Name: טיהור תשואה גבוהה של Falciparum Plasmodium Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: למדו שיטה לטיהור תשואה גבוהה של Plasmodium falciparum merozoites לשימוש במבחני נוגדנים אופסוניזציה. השיטה משתמשת ב-E64 וציטומטריית זרימה לכימות פאגוציטוזה תלוית נוגדנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לילדים ולתורמי פלזמה למבוגרים, וצוות בפפואה גינאה החדשה המכון למחקר רפואי. המחברים מבקשים להודות לAmandine B Carmagnac, קתרין ש Nie, דני W וילסון, איבו מולר ודיאנה S הנסן על תרומתם לפיתוח של טכניקה זו, ותודה לצלב האדום האוסטרלי לחבילות דם וסרום. עבודה זו התאפשרה בזכות תמיכה ויקטוריאני ממשלת המדינה תפעולית תשתיות ואוסטרלית הממשלה NHMRC IRIISS. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומית מועצה למחקר רפואית מעניק # 1031212 ו# 637,406, ומכונים הלאומיים לבריאות מענק # AI089686.

<ol><li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li>
<li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFowkes%2C+FJI+%22PLoS+Medicine%22">PLoS Medicine</a>. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).</li>
<li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro%2C+but+act+in+cooperation+with+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li>
<li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).</li>
<li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li>
<li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li>
<li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li>
<li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72(2007).</li>
<li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li>
<li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li>
<li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte%3A+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li>
<li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li>
<li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li>
<li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li>
<li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+immunity+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Ataíde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152(2010).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li>
<li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li>
<li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li>
<li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li>
<li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li>
<li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li>
<li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonopsonic+monocyte%2Fmacrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes%3A+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כדי למדוד phagocytosis merozoite, בקיאות בשתי טכניקות נדרש: טיהור של merozoites וassay phagocytosis THP-1. השלבים הקריטיים ביותר לשילוב של שתי טכניקות אלה הם: 1) טפילים מסונכרנים היטב; 2) הוספת E64 בזמן הנכון כדי להניב merozoites המוקף קרום; 3) הסרת hemozoin להימנע מצרפים; 4) ספירת merozoite מדויקת על ידי cytometry זרימה; 5) הדילול של פלזמה משמשת; ו6) שמירה על צפיפות תא נמוכה ומספר מעבר של THP-1 תאים. בחינה קפדנית של היבטים המרכזיים אלה תבטיח תגובות phagocytosis חזקות הם נצפו. אמנם, מתואר כאן היא הכנת merozoites להערכת phagocytosis, הטכניקה יכולה להיות מנוצל עבור מגוון רחב של יישומים. ללא קשר למתודולוגיה הזרם למטה, הכנות merozoite אופטימליות תלויות בעיתוי נכון בנוסף E64 על מנת ליצור merozoites. שיטת E64 המתוארת כאן הוכח yIELD merozoites פולשנית לשימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של אירועי פלישה ומבחני רגישות הסמים 15-20. בעוד כדאיות merozoite אינה חיונית לphagocytosis, נדרשת יושרה של מעיל משטח merozoite. לכן שיטת E64 המתוארת כאן מאפשרת merozoites באיכות גבוהה כדי להיות מיוצר להערכת תגובת נוגדנים למעייל פני השטח. כפי שמתואר באיור 1, אם E64 מתווסף מוקדם מדי או מאוחר מדי merozoites הקרום סגור לא נוצרים. מסיבה זו, תרבויות טפיל סינכרוני מאוד נדרשות. כאן, השימוש בטיפולי סורביטול והפרין לחוזקה לסנכרן תרבויות טפיל D10-GFP לחלון של שעה 2 הוא תאר. הפרין יכול לקדם gametocytogenesis במעבדה אחרת מבודדת, ולכן יש להשתמש בזהירות. עשויות