גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

המטרה הכוללת של הליך ניתן להרחבה זה היא לבודד שיבוטים ספציפיים ובעלי זיקה גבוהה של פאג'ים מספרייה המוצגת בפאג'ים באמצעות גישת תפוקה גבוהה המאפשרת בחירה מקבילה כנגד מאות תחומי יעד אנטיגניים. זה מושג על ידי קיבוע תחומים אנטיגניים מטוהרים בצלחות מיקרו בארות. השלבים הבאים הם לחשוף, ללכוד, לשחרר ולהגביר שיבוטי פאג'ים נהדרים הנקשרים באופן ספציפי לאנטיגן משותק מיקרו-צלחת בסבבי בחירה עוקבים.

במהלך תהליך זה, יעילות הבחירה מנוטרת בשיטות משותפות בכל שלב. השלב האחרון הוא להעריך את הספציפיות, הזיקה ו/או הפעילות של שיבוטי ה-Fab המבודדים. בסופו של דבר, שברי פאב ספציפיים בעלי זיקה גבוהה כנגד מספר רב של אנטיגנים מבודדים במקביל, ומאפשרים יצירת נוגדנים שימושיים בניתוח מחלקות שלמות של חלבונים הקשורים מבנית או תפקודית.

חשיבותה של שיטה זו נעוצה בכך שהיא מציעה אלטרנטיבה שיכולה לעזור להתגבר על המגבלות ולהאיץ את קצב פיתוח הנוגדנים הקונבנציונלי במעבדה אקדמית או תעשייתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות פיתוח נוגדנים קונבנציונליות כמו היברידומה כולל שהיא אינה דורשת שימוש בבעלי חיים. ניתן להשתמש בו כמעט לכל חלבון, כולל חלבונים רעילים ולא אימונוגניים.

כפי שנראה, זה מקביל בקלות ובסופו של דבר מניב DNA רקומביננטי מתחדש המקודד נוגדן בעל זיקה גבוהה ספציפית לאנטיגן מסוים ובדיקות אימונולוגיות פונקציונליות וסטנדרטיות תוך שישה עד שמונה שבועות בלבד. בהתחשב בחשיבותם של נוגדנים במחקר בביו-רפואה, ראינו הזדמנות להתאים ולהרחיב את ייצור האנטיגנים ובחירת הנוגדנים וזיהויים לגישה של תפוקה גבוהה תוך שמירה על נגישות למעבדות בגודל ובמשאבים זמינים. בבוקר יום בחירת הפאג'ים, בחר מושבה אחת של תאי אי קולי עמידים לפאג'ים T.

הוסף אותו למיליליטר של שני מדיה yt עם טטרציקלין ב-50 מיקרוגרם למיליליטר. תנו למושבה לדגור על רעידות ב-200 סל"ד בשייקר אורביטלי של 2.5 סנטימטרים. לאחר שצמיחת התרבית ניכרת מבחינה ויזואלית, העבירו תאים לנפח הנדרש של מדיה בתוספת טטרציקלין.

צריך להספיק ל -100 מיקרוליטר לבאר בחירה, או כ -10 מיליליטר ל -96. צלחת באר להרחיב את החלקים של התרבית הן לפניצילין פחמן והן למדיה משלימה של קנין. תרביות אלו מבטיחות מפני זיהום מקדים בתאים שישמשו להגברה.

כאשר הספיגה האופטית של התרבית מגיעה ל-0.4 עד 0.8 ב-595 ננומטר. לאחר חמש עד שבע שעות, התאים מוכנים למריחה על לוחות האנטיגן. כדי שפרוטוקול זה יבטיח את הכיסוי הרצוי של הספרייה, הכינו מספיק לוחות אנטיגן משוכפלים וצלחות חלבון בקרה לא ספציפיות.

באמצעות פרטי החישוב המוצגים מסופקים בפרוטוקול הטקסט. לאחר קיבוע לילה של חלבוני בקרה מטרה ולא ספציפיים, הסר את תמיסת החלבון מהצלחת. הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם וחסום למשך שעה עם ניעור ושטוף את הצלחת ארבע פעמים לפני הוספת ספריית הפאג'ים בזמן שהתאים גדלים.

