הפגנה של מפרקי חלבוני הפעלה של אפיתל נתרן הערוץ (ENaC) על ידי שילוב של מדידות זרם עם איתור של שברי מחשוף

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את השפעתם של פרוטאזים על תעלת נתרן אפיתליאלית או ENaC המבוטאת באופן הטרולוגי ב-zap lava cytes. דבר זה מושג תחילה על ידי מדידת זרם תא שלם רגיש לאמורית בתוך אווציט. לאחר מתן זמן התאוששות לאווציט, הוא נחשף לפרוטאז והזרם נמדד שוב.

במקביל, ביצוע ביוטינילציה לאוציטים והעברתם ל-western blotting כדי לנטר את הופעתם של מקטעי פיצול של gamma ENaC על פני השטח של התא. התוצאות המתקבלות מראות קשר סיבתי בין פיצול התעלה לבין הפעלת התעלה, בהתבסס על שילוב של טכניקת two electrode voltage clamp וגישת הביוטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדידה לא מתוכננת, הוא שניתן לחשוף את האוציט לפרוטאז או לסוכנים פרמקולוגיים אחרים בין שתי המדידות למשך פרקי זמן משתנים בנפח קטן של תמיסת בדיקה. יומיים לאחר בידוד אוציטים של Xenopus laevis והזרקת cRNA בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השתמש ב-ND 96 למילוי מזרק אחד של מערכת פרפוזיה המופעלת על ידי כוח הכבידה, וב-ND 96 המכיל amide למילוי מזרק שני.

לאחר התקנת המזרקים בגובה של 50 סנטימטרים מעל תא הרחצה, הדלק מקור אור קר הלוגני של 150 וואט וכוונן לגובה של 10 סנטימטרים מעל תא רחצת הביציות, כדי לאפשר ראות טובה באמצעות המיקרוסקופ הבינוקולרי. הדלק את השאיבה והצב את צינור השאיבה מול המתאם של צינור הסופרפוזיה בתא רחצת הביציות. לאחר מכן, באמצעות התקן בקרת זרימה בכבידה של IV, כוונן את מהירות הסופרפוזיה של כל תמיסה ל-3 עד 5 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, חבר את צינורות הסופרפוזיה לתא רחצת הביציות באמצעות מתאם, תוך שימוש בקפילרות זכוכית שנמשכו במיקרו-פיפטה כדי להגיע לקוטר קצה של פחות מ-1 מיקרומטר.

לאחר מכן, השתמשו בקלורצוריד של אשלגן בריכוז שלושה מולארי כדי למלא אותם עד לרבע מגובהם בערך. הכניסו את הקפילריות למחזיקי האלקטרודות של אלקטרודת הזרם ואלקטרודת המתח, ובעזרת המיקרו-מניפולטורים, מקמו אותן בתוך ND 96 המכיל תמיסת Amide בריכוז שני מיקרו-מולארי. כדי למדוד זרמי תא שלמים הרגישים ל-amide, התחילו בכיוון כפתור ה-VM offset כדי לאפס את פוטנציאל האלקטרודה של אלקטרודת המתח, ואת כפתור ה-VE offset כדי לאפס את אלקטרודת הזרם.

הנח את אתר ה-UO אל תוך תא הרחצה ובקרבה מיידית לאלקטרודת חישת המתח. לאחר מכן, באמצעות שתי המיקרו-אלקטרודות, דקורה בעדינות את אתר ה-UO, הגדר את פוטנציאל ההחזקה של המגבר ל-60- millivolts והפעל את רשם הגרפים. לאחר מכן, הפעל את זרימת התמיסה המכילה amide.

לאחר מכן, התחילו בהקלטה, ובמידת הצורך, כווננו את ההגבר. לאחר שהזרם הנמדד מגיע לרמה יציבה (plateau), עברו לתמיסה נטולת amid. ברגע שהושגה רמה יציבה של הזרם, החזירו את הפרופוזיה לתמיסה המכילה amide. לאחר מכן, כאשר הזרם באתר ה-UO מגיע לזרם הבסיס ההתחלתי, כבו את ה-voltage clamp ומשכו בעדינות את האלקטרודות כדי לאפשר סגירה מחדש של ממברנת הפלזמה באתרי הדקירה.

