Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות ברמה האולטרה-מבנית של מדורי האנדוזומים בשמרים מסוג Saccharomyces cei. מטרה זו מושגת על ידי הכנת Sphera plast של שמרים, אשר עוברים לאחר מכן קליטה אנדוציטית של ננו-חלקיקי זהב בעלי מטען חיובי. בשלב שני, הדגימה מקובעת ונחתכת כדי לקבל חתכים קריוגניים דקיקים של התאים.

בשלב הבא, נתחי הקריו (cryo sections) עוברים תגובת הגברת כסף (silver enhancement). על מנת להגדיל ולהדגים את חלקיקי ננו-זהב טעונים חיובית שעברו אנדוציטוזה, מתקבלים תוצאות המראות את המורפולוגיה של מדורי האנדוזומים השונים בשמרים, בהתבסס על הסימון הספציפי של הליך זה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון ImmunoGold של נתחים, הוא שאינה היא נשענת על נוגדנים, שלעיתים קרובות אינם פועלים בהכנות למיקרוסקופיה אלקטרונית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המערכת הליזוזומלית של השמרים sarchi ESIS vei, ניתן להחילה אותה גם על מודלים אוקריוטיים אחרים, כגון שמרים אחרים ותאי יונקים. השמרים מהם יוכנו ה-Sphero Plast מודגרים תחילה למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C ב-10 mL של המצע המתאים, כפי שנקבע בתכנון הניסוי ליום למחרת. לאחר מדידת הצפיפות האופטית של התרבית באורך גל של 600 nm, יש לדלל את התאים באותו מצע גידול עד ל-OD 600 של 0.2 עד 0.4.

גדלו את התאים עד לשלב צמיחה אקספוננציאלית עם OD 600 של 1 עד 2, העבירו מקבילי OD 600 של 10 של תאים למבחנה של 50 מיליליטר וסובבו בצנטריפוגה ב-2100 Gs למשך חמש דקות. לאחר הסבוב בצנטריפוגה, השליכו את supernatant ותלו את משקע התאים בחמישה מיליליטר של 100 millimolar pipes ו-10 millimolar dihi three ב-Hall, דגרו ב-30 °C למשך 10 דקות. אספו את התאים באמצעות סבוב בצנטריפוגה.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעה את התאים בחמישה מיליליטר של מצע המכיל sorbitol בריכוז 1 M וחמישה מיליגרם של אנזים ליטי. דגרי את התערובת בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור עדין למשך 30 דקות. סבב במערכת צנטריפוגה את תרחיף התאים ב-300 Gs למשך חמש דקות כדי לאסוף משקע (pellet) התואם לספרופלסטים (Spheroplasts).

שפכו את הנוזל העליון ותלו את הספרופלסטים מחדש ב-960 µL של מצע קר בקרח המכיל sorbitol בריכוז 1 M. העבירו את התערובת לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL קרה בקרח. כדי להתחיל את הליך הספיגה של ננו-זהב, השתמשו בפיפטה ועזבנו בעדינות את הספרופלסטים עם חלקיקי ננו-זהב בעלי מטען חיובי.

יש להשעות את התאים ב-40 µL של מים. הנפח הסופי של התערובת חייב להיות 1 mL. יש להניח את סספנסיית התאים שהתקבלה על קרח למשך 15 דקות.

העבירו את התרחיף לטמפרטורת החדר והדגירו למשך הזמן הנדרש כדי לאפשר התכנסות (internalization) של ננו-זהב לתאים באמצעות אנדוציטוזה. כאשר ספיגת הננו-זהב הרצויה הושלמה, עצרו את התגובה על ידי הוספת מיליליטר אחד של מקבע בריכוז כפול המכיל sorbitol בריכוז מולרי אחד למשקע התאים. השאירו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

הפוך בעדינות את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה ידנית מספר פעמים במהלך 30 הדקות כדי לשמור על ה-PHE plast והסספנזיה. לאחר מכן, בצע צנטריפוגה פעמיים ב-1700 Gs למשך 25 שניות, השלף את הסופרנאט והוסף 1 mL של מקבע בריכוז סטנדרטי המכיל 1 M sorbitol; דגור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על גלגל סיבוב איטי. לאחר מכן, התאים מעובדים ונחתכים בשיטת קריו-סקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני תחילת הליך זה, הוצא את ערכת הגברת הכסף מהמקפיא והפשר באינקובטור של 37 °C. הנח את הערכה המופשרה באינקובטור שולחני של 24 °C שהוצב מראש בחדר חשוך עד לשימוש.

הניחו פלטת חימום בחדר חשוך וחממו אותה עד לטמפרטורה סופית של 24 degrees Celsius. כסו את החלק העליון של פלטת החימום במגן משטח למשחב, כאשר הצד המבריק פונה כלפי מעלה, ואבטחו אותו בעזרת סרט דביק. הניחו para film על מגן השטח וסמנו את הקצוות בטוש שחור כדי לאפשר את זיהוים בחשכה.

