת ה-TEM stage להטיה שלילית של 70 מעלות.
לאחר מכן, הגדר את זמן השאיבה הקצר ביותר עבור נעילת האוויר עם מחזור אחד בלבד של טיהור עם גז חנקן יבש. הסר את מחזיק ה-TEM מתחנת העברת הקריו והכנס אותו לשלב הראשון של הגוניומטר המוטה, שיתחיל את מחזור השאיבה. לאחר השלמת המחזור, הגדר את הגוניומטר להטות בחזרה לאפס מעלות תוך החזקת מחזיק ה-TEM כך שהוא לא יסתובב עם הגוניומטר.
לאחר מכן הכנס את המחזיק דרך הגוניומטר במלואו בתוך ה-TEM. לבסוף מלאו מחדש את מחזיק ה-TEM להעברת קריו בחנקן נוזלי. בשיטה זו, נבגי אספרגילוס ניז'ר מצולמים לראשונה על ידי SEM כדי לזהות את אתר המיצוי.
חתך רוחב של כל נבג מספיק, אך ניתן למקם את ההחזר על ההשקעה למיצוי בדיוק תת-מיקרומטרי כדי לפרוס תא ספציפי במרחק מסוים מקרום התא. לאחר זיהוי המאפיין המעניין, מיושם השלב הראשון של תצהיר הקריו כדי להגן על הדגימה מפני נזקי קרן במהלך כרסום יונים, הדגימה מוטה ל-52 מעלות, ואחריה התזה של שתי תעלות משני צידי המלה. לאחר מכן הדגימה מוטה לאחור וטוחנת עוד יותר, ומשאירה רק שני גשרים קטנים המחברים אותה לתפזורת.
מניפולטור הננו המקורר בא במגע עם המלה ותצהיר קריו נוסף של פלטינה מלחם אותם יחד. הגשרים המחברים הקטנים נטחנים, והמניפולטור הננו מזיז את הלמלה ליד אזור ההצמדה בדרגת TEM, שם הוא מולחם בתצהיר קריו סופי של פלטינה. לאחר מכן מפרידים את מניפולטור הננו מהלמלה, שהיא דקה עד לשקיפות אלקטרונים.
עם קרן היונים, הלמלה מועברת ל-TEM שם ניתן להשתמש בספקטרוסקופיה של הדמיה ברזולוציה גבוהה, טומוגרפיה וטכניקות אחרות. שיטה זו תתרום להבנת ממשקי החומר הרך של הלב במערכות כגון בדיקות עצביות או שתלי עצם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות קריו TM שהן חפץ שלישי, ושניתן לחלץ אותן מאזור ספציפי של דגימת באג בדיוק תת-מיקרומטר.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול להכנת דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים במבנה מעבר בהקפאה (cryo-TEM) באמצעות טכניקות של קרן יונים ממוקדת (FIB). שיטה זו מאפשרת דימוי ברזולוציה גבוהה של חומר רך תוך מזעור ארטיפקטים הנובעים מהכנת הדגימה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- דימוי ביולוגי
- מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית
רקע
- מיקרוסקופי אלקטרונים קריוגניים חיוניים לניתוח דגימות ביולוגיות.
- טכניקות של אלומת יונים ממוקדת (Focused Ion Beam) משפרות את הכנת הדגימה עבור cryo-TEM.
- צמצום ארטיפקטים הוא קריטי להשגת דימויים מדויקים.
- שיטה זו מאפשרת בחירה מוקדמת של אתרי הניתוח באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אחרות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה להכנת דגימות עבור cryo-TEM.
- השגת דימות ברזולוציה גבוהה של חומרים ביולוגיים רכים.
- מניעת ארטיפקטים של הכנה שעלולים להביא לעיוות התוצאות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקפאה מהירה (Plunge freezing) של דגימות בחנקן נוזלי.
- שימוש בקרן יונים ממוקדת (FIB) להוצאת למיnelles דקות.
- העברה של הלמיnelles אל רשתות TEM באמצעות מניפולטור ננוי מקורר.
- דימות ואנליזה ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-TEM.
תוצאות עיקריות
- הוצאה והעברה מוצלחות של למינלה (lamellae) לצורך דימיון.