ביום בחירת הפאג'ים, אנו מבהירים מראש פאג' כריכה לא ספציפי או ספציפי לתג הציג שיבוטי FAB מהספרייה על ידי העברת 100 מיקרוליטר של ספריית פאג'ים ללוחות הבחירה השליליים לתוספת בחירה שלילית. הסר את פאג' קשירת התגים על ידי הוספת עודף של תג זיקה מסיס. לשם כך, הוסף ריכוז סופי של 10 מיקרו-מולרי של GST מסיס לכל אחד.

ובכן אז דגרו את הצלחות למשך שעה עד שעתיים על שייקר בטמפרטורת החדר. כדי להכין את צלחת חלבון המטרה יש לשאוב תמיסת חלבון מהצלחת, להוסיף 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם ולחסום למשך שעה עם ניעור ושטיפה ארבע פעמים לפני הוספת ספריית פאג'ים. לאחר הדגירה, אוספים את חטיף הפאג מהצלחות.

בעזרת מטפל בנוזלים של 96 ערוצים, העבירו את הפאג' ללוחות מצופים אנטיגן. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך שעה עד שעתיים על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את הפאג' הלא קשור על ידי שטיפת הבארות שמונה עד 15 פעמים באמצעות מאגר PT.

ניתן לעשות זאת באופן ידני או עם מכונת כביסה אוטומטית. ואז רגע לפני הוספת התאים, הסר את כל מאגר הכביסה העודף כאשר התאים וצלחות האנטיגן מוכנים. יש לחסל את הפאג' על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תאים גדלים לכל באר ולתת לצלחות לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חצי שעה.

סבבי הבחירה הראשונים לא צפויים לייצר העשרה משמעותית, אך כימות של טיטר הפאג'ים הפלט יכול להבטיח אשליה של ריכוזי הפאג'ים המינימליים הדרושים לבחירה מוצלחת. לשם כך, ניתן להסיר כמות גדולה של תאים לפני הוספת פאג' מסייע על מנת להדק את תפוקת הפאג'ים על ידי הכנה וציפוי של דילולים סדרתיים של התאים על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר דגירה של חצי שעה, הוסף M 13 K oh seven helper phage לכל באר לריכוז של 10 מיליארד יחידות יוצרות מושבה למיליליטר.

תנו לצלחות לדגור עוד 45 דקות הפעם עם טלטול ב -200 סל"ד. לאחר מכן, העבירו את התאים לבלוק באר בעומק 96 באר עם תחתית V המכילה 1.2 מיליליטר של שני מדיות YT משלימות לבאר. תנו לצלחות הבאר העמוקות לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם רעידות ב-200 סל"ד למחרת.

גלולה את החיידקים על ידי סיבוב הצלחות ב-4,000 GS למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מכל צלחת משוכפלת, העבירו כמויות שוות של סופרנטנט המכיל את הפאג' לצינור קטן. קופסה כחולה של 96 באר מיקרופלייט שתשמש כקלט לסבבי הבחירה הבאים לפאג' המאוחד, הוסף כרך עשירי של 10 XPBT וערבב לנטרול.

כעת, חזור על תהליך הבחירה מהספרייה. פינוי מקדים ודגירת פאג'ים אנטיגן שלוש עד ארבע פעמים באמצעות פאג'ים מוגברים מסבב הבחירה הקודם. עשה זאת עד שנצפתה העשרת קשירת מטרה בהשוואה לקשירה של חלבוני בקרה לא ספציפיים על ידי אלייזה מיקרו לוחות באר מקודדים בשני מיקרוגרם למיליליטר אנטיגן או חלבון בקרה כפי שתואר קודם לכן בפינוי מוקדם של הספרייה ודגירת פאג'ים אנטיגן נחסמים ונשטפים כמו קודם כדי לחסום ולשטוף אנטיגן ולשלוט בלוחות מצופים חלבון למרוח 100 מיקרוליטר של פאג' מדולל על הבארות ולתת לצלחות לדגור עם ניעור עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה יש לשטוף את הצלחות שמונה פעמים עם מאגר PT.

