ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת שינויים בפפטיד פוספו המתרחשים בתוך זרעונים במהלך הבשלת תאי הזרע. זה מושג על ידי הוצאת האפידידימוס מהעכבר, ביצוע שטיפה לאחור לאחור של תאי הזרע ואיסוף התאים לצינור מיקרו נימי. לאחר מכן, נותנים לתאי הזרע לשחות החוצה לתמיסת מלח מאוזנת, המאפשרת סילוק חלבונים מזהמים, ואז הם נשטפים, משקעים ומשקעים על מנת להסיר מלחים ושומנים מזהמים.

חלבוני הגולר מתעכלים באמצעות טריפסין ולאחר מכן מועשרים בטיטניום דו חמצני על מנת להעשיר את פפטידי הפוספו. התוצאות מראות שינויים כמותיים במצב הזרחן של חלבונים על סמך כרומטוגרפיה נוזלית, ניתוח ספקטרומטריית מסה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרבייה, כגון מהם השינויים הפוספו-פרוטאומיים כאשר זרע חוצה את ה-EPIs או במהלך קיבולת.

למרות ששיטה זו סיפקה תובנה לגבי הביולוגיה של תאי הזרע, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים מודלים, מחקרי מחלות כגון סרטן, פתולוגיות נוירולוגיות ומסלולי העברת אותות כלליים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לקבוע את האנטומיה של האזורים שבהם ה-EPIs יעברו מניפולציה. התחל בהכנת 200 מיליליטר של תמיסת גבעול עבודה של ביגרס, וויטן וויטן או BWW על ידי הוספת הדברים הבאים לליטר אחד של מי Milli Q ליצירת צינורית.

שימוש בצינורות פוליאתילן בקוטר פנימי וחיצוני של 0.4 מילימטרים ו -1.1 מילימטר בהתאמה. החזק אותו על אש נמוכה עד שהצינור מתחיל להימס. משוך מיד את קצות הצינור כלפי חוץ כדי למתוח אותו, ובכך להקטין את הקוטר החיצוני.

חותכים את הצינור כדי לייצר היצרות של קצה אחד, מה שיאפשר קנולציה קלה יותר של ה-S. חותכים את הקצה הנגדי לכ -15 סנטימטרים. לאחר מכן הכנס מחט בגודל 30 לקצה הבוטה, והצמד אליו מזרק של שלושה מיליליטר נסוג במלואו.

צור פיית יניקה על ידי חיתוך צינור PE באורך 20 ס"מ והכנס אותו לקצה אחד של הצינורית. הכנס את מחזיק צינור הזכוכית המיקרו נימי ואת נימי המיקרו מזכוכית. לאחר המתת חסד של עכבר על פי פרוטוקול הטקסט, בצע חתך קטן בשק האשכים כדי לחשוף את האפי.

לאחר מכן השתמש בזוג שענים. מספר חמישה מלקחיים כדי למשוך את האשך והאפידידימוס החוצה מהחלל. חותכים כדי להסיר את כל הכבוד העצום מהקאטה אפידידימוס מלבד כסנטימטר עד שניים.

לאחר מכן חתכו כדי להסיר את צינורות ה-EENT הפרוקסימליים והרקמה המחברים את האפידידימוס לאשך והסירו את כל מסלול הרבייה הזכרי תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות הגדלה של בין חמש x ל-40x. הנח סנטימטר עד שניים מהקצה המצומצם של הצינורית בשדה הראייה והשתמש בנייר דבק כדי לאבטח אותו עם מספר חמש, מלקחיים של שען. אחזו בעדינות בכל צד של הכבוד העצום ומשכו אותו מעל החלק הגלוי של הצינורית.

לאחר מכן, בעזרת משי מטופל קלוע שחור שאינו נספג, קשרו קשר מאובטח סביב הרקמה המשופרת באמצעות שענים. מלקחיים מספר חמש. תפסו את הקצה הדיסטלי של הקאטה אפי אידס והסירו את הטוניקה יוג'יניה.

על מנת לחשוף צינורית אפידרמיס בודדת, חשפו בעדינות את הצינורית והפרידו אותה כדי ליצור פתח לשחרור הזרע. לאחר מכן, לחץ בעדינות על הבוכנה של המזרק כדי להוציא אוויר לתוך הכבוד העצום. הלחץ יגרום לזרעונים לצאת מהצינורית השבורה.

לאחר מכן הפעל יניקה על הפיה כדי למשוך את הזרעונים לתוך נימי הזכוכית. נשפו בעדינות לתוך הפיה או חברו מזרק והוציאו את הזרעונים מנימי הזכוכית לתוך מיליליטר אחד של תמיסת B WW מלפני המלחמה. והשתמש בתמיסה כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים כדי להסיר חלבונים מזהמים.