לשמש גם שיטות סנכרון אלטרנטיביים כגון אלנין, ובלבד שטפילים מסונכרנים היטב מיוצרים 29. אם E64 מתווסף לטפילי אסינכרוני, אבזר נמוךortion של merozoites מוקף קרום יופק ונותר טפיל שנדבק ב-RBC יהיה גם קרע בדרך כלל או לפתח מורפולוגיה נורמלית. נוכחותם של טפילים שלא התפתחה לmerozoites קרום סגור תגרום לסתימה של המסנן ולהפחית באופן משמעותי את תשואת merozoite מתקבלת. במהלך הסינון של merozoites המוקף בממברנה, hemozoin הוא משוחרר מוקואולות העיכול וקיים כגבישים חופשיים בתמיסה. Hemozoin הוא מעודדי דלקת מאוד וכבר דווח לווסת תגובות מונוציטים וphagocytosis מקרופאג 30, ביום 31. בנוסף לויסות phagocytosis, כפי שמוצג באיור 2, hemozoin יכול ליצור אגרגטים עם merozoites בתמיסה. כTHP-1 תאים יכולים phagocytose אגרגטים אלה, זה יכול להיות confounder עיקרי להחלטה של ​​phagocytosis בתיווך הנוגדנים. לכן, הסרת hemozoin יש צורך בassay זה לאבמורכבות נוספות של OID hemozoin על ביולוגיה תא בלען. בנוסף, אי ספיקת כדי להסיר hemozoin יכולה להיות גם הרסנית בעת השימוש בטכניקה זו כדי ליצור merozoites ללא תשלום עבור יישומים אחרים, במיוחד שבו נדרש כימות merozoite. כפי שמתואר באיור 4, מספר merozoites הוסיף לassay יכול להשפיע על מידת phagocytosis ידי THP-1 תאים. למרות cytometry הזרימה מאפשר ספירה של ריכוז merozoite, pipetting זהיר ולשכפל את הסעיפים של merozoites נחוץ כדי לשפר את הדיוק. זה קריטי במיוחד אם קווי טפיל מרובים הם להיבדק Side-by-צד. זה בעבר כבר הראה כי פלזמה מילדים למחצה חסינים מפני PNG יכולה להיות מדולל באופן משמעותי לפני תגובות ירידת 23. שתואר כאן הוא הדילול האופטימלי של פלזמה (1/120, 000 הדילול סופי של פלזמה) לקבוצה של 5 - ילדי PNG בת 12 שהפיקה את מגוון הגדול של phagocyt. תגובות אוזיסים המתוארות באיור 5 טווח זה אפשר לריבוד של תגובות לארבע קבוצות (0 - 19%, 20-39%, 40-59% ו60 - phagocytosis 79%), ומודלים רגרסיה חשפו כי תגובות opsonizing היו קשורות עם ההגנה מפני מחלה קלינית וצפיפות גבוהה parasitaemia 10 לעוקבה שונה לומדת ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילול פלזמה כדי להבטיח phagocytosis ידי THP-1 תאים לא רווי או מתחת לרמה של זיהוי. Cytometry זרימה מאפשרת phagocytosis המהיר וכימות עם דיוק משופר על מיקרוסקופ. פרוטוקול זה הוא תפוקה גבוהה, צלחת מבוססת ואוטומטי רכישת 96 צלחות גם ללמוד חסינות הלחות שנרכשה באופן טבעי. השיטה דורשת צביעת merozoites ברומיד ethidium, יכולים להיות מנוצלים כתמי DNA אלטרנטיביים לעומת זאת, כגון SYBRgreen, DAPI ויוד propidium, כתמי קרום או כתמי חלבון. assay זה יהיה מקובל Primarמונוציטים y או נויטרופילים, ויכולים להיות מותאמים אם תא בלען או הביולוגיה FCR היה של עניין. תאים ראשוניים או THP-1 תאים מובחנים במבחנה עם PMA יכולים לשמש כדי לחקור phagocytosis במלריה ופתוגנים אחרים 12, 32-34. עם זאת שימוש בתאים ראשוניים עשויה להיות מאתגר כפי שהתאים אלה הם חסיד וגם להציג phagocytosis שאינו הנוגדן בתיווך 35. בנוסף, השתנות בטהרה, כדאיות ופונקציונליות כמה מגבלות מפתח לשימוש בתאי phagocytic העיקריים. קולטני Fc המעורב בphagocytosis merozoite יישאר uncharacterized, ולכן באמצעות חסימת נוגדנים לקולטניים Fc ספציפי יכולה להבהיר את תרומתו של כל מועדון כדורגל קולטן לmerozoite phagocytosis. כphagocytosis THP-1 הוא FCR תלוי, זה מאפשר פירוש פשוט של phagocytosis נצפה. assay זה גם משאיל את עצמו לטיפול ספציפי אנטיגן של opsonizing נוגדנים אשר יכולים להיות מושגת על ידי utilizing טפילים עקום החוצה לפני שטח אנטיגנים merozoite, או באמצעות נוגדנים אנושיים מטוהרים זיקה לmerozoite חלבוני פני השטח. יתר על כן, בעומק מחקרים של תגובות ציטוקינים הבאים phagocytosis merozoite חסרים, ויכולים להיות מושגת באמצעות assay זה. שתי טכניקות אלו מהוות התקדמות ניכרת בחקר נוגדני antimerozoite הפונקציונליים. טיהור merozoites באיכות גבוהה יש יתרון לשימוש בmerozoites cryopreserved, או זעירים מניאון מצופה באנטיגנים merozoite. למרות assay זה כבר נעשה שימוש ככלי להערכת חסינות שנרכשה באופן טבעי, זה עשוי להוכיח כלי חשוב להתמודדות עם הרכישה של חסינות בתגובה לחיסון. למרות שזה הוכח לאחרונה כי phagocytosis או merozoites opsonised קשור להגנה מפני מלריה קלינית, לא ניתן להסיק מסקנות ישירות מphagocytosis THP-1 במבחנה לin vivo phagocytoאחות של merozoites כphagocytosis בassay זה מתרחשת תחת תנאים סטטיים ובהעדר מתחרה בתאי דם אדומים. ההתאמות הפוטנציאליות של assay זה עשויות כך לספק כלי תכליתי להבנה נוספת של מלריה וphagocytosis merozoite.

