Name: Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד שיטת תיוג ננו-זהב לניתוח מבני של תאי שמרים Saccharomyces cerevisiae ברמת אולטרה-מבנה. הפרוטוקול מאפשר הדמיה משופרת של מדורי אנדוזום ללא שימוש באנטיגנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים רנה Scriwanek לסיוע בהכנה של איור. FR נתמך על ידי ECHO (700.59.003), תכנית alw הפתוחה (821.02.017 ו822.02.014), שיתוף הפעולה DFG-NWO (DN82-303) וZonMW VICI (016.130.606) מענקים.

1. Spheroplast הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה השמרים 30 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של המדיום המתאים נקבע על ידי העיצוב של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום אחרי, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות פוטומטר, לדלל תאים באותו מדיום תרבות 600 OD של 0.2-0.4 ולגדל אותם לשלב גידול מעריכי, אלא אם כן את העיצוב של ניסוי דורש תנאים שונים. תאים נמצאים בשלב מעריכי כאשר התרבות יש OD 600 של 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 OD 600 שווה של תאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות בצינור 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של 100 צינורות מ&quot;מ (pH 9.6), 10 dithiothreitol מ&quot;מ וטופחו ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שוב את התאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים in 5 מיליליטר של מדיום (שנקבע על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל 1 M סורביטול ו5 מ&quot;ג של אנזים ממס, ודגירה את התערובת על 30 ° C עם הרעד עדין למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא XG 300 5 דקות כדי לאסוף את החלק יחסי גלולה, אשר תואם את spheroplasts. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts ב960 μl של תקשורת קרה כקרח (נקבע בינוני על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל סורביטול 1 M ולהעביר את התערובת לקרה כקרח 2 מיליליטר צינור microcentrifuge. </li></ol> 2. Nanogold ספיגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, לערבב בעדינות spheroplast עם 4 nmol של חלקיקים בעלי מטען חשמלי חיוביים nanogold resuspended ב40 μl מים. הנפח הסופי של התערובת צריך להיות של 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההשעיה התא שהושגה על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה בטמפרטורת חדר והדגירה אותו לזמן הנדרש כדי לאפשר הפנמת nanogold באמצעות דוארndocytosis. הערה: ספיגת 5 דקות בעיקר תוביל לתיוג של שלפוחית ​​endocytic ומדורי endosomal מוקדם, תוך ספיגת 15 דקות תאפשר לסמן את מערכת כולה endosomal (מוקדם וendosomes המאוחרת). פעמים דגירה ארוכות יותר (יותר מ 30 דקות) גם תאפשר לתייג vacuole. הערה: לא ניתן לבצע ניסויי תיוג Pulse-מרדף עם שיטה זו. לכן, כאשר התיוג לניתוח של LE, nanogold יהיה נמצא גם באתר ראש הממשלה וinEE. </li></ol> 3. קיבוע וחתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את ספיגת nanogold על ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כפול כוח [paraformaldehyde 4% (PFA), glutaraldehyde 0.4% (GA) במאגר M 0.1 PHEM (20 צינורות מ&quot;מ, 50 HEPES מ&quot;מ, pH 6.9, 20 מ&quot;מ EGTA, 4 מ&quot;מ MgCl 2)] המכיל סורביטול M 1 עד ההשעיה התא. שמר את הצינור בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך ידני את צינורות micocentrifuge מספר פעמים במהלך 30 דקות (זה יאפשר לשמור spheroplasts בהשעיה) ואז צנטריפוגות אותו פעמיים ב1,700 XG במשך 25 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מקבע על ידי השלכת supernatant ועל ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כוח סטנדרטי טרי (2% PFA, 0.2% GA במאגר M 0.1 PHEM) מכיל 1 סורביטול M ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר על גלגל מסתובב באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את התאים לcryo-חתך כפי שתואר לעיל 6. הערה: לקבלת נהלי שיפור