לאחר הסרת השטיפה הסופית, הקפיאו את הזרע לשימוש מאוחר יותר או השתמשו ב-4% צ'אפים, שתי אוריאה מולרית ו-50 מילי-מולרי טריס pH 7.4 כדי להמיס את החלבונים שדוגרים למשך שעה אחת עם מערבולת לסירוגין. לאחר מכן צנטריפוגה את התמיסה ב-10,000 GS למשך 20 דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש כדי להפחית את קשרי הדיסולפיד ולאלקילאט את החלבונים ב-DTT בריכוז סופי של 10 מילי-מולרי לתמיסת החלבון. מערבולת ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן הוסיפו 50 מילי-מולר של אצטמיד IO למערבולת הליזאט ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. כדי לזרז את החלבונים, שלב נפח אחד של ליזאט, נפח אחד של מתנול ו-0.5 נפחים של כלורופורם. לאחר מערבולת הדגימה, סובב אותה ב-10,000 Gs למשך שתי דקות, אסוף את השכבה העליונה והשאיר כשני מילימטרים כדי להימנע משאיבת הממשק.

לאחר הוספת נפח אחד של מתנול, הפוך בעדינות את הצינור וסובב שוב. השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הגלולה באוויר למשך שלוש עד ארבע דקות כדי לבצע טריפסין, עיכול והעשרת פפטיד פוספו. התחל בשימוש באמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי המכיל אוריאה טוחנת אחת.

כדי להרכיב מחדש את הטריפסין, שלבו F 50 למשקל אחד למשקל יחס של חלבון לטריפסין ודגרו על מערבל תרמו ב-37 מעלות צלזיוס ו-700 סל"ד למשך הלילה. לאחר סיבוב כדי לגלול את החומר הלא מעוכל, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. בעזרת מאגר DHB שהוכן על פי פרוטוקול הטקסט, יש לדלל את הפפטידים המוטבעים פי עשרה ולמרוח אותו על 200 מיקרוגרם של חרוזי טיטניום דו חמצני יבשים המדגרים על מסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, השתמש במאגר DHB כדי לשטוף את הדגימה פעם נוספת לפני השימוש במאגר כביסה המורכב מ-80%A CN ו-2% TFA כדי לשטוף את הדגימה שלוש פעמים לאחר הצנטריפוגה הסופית של פפטידי הפוספו על ידי הוספת 2.5% אמוניום הידרוקסיד מיד לאחר הסיבוב ואיסוף הסופרנטנט.

השתמש ב-0.3 מיקרוליטר של חומצה פורמית כדי להחמיץ את הדגימה כפי שניתן לראות כאן. יתרון אחד של פרוטוקול זה הוא שזרעונים מבודדים. במצב שקט, תאים רבים מתקבצים מיד לאחר הגירוש לתווך B WW.

עם זאת, לאחר 10 דקות הם הופכים למודאליים והפתרון הופך הומוגני. ההכנה המתוארת בסרטון זה מייצרת בדרך כלל 200 כפול 10 עד שש זואה. איור זה מדגים את טוהר הזרעונים מחולדת AR Cota epididymus.

נושא מרכזי אחד הנוגע להכנת הדגימה הוא התשואה מטיולים ועיכול. בניגוד למשקעי TCA, שלעתים קרובות דורשים התאמת ה-pH של הדגימה, משקעי פנול כלורופורם מהירים ואינם מחמצים את הדגימה המוצגת כאן היא גלולת החלבון הנראית בדרך כלל מ-100 מיקרוגרם של דגימה בין הממשק התחתון לעליון המודגמת. הנה יכולת השחזור של פרוטוקול זה.

הפסים הכחולים המופיעים לאורך זמן הם פפטידים המרמזים על עמודת ננו C 18. ככל שריכוז האצטוניטריל עולה באוכלוסייה המודאלית, יש אשכול פפטידים בכ-651.5 דלטון שנעדר לחלוטין בטווח הלא-טווח. פעם פרוטוקול העשרת פפטיד פוספט הוא טכניקה יעילה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהכנת דגימה היא היבט מרכזי להשגת תוצאות הניתנות לשחזור עבור פרוטאומיקה. ניתן להתאים שיטה זו לבידוד גליקופרוטאינים, שניתן להשתמש בהם כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו חלבונים עוברים שינוי בתכולת החומצה הסית של הפרוטאום שלהם.