הניחו את אתר ה-Uoc בתוך באער אחד של פלטת 96 באערים המכילה 100 עד 150 µL של תמיסת ND 96 נטולת פרוטאז למשך חמש דקות, לפני העברת אתר ה-UOC לתמיסה המכילה פרוטאז או לתמיסת ביקורת ללא פרוטאז. במשך 30 דקות לאחר האינקובציה, חזרו על המדידה הנוכחית, השליכו אוקיציטים פגומים תחת מיקרוסקופ סטריאו והכינו anti 96 עם ובלי הפרוטאז המתאים. הכינו פיפטות פסטור על ידי סימון שלהן ושריפה קצרה של קצותיהן בלהבה כדי למנוע פגיעה באוקיציטים.

מלאו כל באער בלוח שש-באערים ב-2.5 milliliters של ND 96 בטמפרטורת החדר או ND 96 המכיל protease. לאחר מכן, הוסיפו 30 oocytes לכל באער והדגירו אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת 2.5 milliliters של ND 96 לבאערים של לוח שש-באערים חדש, העבירו כל קבוצה של oocytes לבאער מלא ב-ND 96.

העבירו את התאים באופן רצופי לשתי בארות נוספות המכילות ND 96 כדי לשטוף שאריות של פרוטאז, והדגירו אותם בבאר האחרונה למשך חמש דקות; הכינו ביוטין בבuffer לשחרור ביוטין (biotin elation buffer) בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר העברת כל קבוצת ביציות (oocytes) לבאר המכילה 2.5 milliliters של buffer לשחרור ביוטין, הדגירו למשך 15 דקות תוך כדי ערבוב עדין. לאחר מכן, לאחר העברת כל קבוצת ביציות לבאר המכילה 2.5 milliliters של buffer לכיבוי (quench buffer), כדי להפסיק את תגובת הביוטין, העבירו אותם לבאר שנייה של quench buffer והדגירו למשך חמש דקות.

בערבוב עדין, העבירו כל קבוצה של אוציטים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ובעזרת 1 מיליליטר של lysis buffer, בתוספת מעכבי פרוטאז, בצעו ליזיס של התאים על ידי העברתם דרך מחט בכיליבר 27. צנטריפוגו את התמיסות שנוצרו למשך 10 דקות ב-1500 ×g. העבירו את התמיסה למבחנה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר המכילה TRITTON X 100 ו-MP 40, והדגירו את המבחנות על קרח למשך 20 דקות. ערבבו את המבחנות שוב ושוב ב-vortex כדי להמיס את החלבונים; לאחר שיווי משקל (equilibrating) של 100 µL של vagaro beads לכל קבוצת אוציטים, הוסיפו אותם לתמיסות החלבון והדטרגנט והדגירו את הדגימות בסיבוב עליון (overhead rotation) בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה.

ביום למחרת, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-1500 ×g. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה כדי לזהות מקטעי cleaved act על פני השטח של התא. הכינו את דגימות הג'ל באמצעות שטיפת החרוזיים שלוש פעמים בבופר ליזיס (lysis buffer) לפני הוספת בופר לדגימות 2X SDS-PAGE. לאחר סבב של הדגימות בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-20,000 ×g, העבירו בעזרת פיפט את הנוזל העליון למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות.

נתחו את הדגימות באמצעות western blot בהתאם לפרוטוקול הכתוב כדי לבחון האם הפרוטאזה פלסמין מסוג סרין יכולה להפעיל זרמים המתווכים על ידי ENaC. ה-delta IE של תאים בודדים המבטאים ENaC נקבע לפני ואחרי דגירה של 30 דקות של התאים בתמיסה נטולת פרוטאזות או בתמיסה המכילה פלסמין. באמצעות טכניקת ה-two electrode voltage clamp כפי שמוצג כאן, חשיפה לפלסמין הגבירה את ה-delta IE בכל תא שנמדד.

לעומת זאת, לדגירה בתמיסה נטולת פרוטאז הייתה השפעה זניחה. איור זה משווה את ההשפעה של chio trypsin על ENaC מסוג הפרא (wild type) ועל ENaC עם אתרי שבירה מוטגים של prostasin ו-plasmin. כפי שניתן לראות כאן, התעלה המוטגית מעכבת ומפחיתה את ההפעלה של זרם המתווך על ידי ENaC באמצעות chio trypsin.

בנוסף, הוא מייצר מקטע שסוע בקצב מופחת בהשוואה ל-ENaC מסוג הפרא. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד ניתן להשתמש בשילוב של השיטות המתוארות כדי להקרין את ההשפעה המעוררת של פרוטאזות על המופע הפנימי עם הופעתם של תוצרי שסוע על פני התא. דבר זה עשוי להיות שימושי למגוון רחב של יישומים, למשל, כדי לבחון שאלות דומות הנוגעות לבקרה של תעלות ברזל אחרות, נשאים או רצפטורים טרנס-ממברנליים.