הדביקו מדחום לחלקו העליון של מגן המשטח. כדי לנטר את הטמפרטורה של פלטת החימום, כווןו את הטמפרטורה בהדרגה. אם היא אינה 24 °C, הניחו מבחנה בנפח 50 mL המכילה מים מזוקקים פעמיים.

בתוך האינקובטור, מלאו צלחת פטרי קטנה במים מזוקקים פעמיים, שחוממו מראש ל-37 degrees Celsius. הניחו שתי רשתות ניקל עם נתחי הקריו (cryo sections) בתוך המים, כאשר צד הדגימה פונה כלפי מטה, למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, מלאו צלחת פטרי שנייה במים מזוקקים פעמיים שחוממו מראש, והניחו את אותן שתי רשתות ניקל במים למשך 30 דקות נוספות.

שטפו שוב את הרשתות על ידי העברתן, כאשר צד הדגימה פונה כלפי מטה, מעל מספר טיפות של מים מזוקקים פעמיים בטמפרטורה של 24 degrees Celsius שהונחו על ה-parfum המקובע על לוח החימום. ודאו שתשע טיפות נוספות של מים מזוקקים פעמיים מוכנות על ה-parfum לשטיפה לאחר תגובת הגברת הכסף. בשלב זה של הפרוטוקול, יש לכבות את כל האורות בחדר החשכה ולהדליק את האור האדום.

עם זאת, לצורכי הצילום בלבד, האור יישאר דלוק. בהדגמה זו, הוצא את תמיסות a ו-B של ערכת הגברת הכסף (silver enhancement kit) מהאינקובטור בטמפרטורה של 24 degrees Celsius אל תוך מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח של 1.5 milliliter; הוסף שש טיפות של תמיסה A, ולאחריהן שש טיפות של תמיסה B, וערבב היטב בעזרת פיפטה מזכוכית תוך הימנעות מיצירת בועות. ערבב את התמיסה באמצעות וורטקס.

החזירו לזמן קצר את התמיסות a ו-B לאינקובטור בטמפרטורה של 24 °C והוציאו את תמיסה C. הוסיפו שש טיפות של תמיסה C לתערובת AB. ערבבו שוב באמצעות פיפטה פסטורי, ולאחר מכן בביצוע וורטקס, תוך הימנעות מיצירת בועות.

השתמש בתערובת סופית זו באופן מיידי. הנח טיפות על הפרפורם באמצעות זוג פינצטות נקיות ואנטי-מגנטיות. הנח את הרשתות על התערובת.

זוהי תגובת הגברת הכסף. השאירו את הרשתות למשך שש עד 15 דקות, בהתאם לרמת ההגברה הרצויה עבור הניסוי. הוציאו את הרשתות מהתערובת והעבירו אותן במהירות דרך רצף של שש טיפות מים מזוקקים פעמיים שהונחו על Perfil בטמפרטורה של 24 °C עבור שלושת השטיפות האחרונות.

השאר את הרשתות למשך שבע דקות לכל טיפת מים. אם מבוצע ניסוי אמיתי, הדלק שוב את האורות עם סיום השטיפה. לאחר מכן, התוצאות מוצגות באמצעות סימון ImmunoGold או צביעת ממבנה לצורך בדיקת EM.

ניתן לסמן סוגים שונים של מדורי אנדוזומים בשמרים באמצעות ננו-זהב מועצם בכסף ולהדמיאם במיקרוסקופיה אלקטרונית. ספיגה של ננו-זהב במשך חמש דקות מסמנת את ממברנת הפלזמה ומדורי אנדוזומים מוקדמים, כגון שלפוחיות בודדות, שעשויות להיות שלפוחיות אנדוציטוטיות, ומבנים צינוריים, שהם ככל הנראה אנדוזומים מוקדמים. אינקובציה עם ננו-זהב למשך 30 דקות מובילה לסמימנם של אנדוזומים מאוחרים או גופי רב-שלפוחית (multivesicular bodies).

כוח הרזולוציה של שילוב הליך של מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית עם פרוטוקול הגברת ננו-זהב-כסף זה מודגש על ידי שימורם ואיכותה של המורפולוגיה של האבייים המוצגים, ובמיוחד, השלפוחיות הפנימיות של הגופים הרב-שלפוחיתיים. לפני שימוש בשיטת הגברת הכסף, יש לבצע ניסוי חלוץ כדי לקבוע את זמני האינקובציה האופטימליים הדרושים הן לגודלן והן לאחידותן של חלקיקי כסף אלו. בהתאם להליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון סימון אימונולוגי, כדי לענות על שאלות כגון לוקליזציה של חלבון מסוים למדור ספציפי תחת ה-mar.