החשיבות של נוגדנים לחסינות למלרית falciparum Plasmodium הוצגה לפני 40 שנה, כאשר אימונוגלובולינים ממבוגרי ההיפר הועברו באופן פסיבי לילדים הסובלים ממלריה חמורה וכתוצאה מכך המחלה להקל 1. כתוצאה מכך, מאמץ ניכר בקש לזהות מטרות של חסינות מלריה מגן, בעיקר באמצעות מדידת טיטר נוגדנים לפפטידים או חלבונים הביעו bacterially ידי ELISA. סרולוגיה מבוססת ELISA הוכיחה גם משתנה מאוד בין לימודים, ואינה מתייחסת לנוגדנים פונקציונלי 2. אנטיגנים מלריה רבים לגרום IgG1 cytophilic ופרופיל נוגדן IgG3, במיוחד פני השטח אנטיגנים merozoite 3. הטיה תת הדבר מצביעה על כך אינטראקציות נוגדן-FC-קולטן (FCR) עם phagocytes חשובות לפונקציות מפעיל של opsonizing נוגדני antimerozoite 4. חיסוני אנטיגן merozoite כמה בפיתוח נועדולעורר פונקציות תא בלען מפעיל 5, 6 ולמרות שראיות משמעותיות לחשיבות של אינטראקציות הנוגדן-FCR במודלים של מלריה מכרסם קיימים 7-9, וכמה מחקרים שנעשה לאחרונה תומכים בחשיבות של נוגדנים פונקציונליים ופונקציות מפעיל תא בלען לחסינות למלריה בבני אדם 10, 11, תחום זה עדיין נחקר גרוע. מחקר לנוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היה מוגבל על ידי שני גורמים; הקושי בבידוד merozoites באיכות טובה; ותגובות phagocytosis משתנים מהתאים ראשוניים. עד לאחרונה, מילויים צנטריפוגה במהירות גבוהה או צפיפות Percoll נוצלו כדי לבודד merozoites מsupernatants התרבות של פקיעת תרבויות schizont. merozoites אלה היו מעשי רק לעתים נדירות, ולעתים קרובות מניפולציות נוספות על ידי צנטריפוגה צפיפות ולשטוף מרובים שלבים 12, או הקפאה 11 לפני השימוש במבחנים. proc אלהesses פוטנציאל לנתק חלבונים רבים הקשורים שולי ממשטח merozoite, חלבונים ידועים להיות מטרות אנטיגני של חסינות מלריה 13. לאחרונה מעכבי פרוטאז ציסטאין טרנס Epoxysuccinyl-L-leucylamido בוטאן (4 guanidino-) (E64) נעשה שימוש כדי ליצור merozoites קיימא. E64 מונע קרע schizont, שהניבו merozoites קרום סגור 14, שיכול להיות מופר על ידי סינון לשחרר merozoites קיימא 15, 16. טכניקה זו תוביל לרזולוציה מרחבית של חלבונים רבים במהלך הפלישה כדורית אדומה 15, 17-19 והבהירה את ההשפעה הספציפית השלב של כמה תרופות נגד מלריה 16, 20. עם זאת, הדור של merozoites קיימא נותר מאתגר מבחינה טכנית. כדי לסייע בהפצה של טכניקה זו ויישום למבחנים תפקודיים של חסינות, פרוטוקול מפורט לטיהור קיימא merozoite והשימוש בם בassay הסטנדרטי הפונקציונלי של נוגדן: שיתוף פעולה סלולארי בopsonization וphagocytosis מתואר כאן. טכניקה זו מדגימה התקדמות משמעותית לעומת מבחני קודמים במבחנה של opsonization merozoite, כגון פרץ נויטרופילים נשימה, תלוי נייד עיכוב הנוגדן (ADCI), ומבחני phagocytosis merozoite חלופיים. מבחני אלה הם גרועים לשחזור עקב וריאציה בתשומות טפיל ואת פעילותם של תאים ראשוניים phagocytic 11, 21. hemozoin לזהם גם עשוי מאוד להשפיע על תפקוד התא בלען 22. Assay phagocytosis merozoite חזק לשעתק דיווח לאחרונה 23 מנצל את שורת תאי promonocytic THP-1 24. זה סוג תא אידיאלי עבור מבחני זרימת cytometry תפוקה גבוהה כפי שהוא לא חסיד ובמיוחד מבצע phagocytosis FC-קולטן בתיווך 25, 26. מורכבות נוספות בזמן investigating phagocytosis הוא שהתואר של phagocytosis תלוי במספר merozoites ביחס לTHP-1 תאים וריכוז בפלזמה. כדי להבטיח שחזור בין ניסויים, צריך להיות מנת merozoites וריכוז מוגדר בשימוש. בשל גודלם הזעיר, לזרום כימות cytometric נדרש. ההליך המתואר כאן מסיר hemozoin ומייצר merozoites קיימא, ומתאר את היישום של merozoites אלה לספירת התזרים cytometric של merozoites אחרי opsonization וphagocytosis. למרות תובעני מבחינה טכנית, הטכניקות המתוארות עשויות להיות שימושיות בהבהרת התרומה של תגובות נוגדנים ספציפיות למשטח merozoite נרכש באופן טבעי וחיסון מושרה חסינות.