לאחר מכן, לאחר השטיפות, הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן נגד M 13 HRP ב-1 עד 5,000 lution ב-PBT לכל באר דגירה למשך חצי שעה כדי לאפשר קשירת נוגדנים לפאג' הקשור לאנטיגן. לאחר מכן שטפו את הצלחות עם מאגר PT שש פעמים ופעמיים נוספות עם PBS ישר הכינו, ערבבו ומרחו 100 מיקרוליטר של מצע TMB אחד לאחד על כל אחת מהבארות. תן לזה להגיב במשך חמש עד 15 דקות, ועצור את התגובות כאשר יש שינוי צבע משמעותי.

עצור את התגובות על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חומצה זרחתית מולרית אחת. כעת קרא את הספיגה בבארות ב-450 ננומטר והשווה את אותות קשירת המטרה לאותות הקישור של חלבוני הבקרה לאחר ההעשרה. ניתן לבודד ולאפיין שיבוטים בודדים על ידי רצף פאג'ים, המרת DNA של פאג'ים הקשורים לפאב חופשי, והערכת קשירה ישירה למטרה באמצעות FabuLisa משובט כפי שמוסבר בחלק הטקסט של הפרוטוקול.

עבור מעבדות בהן נדרשת תפוקה גבוהה יותר, ניתן להגדיל מתודולוגיה זו ולהפוך אותה לאוטומטית. מתוך מחשבה על מטרה זו, פותחה רובוטיקה מותאמת אישית שיכולה להרחיב את יכולת הבחירה על ידי אוטומציה של כל ההיבטים של ההליך, כולל חסימה, פאג', כריכה ואלוסיאן ועוד. גישה אחת להשגת אנטיגן לשימוש בבחירת נוגדנים היא שימוש בטכנולוגיות גנים סינתטיים להשגת מבנים לביטוי תחומי חלבון מבודדים.

ברוב המקרים, זה מאפשר ביטוי תפוקה גבוהה ובידוד של כמויות נאותות של אנטיגן מטוהר טהור מספיק לבחירה. במהלך סבבים עוקבים של תהליך הבחירה, ריכוזי פאג'ים חמקו והעשרה של פאג'ים שנקשרו במיוחד לאנטיגן נוטרו על ידי טיטרציה של פאג'ים כפי שהוצג קודם לכן או נוטרו באמצעות בריכות פאג'ים. בבדיקת ELA, יחס קשירה גדול משניים מצביע בדרך כלל על נוכחות של שיבוטי קשירה ספציפיים.

לעומת זאת, יחס נמוך יותר יכול לעזור לקבוע את הגורם לכישלון בחירה. אפיון קשירת שיבוטים באמצעות בדיקת אמינו קולומטרית מאפשר השוואה של פאב פאב או פאב מקשר לאנטיגן משותק בהשוואה לחלבון בקרה שלילי קשירה, ובכך מניב מדד של ספציפיות בעת קנה מידה ואוטומציה של בחירות עם יחידות טיפול בנוזלים רובוטיות. השימוש בכרומופורים סופגים יכול לעזור לזהות מתי תעלות ספציפיות בנוזלים סתומות או איבדו את האיטום שלהן, וכתוצאה מכך מסירת נפח חלקית, ולסייע בפתרון בעיות במהלך אופטימיזציה של הליכי כביסה, השימוש בשיבוטים מחייבים ידועים מבטיח שמירה על קשירת המטרה בזמן הסרת כריכת הרקע במהלך השטיפות.

בנוסף, פרוטוקולי טיהור יעילים מבטיחים היעדר זיהום צולב מסבבי בחירה עוקבים או הליכי בחירה שונים ומומלצים לבחון פרמטרים נוספים לפתרון בעיות בפרוטוקול הטקסט. על ידי הרחבת טכניקה זו ליישום תעשייתי, אנו מקווים לאפשר לחוקרים לחקור מחלקות שלמות של חלבונים הקשורים מבחינה מבנית או תפקודית על ידי האצת הבחירה והזיהוי של נוגדנים מתחדשים בעלי זיקה גבוהה במטרה הסופית להשיג כיסוי מקסימלי של פרוטאום.