ספיגת nanogold וכסף, הטיפול בחומצה התקופתית שתוארה בפרוטוקול שצוין לא שיש לבצע. הטיפול בחומצה התקופתית הוא permeabilize דופן תא 26 טוב יותר אבל המבנה הזה כבר בוטל בדור של spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 50 cryosections הדק ננומטר ב-C ° -120 עם סכין יהלום יבש באמצעות ultramicrotome UCT כפי שתואר בעבר 8 ומניח אותם על פחמן Formvar המצופה 50 משתלב רשתות ניקל. </li></ol> 4. כסף שיפור לNanogold החלקיקים visualization הערה: ההליך להכנת תערובות התגובה הוא בעצם אחד שצוין על ידי היצרן. עיבודים מעשיים באמצעות פרוטוקול זה, הופך את הליך שיפור הכסף יעיל ואמין על cryosections. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ערכת שיפור כסף מהמקפיא ולהפשיר אותו ב37 מעלות צלזיוס חממה או אמבט מים. כשהפשיר, הנח את הערכה בחממה 24 ° C להציב לתוך חדר חשוך עד לשימוש (ראה 4.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת החימום בחדר החשוך ולחמם אותו לטמפרטורה הסופית של 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החלק העליון של צלחת חימום עם מגן פני השטח, צד מבריק, ולאבטח אותו עם קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את Parafilm על Benchkote ולסמן את הקצוות עם טוש שחור כדי להיות מסוגל לראות את קצות Parafilm בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת מדחום בחלק העליון של Benchkote לנטר את הטמפרטורה של פלטת החימום. בהדרגה להתאים את הטמפרטורה אם לא 24 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plaלסה&quot;נ צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים כפולים וערכת שיפור כסף בפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את צלחות פטרי קטנות עם מים מזוקקים פעמיים, חימם מראש על 37 ° C. הנח את הרשתות במים, הדגימה צד למטה, ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עוד פעם אחת 4.7 שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשתות בקופסא האחסון ולהביא אותם לחדר החשוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרשתות שוב על ידי עובר אותם (עם צד הדגימה למטה) על כמה טיפות של מים מזוקקים פעמיים ב24 ° C מונחות על Parafilm שתוקן על צלחת החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי 9 טיפות מים נוספות מזוקקים כפולות מוכנות בParafilm, לשטיפה לאחר תגובת שיפור כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור ולוודא שכל האורות כבויים. כבה את האור האדום על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פתרונות A ו-B של ערכת שיפור כסף מן החממה 24 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 6 טיפות הראשונות של הפתרון ולאחר מכן 6 טיפות של תמיסת B ב1.5 מ &#39;צינור l microcentrifuge, ולערבב היטב עם זכוכית פיפטה פסטר הימנעות לעשות בועות. הפתרון הוא די עבה ויש לו להיות מעורב באופן ידני עם טפטפת לפני סוף סוף vortexing את זה בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את פתרונות A ו-B בחזרה בחממת 24 ° C ולהוציא את פתרון C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 טיפות של תמיסת C ל/ B התערובת. אז לערבב שוב ראשון עם פיפטה פסטר ולאחר מכן על ידי vortexing, להימנע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באופן מיידי את התערובת הסופית על ידי הצבת טיפות (~ 20 μl / ירידה) על Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פינצטה נקייה, אנטי מגנטית, הנח את הרשתות על התערובת (לדוגמא., תגובת כסף שיפור) במשך 6 עד 15 דקות בהתאם לשיפור (כלומר. הגודל של חלקיקי זהב) ביקש להתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשתות מהתערובת ולהעביר אותם בחלק העליון של המים מזוקקים פעמיים טיפות ב24 מעלות צלזיוס במשך שוטף. ראשית, להשתמש במהירות רצף טיפות 6 ולאחר מכן 3 טיפות עם 7 דקות זמן דגירה לכל טיפה, לפני שמפנה את האורות הדולקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב הבא, בין אם תיוג חיסוני זהב או מכתים קרום 27 כדי להמחיש את התוצאה לחקירת EM. </li></ol>