<table><tbody><tr><td>קו תאים THP-1</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td> <td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפתואתנול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250-100ML</td><td>שימוש בעט</td></tr><tr><td>/תמיסת סטרפטוקוקוס אדים (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>תרבית תאים בדרגת תרבית תאים</td></tr><tr><td>היפוקסנטין</td><td>קלביוכימים</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי&nbsp;</td><td>תרומה מהצלב</td><td></td> האדום האוסטרלי <td>זמין מסחרית (כלומר Invitrogen)</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Pfizer</td><td>61022027</td><td>איכות הזרקה</td></tr><tr><td>הפרין נתרן BP (5000 IU/ml)פייזר</td><td></td><td></td> <td>מקור חזיר</td></tr><tr><td>בלסטיצידין S-הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 מעכב פרוטאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>השתמש עבור מאגר פוספט</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H20</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>השתמש עבור מאגר פוספט</td></tr><tr><td>תמיסת אזור אאוזין מתילן כחולה של Giemsa</td><td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>דילול 1:10 במאגר פוספט של 6.7 mN (לרענן כל כתם)</td></tr> <tr><td>מלח דיסודיום EDTA</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>מסנני מזרק Acrodisc 1.2-&mu; m/32 מ"מ</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>מפריד QuadroMACS (לעמודה קטנה)</td> <td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>ניתן להחלפה עם MidiMACS&nbsp;</td></tr><tr><td>מפריד VarioMACS (לעמודות גדולות)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>עמודה LS (עמודה מגנטית קטנה)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>עמודה מגנטית גדולה</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>ביו-ראד</td><td>1510433</td> ספירה <td>ציטוטוקסיתחרוזי</td></tr><tr><td>ספירה מוחלטת בהירה</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSציטומטר זרימה של קליבור עם קורא צלחות HTS</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח ציטומטריה FlowJo</td><td>כוכב</td><td></td><td></td> עץ</tr></tbody></table>

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; falciparum plasmodium</em&gt; merozoites לשימוש בopsonizing נוגדן מבחני

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

אנטיגנים merozoite falciparum Plasmodium נמצאים בפיתוח כחיסון למלריה פוטנציאלית. היבט אחד של חסינות מפני מלריה הוא הסר של merozoites החופשי מהדם על ידי תאי phagocytic. עם זאת הערכת היעילות התפקודית של נוגדנים ספציפיים opsonizing merozoite היא מאתגרת בשל זמן מחצית החיים קצרים של merozoites וההשתנות של תאי phagocytic עיקריים. תאר בפירוט במסמך זה שיטה ליצירה merozoites קיימא באמצעות מעכבי פרוטאז E64, וassay של merozoite phagocytosis opsonin תלוי באמצעות שורת התאים פרו monocytic THP-1. E64 מונע קרע schizont תוך מתן אפשרות לפיתוח של merozoites אשר שוחרר על ידי סינון של schizonts טופל. merozoites רומיד Ethidium שכותרתו opsonized עם דגימות פלזמה אנושיות, והוסיף לTHP-1 תאים. Phagocytosis נבחנים על ידי פרוטוקול תפוקה גבוהה סטנדרטי. merozoites קיימא הוא משאב יקר ערך להערכת numerהיבטים מפוקפקים של פ הביולוגיה falciparum, כולל הערכה של תפקוד מערכת החיסון. רמת נוגדנים שנמדדה על ידי assay זה קשור עם חסינות קלינית למלריה באנשים שנחשפו באופן טבעי. Assay יכול להיות גם שימוש להערכת נוגדני חיסון מושרה.