- הדגמת יכולות דימוי ברזולוציה גבוהה של cryo-TEM.
- צמצום ארטיפקטים של הכנת הדגימה בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- מתן אפשרות לניתוח מפורט של מבני חומר רך.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה להכנת דגימות עבור cryo-TEM.
- היא מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה תוך הפחתת ארטיפקטים.
- טכניקה זו משפרת את ניתוח הדגימות הביולוגיות במדעי העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הכנה מדויקת של דגימות למעט ארטיפקטים עבור cryo-TEM, באמצעות חילוץ למלה (lamellae) דקות מדגימות ביולוגיות קפואות בעזרת שחיקה באמצעות קרן יונים ממוקדת (focused ion beam milling). היא תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים, על ידי מתן דיוק תת-מיקרומטרי בבחירת אזורי העניין (regions-of-interest), ובכך מפחיתה עמימות בניתוח מבני. גישה זו מגבירה את רמת הביטחון החזויה בזרימות עבודה המשך, על ידי שימור המבנה העל-מיקרוסקופי (ultrastructure) הטבעי ומסירת אפשרות לדימוי ברזולוציה גבוהה של ממשקי חומר רך הרלוונטיים לנוירוביולוגיה ולחומרי שתלים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה ישירה של מבנים תת-תאיים במצבם הטבעי.
- ערך תפעולי: מפחית ארטיפקטים של ההכנה שעלולים להטעות מחקרים של מעורבות מטרה או מנגנון פעולה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים מבניים ברמת דיוק גבוהה להערכת מועמדים מובילים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות עובריות (validated) עבור תהליכי עבודה של מיקרוסקופיה אלקטרונית ואורית מתואמת (correlative light and electron microscopy).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות לצורך ניתוח אולטרה-מבני הדיר בעשרות מסעות סריקה.
- סקביליות (Scalability): מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחלקות מטרה מרובות הדורשות תיקוף מבני בקנה מידה ננומטרי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין השלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להערכה אולטרסטרוקטורלית עקבית בין מערכות מודל שונות.
- התאמת סממנים ביולוגיים: תומכת בזיהוי של סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות מיפוי ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים חלבוניים או דומיינים ממברנליים.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת מידע לקבלת החלטות של "המשך/עצור" על ידי מזעור תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מארטפקטים שנוצרו במהלך ההכנה.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד למחקרים פרה-קליניים, בכך שהיא מספקת נתונים אולטרה-מבניים כמותיים וניתנים לשחזור, התורמים להבנה מכניסטית ולהערכת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לניתוח ספציפי של אתרים במבנים תאיים.
- סריקה: משפרת את המוכנות של הבדיקה על ידי אספקת דגימות נקיות מערטיפקטים לצורך סריקה פנוטיפית אמינה המושראת על ידי תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות כגון עובי הלמלה, קימור הממברנה וצפיפות חלבון לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית באמצעות מאפיינים אולטרה-מבניים שמורים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לצורך תיקוף מבני במספר פרויקטים ומחלקות מטרה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות דימוי ברזולוציה גבוהה של מצבים ביולוגיים טבעיים עם מינימום ארטיפקטים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של הכנת דגימות קריו במעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go), יעילות הון והפחתת כשלים בשלבים מאוחרים עקב פרשנות ביולוגית שגויה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מבוסס סיכון המגובה בנתונים מבניים מאושרים, במקום מדדים חלופיים הנוטים לארטיפקטים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-electron microscopy), הפעלת קרן יונים ממוקדת (focused ion beam) וטכניקות של מניפולציה ננומטרית.
- תלוי בגישה למערכות cryo-FIB/SEM, לתחנות העברה קריוגניות ולמניפולטורים ננומטריים מקוררים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות, פרוטוקולי הקפאה והכנת רשתות (grids) כדי למזער זיהומים.
- שיקולי התאמה כוללים את סוג הדגימה, גיאומטריית הרשת ופרמטרי קרן היונים עבור מערכות ביולוגיות שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות טיפול התלוי במיומנות המבצע כדי למנוע זיהום במהלך חילוץ והעברה של הלמלה (lamella).