<ol><li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+pathway%3A+a+mosaic+of+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li>
<li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes%3A+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li>
<li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+imagination%3A+understanding+the+endo-lysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li>
<li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li>
<li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III%3A+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li>
<li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li>
<li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fab1p+PtdIns%283%29P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li>
<li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li>
<li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li>
<li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li>
<li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li>
<li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+contact+site+complex%2C+a+determinant+of+mitochondrial+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li>
<li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li>
<li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li>
<li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li>
<li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%2C+hexokinase%2C+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+gold+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

חיסוני אלקטרונים מיקרוסקופית הוא טכניקה המאפשרת שילוב של לוקליזציה של חלבונים עם הרזולוציה ultrastructural של הנשאים ואברונים שבו חלבונים אלה מתגוררים. זה חיוני במיוחד כאשר לומד את מערכת השמרים endosomal כי התאים שלה מופיעים מבני פיסוק כמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן קשה להבחין בהם. מסיבה זו השימוש בבדיקה לזיהוי על ידי EM ונכנסים למסלול endocytic באופן תלוי זמן הוא קריטי לאופן ספציפי לסמן endosomes השונות. סוג זה של בדיקה הוא בעל ערך על מנת להעריך את הפונקציונליות של אנדוציטוזה <s...

מערכת endosomal היא מנגנון קרום גדול שמיון משחק תפקידים סלולריים חיוניים רבים, כולל סחר בקולטנים מיון אנזים lysosomal והמחזור של קרום פלזמה (PM) קולטניים 1,2. Endosomes מחולקת בשלושה תאים שונים, כלומר. endosomes המוקדמת (EE), endosomes המאוחרת (LE) וendosomes המיחזור. סיווג זה מבוסס על המשך הזמן שלוקח לחומר endocytosed להגיע אליהם, על חלבוני סמן ספציפיים ועל המורפולוגיה שלהם. ממברנות, כלומר bilayers חלבונים ושומנים בדם, הפנימו מPM יכולים להיות מועברות לlysosomes באמצעות endosomes לשפלה או להיות ממוחזרות בחזרה. ממברנות גם מועברים לendosomes מGolgi ובאופן דומה, או להמשיך lysosomes או להאסף בחזרה לGolgi. יתר על כן, ניתן למיין חלבונים לתוך שלפוחית ​​luminal ניצנים פנימה מן קרום endosomal מגביל, תהליך שמוביל להיווצרות שלקטגוריית משנה של LE, גופי multivesicular. מערכת endosomal השמרים היא יחסית פחות מורכב מזו של תאי אוקריוטים גבוהים. endosomes שמרים מחולקות לEE ו LE. בניגוד לתאי יונקים הם אינם מכילים endosomes מחזור אלא גם אברונים הקשורות לליזוזום רקמות ספציפיות. כתוצאה מכך שיש להם רשת פחות מורכבת של נתיבי סחר endosomal 3,4. לכן שמרים ייצג ועדיין מייצג את מערכת ניסיונית יתרון ללמוד חלק מתנועת הממברנה הבסיסית העקרונות במערכת endosomal. יתרון זה מודגש על ידי העובדה כי גנים רבים המעורבים במסלולי endosomal היו מבודדים בתחילה עם מסכי גנטיים בשמרים 5. בעוד מערכת endosomal השמרים בסוג בר ותאים שעברו מוטציה, נחקרה בהרחבה שימוש בגישות מיקרוסקופית ביוכימי וקרינה, את חקירתה ברמת ultrastructural כבר רקמינימאלי. ניתוחים מורפולוגיים הם רלוונטיים במיוחד בשמרים, כי רוב האברונים endosomal מזוהים כמו מבני פיסוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר הופכים קשה זיהוי חד משמעי שלהם 6. למרבה הצער רק מספר מוגבל של נסיובי הכרת סמני חלבון השמרים endosomal הוא עובד באימונו אלקטרון מיקרוסקופיה הכנות (IEM) 7-10. לחלבונים מסוימים, בעיה זו כבר לעקוף על ידי התיוג אנדוגני של הגן של עניין והשימוש בנוגדן הכרת התג לזהות אותו 7,11,12. לעתים קרובות, לעומת זאת, חלבונים הם לגילוי על ידי IEM בגלל רמות הביטוי הנמוכה שלהם. ביטוי היתר שלהם הוא לא פתרון, כי גישה זו יכולה לגרום לאי - מגוירת ו / או שינויים במורפולוגיה / פונקציות אברון. כך התיוג של תאי endocytic עם בדיקה לזיהוי על ידי EM במיקרוסקופ אלקטרונים הוא אפשרות יעילה. זה פתרון אופטימלי במיוחד אם יחסי הציבורOBE הוא להיכנס למסלול endocytic באופן תלוי בזמן, המאפשר לדעת מתי זה יהיה סימן אברון ספציפי 6. הספיגה של nanogold הטעון חיובי על ידי spheroplasts שמרים (כלומר. שמרים שבו תא הקיר הוסר אנזימים) בהצלחה נעשתה שימוש כדי לזהות את שמרי endosomal מלתחות 10. חלקיקים אלה מאוד להיקשר לשומנים טעונים השלילי המרכיבים את הקרומים הביולוגיים. כך מקורבי nanogold הטעונים חיובי עם ראש הממשלה, חודרים את התא על ידי אנדוציטוזה ועוברים דרך EE וLE לפני שהגיע לvacuole. חלקיקי זהב הקטנים אלה, עם זאת, אין לי גודל מתאים כדי להיראות על ידי EM. כדי להבהיר להם גלויים, הגודל שלהם יכול להיות מוגדל על ידי תגובות כימיות שיובילו לתצהיר של כסף או זהב סביב חללית זהב 13-15. פיתחנו ויישמו בהצלחה גישת IEM מבוססים על שיטת Tokuyasu לבצע subcellularלוקליזציה לומדת 8,16. שיטה זו מאפשרת ביצוע תיוג immunogold על שמרי הכנות עם רזולוציה מצוינת של המורפולוגיה 8,17-24. יש לנו גם הקימו הליך שילוב פרוטוקול IEM זה עם תיוג nanogold של מערכת השמרים endosomal מלתחות 6. שימוש בגישה זו יש לי מורפולוגית מאופיינת subclasses שונה של endosomes וultrastructurally בדקה מוטנטים עם סחר endosomal פגם 6,25. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג nanogold זה יכול להיות משולב עם labelings immunogold מתן האפשרות לחקור את ההפצה של חלבון של עניין באוכלוסיות endosome השונות. כאן אנו מציגים כיצד התיוג של מערכת השמרים endosomal עם nanogold מטען החשמלי חיובי מבוצע כמעט.