שלב ההבשלה של טפילים לפני טיפול E64 הוא קריטי ליצירה merozoites מוקף קרום. איור 1Ai מציג את שלב ההבשלה המתאים של schizonts להוספת E64. הטפילים צריכים להיות גדולים וכמעט למלא את תא הדם האדום. מראה מנומר של כתם Giemsa מציין merogony החל, ויש להוסיף E64 להניב merozoites מוקף קרום (איור 1Aii). אם E64 הוא הוסיף קודם לכן לtrophozoite טפילי במה, merozoites המוקף הקרום לא נוצרים גם לאחר 12 שעות של E64. במקום טפילים לקחת על מורפולוגיה חריגה כגון הגדלה של vacuole העיכול (איור 1Bi ו1Bii), וmerozoites לא נוצרים. אם E64 הוא הוסיף מאוחר יותר לschizonts, merozoites מוקף קרום לא נוצרים כקרע schizont חסר עכבות (איור 1Ci ו1Cii). רמה גבוהה של תיאום טפיל נדרש, אחרחכם טווח של כל שלוש התוצאות שתוארו יהיה לראות לאחר טיפול E64. הסרת hemozoin היא עוד צעד קריטי עבור merozoites לטיהור. אם merozoites אינו מטוהרים מhemozoin אז אשכולות merozoite-hemozoin צורה שלא ניתן וחילצה ידי pipetting. אגרגטים אלה לרוץ על cytometer כאירועים בודדים, אם כי עם מאפיינים צופה פני פיזור ותופעות פיזור שונים מmerozoites אחת, וכתוצאה מספירת merozoite לא מדויקת על ידי cytometry זרימה (איור 2 א). כTHP-1 תאים יכולים גם phagocytose hemozoin, יכולים גם להיות phagocytosed אשכולות merozoite-hemozoin אלה (איור 2). אגרגטים אלה ניאון EtBr מאוד כפי שהם מכילים merozoites מרובה. Phagocytosis של תוצאות אגרגטים במקבילים פרופיל הקרינה EtBr THP-1 לזה שנצפה עבור phagocytosis של merozoites הבודד מרובה. לפיכך, אם hemozoin לא הוסר, הקרינה EtBr של THP-1 תאים תהיה overestimate של פוטנציאל opsonizing לפלזמה הנבדקת. Hemozoin הוא דיווח גם לשנות את תפקוד תא בלען באופן משמעותי. merozoites GFP החיובי הם מוכתמים דלפק עם EtBr להגדיל את ההדמיה של merozoites phagocytosed ידי THP-1 תאים. שימוש בתנאים שתוארו בפרוטוקול זה, כל merozoites GFP החיובי הם counterstained עם EtBr שבו יש עוצמת הקרינה בהירה (איור 3 א). הערכת Phagocytosis ידי הקרינה EtBr מאפשרת רזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite מאשר הקרינה ה-GFP (איור 3 ב). מספר merozoites הוסיף לassay יהיה לווסת את כמות phagocytosis נצפתה. מסיבה זו, ספירה מדויקת על ידי cytometry זרימה היא קריטית. הגדלת יחס של merozoites: THP-1 תגרום לדבקות המוגברת של merozoites לTHP-1 תאים בהעדר הפלזמה (איור 4 א). הגדלת merozoite: THP-1 יחסים גם תוצאות ph המוגברתגובות agocytosis כאשר merozoites הם opsonized (איור 4). Merozoite 4:1: יחס THP-1 מומלץ לתגובות phagocytic חזקות. באמצעות יחס זה, והדילול של פלזמה מצויינים, assay זה הוא מסוגל לפתור רמות נמוכות, בינוניות וגבוהות של נוגדני opsonizing. בין 0 ל 78 תגובות phagocytosis אחוזים נצפו באמצעות דגימות פלזמה PNG ומצבים האחרים שתוארו. תגובות כאלה מוצגות לאחרונה מקשרים עם חסינות קלינית שנרכשה באופן טבעי למלריה 10. איור 5 מראה דוגמאות של 4 הרבעונים של תגובות phagocytosis מאנשים PNG. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. עיתוי בנוסף E64 הוא קריטי ליצירה merozoites המוקף בממברנה. () Maturatio המתאים. שלב n של טפילי i) לפני טיפול E64, וii) merozoites מוקף קרום הופק לאחר 6 שעות של טיפול E64 (merozoites הסגור ב &#39;) קרום לא נוצרים אם E64 מתווסף לטפילים לא בשלה; i) trophozoites בשלב מאוחר, וii) לאחר 12 שעות של E64 (C) schizont קרע לא עכבות אם E64 מתווסף מפולחים מאוחר schizonts.; i) schizonts שלב המאוחר, וii) לאחר 6 שעות של E64. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הסרת Hemozoin היא קריטית כדי ליצור השעיה merozoite תא בודד. אגרגטים Merozoite-hemozoin הטופס הבא סינון של merozoites המוקף הקרום, אלא אם כן hemozoin מופרד מגנטי מmerozoites. () חלקות צופה פני פיזור וצד פיזור של merozoites עם hemozoin הוסרוhemozoin עודפים. ניתן phagocytosed אגרגטים (ב &#39;) Hemozoin-merozoite ידי THP-1 תאים. שקופיות ציטומגלווירוס ספין מוכתמות הבדל-מהיר של תאי THP-1 הודגרו עם הפלזמה PNG opsonized הכנות merozoite עם או בלי hemozoin. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. מכתים Ethidium רומיד מאפשר לרזולוציה מעולה של phagocytosis merozoite. Merozoites מטוהר D10-GFP הם counterstained עם EtBr כדי לשפר את עוצמת הקרינה. () Cytometry זרימת histrogram של merozoites מטוהר עם gating על merozoites GFP החיובי, וכתם נקודה מראה EtBr הקרינה בתוך אוכלוסיית ה-GFP מגודרת זה חיובי. (ב) פיזור קדימה לעומת GFP ופיזור קדימה לעומת EtBr של THP-1 תאים הבאים phagocytosis של merozoites ניאון הכפול GFP וEtBr. שערים היו ד<html> rawn המבוסס על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 merozoite:. יחס THP-1 משפיע על מידת phagocytosis נצפתה. (א) חמש merozoite: THP-1 יחסים מתוארים; 50:1, 20:01, 10:01, 4:1, 1:1. שליטה רק תאים מצביעה על הקרינה רקע עקב THP-1 תאים. הקרינה EtBr THP-1 עבור כל יחס מצויינים לmerozoites opsonized עם בריכה של הפלזמה PNG או עם פלזמה אוסטרלית nonimmune ממוצע הקרינה בעוצמה של THP-1 תאים לmerozoite שונה (ב &#39;):. THP-1 יחסים, וopsonization עם בריכה של הפלזמה PNG או פלזמה האוסטרלית nonimmune (ממוצע + SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ove_content &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. מגוון גדול של נוגדני opsonizing ניתן למדוד. Merozoites היה opsonized עם פלזמה מאנשים PNG וטופחו עם THP-1 תאים. ארבע תגובות phagocytosis נציג מוצגות. גייטס היו סגור המבוססת על תאי THP-1 עם merozoites ואין שליטת פלזמה, ומספרים מצביעים phagocytosis% לאחר הפחתה של תאי THP-1 עם שליטת פלזמה שאינה מחוסנת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק merozoites של Plasmodium falciparum טהורים בתנובה גבוהה לצורך כימות האופסוניזציה שלהם על ידי נוגדונים אנושיים. דבר זה מושג תחילה על ידי עיכוב של rupture של schizonts באמצעות E 64 כדי להפיק מבני merozoites עטופים בממברנה. בשלב השני, ה-merozoites החופשיים נאספים ולאחר מכן נצבעים ב-AUM bromide לצורך כימות; בשלב הסופי, ה-merozoites מדגגרים עם דגימות שונות של פלזמה אנושית ותאי THP-1 מונוציטים אנושיים.בסופו של דבר, ניתן להבדיל בין האופסוניזציה של המרוזואיטים על ידי דגימות שונות של פלסמה אנושית באמצעות ציטומטריה של זרימה. היתרונות של טכניקה זו על פני בדיקות קיימות של חסינות תפקודית למרוזואיטים של מלריה הם השימוש במרוזואיטים שלמים ותגובות פגוציטוזה חסונות וכמותיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה של המלריה, כגון מהי החשיבות של נוגדנים אופסוניזים ופגוציטוזה לחסינות נגד מלריה באנשים שחולבקו או כאלה שנחשפו למחלה באופן טבעי?הדמיה של טכניקה זו היא קריטית, שכן תזמון ה-E 64 חיוני כדי להבטיח את היווצרות ה-mezo. ומכיוון שהכנת mezo וספירתם הן תובעניות מבחינה טכנית, לאחר הפרדה מגנטית של Trophozoites של P falciparum בשלב מאוחר, יש להעריך את הבשלות של הטפילים על ידי קיבוע של מריחה דקה של טפילים ב-100% methanol למשך 10 שניות וצביעתם ב-Giemsa למשך שלוש דקות. יש לבחון את השקף הצבוע תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהטפילים ממלאים כמעט לחלוטין את תאי הדם האדומים ונראים בשלב ה-early schizont.אם הטפילים לא הגיעו לשלב ההבשלה המתאים, יש להמשיך לדגרה עד שיפתחו כראוי. ברגע שהגיעו לבשלות מתאימה, יש לטפל ב-schon המבודדים ב-10 micromolar E 64 ולדגרה למשך שש עד 10 שעות נוספות. לאחר הדגרה עם E 64, יש להכין משטח של הטפילים המטופלים.קבעו את השקופית ב-100% methanol וצבעו אותה ב-Giemsa כדי לאשר שלפחות 50% מהטפילים פיתחו ממבנה. צנטריגו את המשקע של שאר תרבית ה-E 64 למשך שמונה דקות ב-1900 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הטפילים ב-50 milliliters בטמפרטורת החדר.שטפו בתמיסת שטיפה כדי להסיר שאריות של סרום אנושי. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את משקע הטפילים בשני מיליליטר של תמיסת שטיפה, ולאחר מכן סננו את תגלי המבנה דרך מסנן מזרק של 1.2 מיקרומטר, תוך איסוף ה-maites וגבישי ה-hemon לשפופרת של 10 מיליליטר. לאחר מכן, חברו עמודה מגנטית קטנה למגנט והגיעו לשיווי משקל עם 500 מיקרוליטר של מצע THP one.העבירו את התסננת דרך העמודה המגנטית שלוש פעמים, תוך כדי איסוף המגנטים במי effluent (שבירת הזרימה) בכל פעם. לאחר מכן, שטפו את העמודה עם שני מיליליטרים של THP one בטמפרת החדר כדי לאסוף את כל המגנטים שנותרו.הסרת ההמין היא שלב קריטי לטיהור המאיטים. אם המאיטים לא יופרדו מההמין, ייווצרו צבירי מאיט-המין, מה שיוביל לספירה לא מדויקת של המאיטים באמצעות ציטומטריית זרימה. תאי THP-1 יכולים לבצע פגוציטוזה של המין, כך שצבירי מאיט-המין עשויים להיבלע גם הם.לפיכך, אם ההמין לא יוסר, גם הפוטנציאל האופסוניזטורי של הפלסמה הנבדקת יוערך ביתר. צבעו את ה-maites שנאספו ב-10 micrograms per milliliter של אג'י ברומיד בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור. לאחר 30 דקות, סבבו את ה-maites בצנטריפוגה, השליכו את supernatant למכל פסולת מתאים, ושטפו את משקע ה-maite ב-four milliliters של מצע THP one pellet maites.לאחר מכן, השהו את התאים ב-15 milliliters של מצע TP one תוך הגנה מאור. לצורך כימות ה-maites באמצעות ציטומטריית זרימה, ספרו את ה-maites בדילולות של 1:100, 1:50 ו-1:25.ראשית, העבירו 940, 930 ו-910 מיקרוליטר של PBS בתוספת BSA לשלוש מבחנות FACS שונות והוסיפו לכל מבחנה 10, 20 ו-40 מיקרוליטר של maites מופרשים, בהתאמה. לאחר מכן, ערבבו במערבב (vortex) חרוזי ספירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של החרוזים לכל מבחנת FACS המכילה את ה-maites המדוללים. הריצו את שלושת דגימות ה-maite המדוללים בציטומטר זרימה המצויד בלייזר של 488 ננומטר, תוך הגדרת שער (gate) מחמיר ל-maites בהתבסס על שער פלואורסצנציה כפול של atherium bromide ו-GFP, הגדירו את החרוזים בערוץ נפרד ואספו אירועים עד שייאספו 2000 חרוזים.כדי לכמת את מספר ה-maites בכל דילול, חשבו את הממוצע של שלוש מדידות ריכוז ה-maites. לאחר מכן, השעיקו מחדש את ה-maites בריכוז של 8×10⁶ maites למיליליטר במצע THP one, כדי להבטיח יחס סופי של 4 maites לכל תא THP one למדידת הפגוציטוזה של ה-maites. ראשית, שקעו מספיק תאי THP one עבור הבדיקה והשעיקו אותם מחדש בריכוז של 6.7×10⁵ תאים למיליליטר במצע THP one.בשלב הבא, העבירו 150 microliters של תאי THP-1 לכל באער, בשלוש חזרות לכל תנאי לבדיקה, לתוך פלטת 96 באערים עם תחתית בצורת U שנחסמה באמצעות FCS, בריכוז סופי של 10⁵ תאים לבאער. הניחו את הפלטה באינקובטור עד למועד הוספת המקרופאגים. לאחר מכן, הוסיפו 150 microliters של המקרופאגים המבודדים בריכוז של 8×10⁶ milliliters לבאער, לתוך פלטת 96 באערים נפרדת עם תחתית בצורת U שנחסמה באמצעות FCS, בבאער אחד לכל תנאי לבדיקה.הוסיפו 10 µL של דגימות פלזמה מהולות שהוכנו לכל באר ב-maites, תוך ערבוב יסודי כדי להבטיח תמיסה הומוגנית. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסות פלזמה מה-maite לכל באר בלוח THP one, בשלוש חזרות עבור כל דגימת פלזמה הנבדקת. ערבבו היטב את הדגימות ולאחר מכן הדגרימו את תרביולי השיתוף (co-cultures) כשהם מכוסים, בתוך אינקובטור לח במטמפטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.לאחר 40 דקות, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה שקוללה מראש כדי לעצור את הפגוציטוזה. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים בבופר fax קר בקרח; לאחר השטיפה השנייה, קבעו את התאים ב-90 microliters של מקבע fax והשאירו אותם על קרח.יש להגן מאור עד לרגע הרכישה. שלב הבשלות של הטפילים לפני הטיפול ב-E 64 הוא קריטי ליצירת maites עטופים בממברנה. על הטפילים להיות גדולים, למלא כמעט את תא הדם האדום ולהראות צביעת Gems מנוקדת.הוספת E 64 בשלב זה תניב maites עטופים בממברנה לאחר דגירה של שש עד 10 שעות. אם E 64 יתווסף בשלב מוקדם יותר לטרופוזואיטים, לא ייווצרו maites עטופים בממברנה. אם E 64 יתווסף מאוחר יותר, השכימה (rupture) לא תעוכב.נדרשת רמה גבוהה של סנכרון טפילים. אחרת, ייראו טווח של כל שלושת התוצאות המתוארות לאחר טיפול ב-E 64. מדידת פגוציטוזה באמצעות פלואורסצנציית aum bromide מאפשרת רזולוציה גבוהה יותר של פגוציטוזת הטפילים מאשר פלואורסצנציית GFP לבדה. הגדלת היחס בין maites לתאי TP one גורמת להגברת ההיצמדות של ה-maites לתאי THP one.בהיעדר נוגדנים ספציפיים ל-maite, הגדלת היחס בין MEITE לתאי THP-1 גורמת גם היא לעלייה בפגוציטוזה שבין 0% ל-78%. אופסוניזציה של maites נצפתה בשימוש בדגימות פלזמה מפפואה גינאה ביחס של 4:1 בין MAITE לתאי THP-1. נתונים אלה מציגים דוגמאות לארבעילי התגובות החומציות של PHA מארבעה אנשים נבחרים מפפואה גינאה. הוכח כי נוגדנים אופסוניזטורים שנמדדו באמצעות בדיקה זו קשורים לחסינות קלינית למלריה בעת ביצוע פרוצדורה זו.הנקודות המרכזיות שיש לזכור כדי להבטיח פגוציטוזה מוצלחת הן השגת טפילים מסונכרנים מאוד כדי לקבל מרוזואים בשלים לחלוטין ושלמים, ושמירה נכונה של תרביות תאי THP-1. את הטכניקה לטיהור מרוזואים המתוארת בפרוטוקול זה ניתן להתאים לכל יישום הדורש מרוזואי מלריה באיכות גבוהה, כגון בדיקות זונינג, פלישה, פרוטאומיקה או סרולוגיה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש בשיטת E 64 לטיהור מרוזואים ולחקור נוגדנים אופסוניזים על ידי מדידת פגוציטוזה על ידי תאי THP-1.