<table><tbody><tr><td>PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, דרמשטאדט, גרמניה</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, דרמשטאדט, גרמניה</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merck, דרמשטאדט, גרמניה</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr>Nanogold Nanoprobes<td>טעון חיובית</td><td>, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>חנות ב-20 & deg; </td></tr><tr><td>C HQ-silver & ערכת שיפור</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>חנות ב -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 8% EM</td><td>grade Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>חנות ב-20 &deg; </td></tr><tr><td>C אנזים ליטי</td><td>MP Biomedicals, סנטה אנה, קליפורניה</td><td>153526</td><td>חנות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>רשתות ניקל 50 רשתות&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, בריטניה</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>סכין יהלום קריו-אימונולוגית 35&deg;</td><td>Diatome AG, ביל, שוויץ</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-מיקרוטום UCT&nbsp;</td><td>Leica, Solms, גרמניה</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 שרף</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 רשתות ניקל&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, בריטניה</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>קופסת אחסון רשתות</td><td>Leica, Solms, גרמניה</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות נימיות פסטר 150 מ"מ</td><td>Van Bruggen Glas, רוטרדם, הולנד</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, גרמניה</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת 50 מ"ל</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, הולנד</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>מגן משטח Benchkote</td><td>Whatman, Maidstone, בריטניה&nbsp;</td><td></td><td></td>1159201</tr></tbody></table>

nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח ultrastructural

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes אחד של הקרום הגדול מיון מחסומים בתאי אוקריוטים והם מווסתים מחזור או הרס של חלבונים בעיקר מקרום הפלזמה וGolgi. כתוצאה מכך מערכת endosomal ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס, ומוטציות בגנים השייכים לרשת זו של האברונים מחוברים על ידי תחבורת ועי, לגרום לפתולוגיות חמורות, כולל סרטן והפרעות הנוירוביולוגי. לכן זה רלוונטי ראש כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס קיום החיים והארגון של מערכת endosomal. שמרי Saccharomyces cerevisiae היה מרכזי במשימה זו. לתייג באופן ספציפי ולנתח ברמת ultrastructural מערכת endosomal של אורגניזם מודל זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לספיגת nanogold הטעונה חיובי על ידי spheroplasts אחריו ההדמיה של חלקיקים אלה באמצעות תגובת שיפור כסף. שיטה זו מדי יקר היא גםl לבחינה מורפולוגית של מוטציות עם מומים בסחר endosomal. יתר על כן, זה לא ישים רק לבחינות ultrastructural אבל זה גם יכול להיות משולב עם labelings immunogold לחקירות לוקליזציה חלבון.

על פי הפרוטוקול שהוצג, את המורפולוגיה של מערכת השמרים endosome יכולה להיות גישה על ידי א.מ. שידור. איור 1 מציג סוגים שונים של תאי endosomal שכבר הגיעו ולכן כותרתו עם nanogold. Nanogold משופר הכסף ניתן לראות באופן ברור כחלקיקים צפופים אלקטרונים. ההגדרות אופטימליות שהוקמו לשיפור תגובת הכסף מאפשרת שיש חלקיקי זהב בטווח גודל אחיד בין 5 ל -15 ננומטר, שאינו מפריע לultrastructure של תא השמרים. קרום פלזמה, כמו גם תאי endosomal המוקדמים נגישים לnanogold לאחר דגירה 5 דקות ב2...

שמרים, שמר האפייה, כבר אורגניזם מודל מפתח כדי לזהות וללמוד גנים המסדירים את קיום החיים ופונקציות של מערכת endosomal. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתיוג הספציפי של תאי endosomal ללימודי ultrastructural.

Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות ברמה האולטרה-מבנית של מדורי האנדוזומים בשמרים מסוג Saccharomyces cei. מטרה זו מושגת על ידי הכנת Sphera plast של שמרים, אשר עוברים לאחר מכן קליטה אנדוציטית של ננו-חלקיקי זהב בעלי מטען חיובי. בשלב שני, הדגימה מקובעת ונחתכת כדי לקבל חתכים קריוגניים דקיקים של התאים.בשלב הבא, נתחי הקריו (cryo sections) עוברים תגובת הגברת כסף (silver enhancement). על מנת להגדיל ולהדגים את חלקיקי ננו-זהב טעונים חיובית שעברו אנדוציטוזה, מתקבלים תוצאות המראות את המורפולוגיה של מדורי האנדוזומים השונים בשמרים, בהתבסס על הסימון הספציפי של הליך זה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון ImmunoGold של נתחים, הוא שאינה היא נשענת על נוגדנים, שלעיתים קרובות אינם פועלים בהכנות למיקרוסקופיה אלקטרונית.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי המערכת הליזוזומלית של השמרים sarchi ESIS vei, ניתן להחילה אותה גם על מודלים אוקריוטיים אחרים, כגון שמרים אחרים ותאי יונקים. השמרים מהם יוכנו ה-Sphero Plast מודגרים תחילה למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C ב-10 mL של המצע המתאים, כפי שנקבע בתכנון הניסוי ליום למחרת. לאחר מדידת הצפיפות האופטית של התרבית באורך גל של 600 nm, יש לדלל את התאים באותו מצע גידול עד ל-OD 600 של 0.2 עד 0.4.גדלו את התאים עד לשלב צמיחה אקספוננציאלית עם OD 600 של

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.

סינתזה ישירה של ננו-חלקיקי זהב גלויים EM בתאים לניתוח לוקליזציה של חלבונים עם מבנה אולטרה שמור היטב

למד שיטת תיוג ננו-זהב לניתוח מבני של תאי שמרים Saccharomyces cerevisiae ברמת אולטרה-מבנה. הפרוטוקול מאפשר הדמיה משופרת של מדורי אנדוזום ללא שימוש באנטיגנים.

Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

גלה סרטונים נוספים