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך...

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

סרטון זה מדגים בדיקת פאגוציטוזיס מבוססת ציטומטריה של זרימה הכוללת אריתרוציטים נגועים בפלסמודיום פלציפרום מסומנים ואופסוניים על ידי מונוציטים. ציטומטריית זרימה מזהה פלואורסצנטיות במונוציטים, המאשרת את הזיהוי המוצלח של אריתרוציטים opsonized באמצעות phagocytosis.

בדיקה לכימות פגוציטוזה בתיווך נוגדנים של אריתרוציטים נגועים בטפילים

את המאפיינים של פאראמגנטיים hemozoin משמשים כדי לבודד שלבים מאוחרים...

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

ביטוי של חלבוני מלריה במערכות תא מבוסס נותר מאתגר. אנו מדגימים שתי מערכות ביטוי תא חופשי צעד וIVT צעד אחד (בתרגום חוץ גופית) לביטוי חלבוני rhoptry רקומביננטי מלריה מתאי הלה. אנו משתמשים במערכת לטיהור מבוססת זיקת Ni-שרף לטהר את חלבוני rhoptry.

מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum.  בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

למדו שיטה לטיהור תשואה גבוהה של Plasmodium falciparum merozoites לשימוש במבחני נוגדנים אופסוניזציה. השיטה משתמשת ב-E64 וציטומטריית זרימה לכימות פאגוציטוזה תלוית נוגדנים.

טיהור תשואה גבוהה של

גלה סרטונים נוספים