Name: גין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: למד שיטה יעילה לעריכת גנים בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ מותאמות אישית. הפרוטוקול מדגים מיקוד מדויק של טרנסגנים ללוקוס PITX3 לחקר התפתחות מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה המתוארת בפרוטוקול זה התאפשרה על ידי מימון מהממשלה ויקטוריאני, כחלק מברית של שיתוף פעולה עם מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (CIRM).

כל ההליכים מתבצעים בזרימה למינרית סטרילי. כל כלי התקשורת והפתרונים equilibrated ל37 ° C אלא אם צוינו אחרת. .1 הרחבת PSCs האדם (hESCs וhiPSCs, WA-09 שימוש בפרוטוקול זה) לTransfection הערה: אין צורך להרחיב את hESCs על Matrigel או Geltrex. hESCs הרחיב על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) יכול לשמש לelectroporation או nucleofection הבא צעד הסרת MEF (ראה סעיף 2.8). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 x 100 צלחת מ&quot;מ ובקבוק 1 x 75cm2 של MEFs DR4 ב2.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר בתקשורת MEF (ראה טבלה 1) על מנות מראש מצופה עם 0.1% w / ג&#39;לטין v. הערה: CF1, MEFs BLK6 או MF1 ניתן להשתמש, לעומת זאת, מומלץ שמשמשים קווים MEF עמידים לאנטיביוטיקה, למשל, DR410. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, hESCs מעבר על צלחת 100 מ&quot;מ מראש מצופה MEFs מוכן בסעיף 1.1. כדי לעשות ASPI זהשיעור תקשורת hESC ממנות תרבויות, לשטוף hESCs עם תמיסת מלח המאוזן Ca 2 + / Mg2 + -חינם &#39;הנקס (HBSS), להוסיף Dispase (ראה טבלה 2 כרכים מתאימים) ומקום בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. בעקבות 3-5 דגירה דקות, לשאוב Dispase ולשטוף בעדינות 1 - 2 פעמים עם HBSS להסיר MEFs. הוסף מדיה hESC (ראה טבלה 3) ובאמצעות מגרד תא, או פיפטה 5 מ&quot;ל, בעדינות לגרד מושבות את פני השטח של צלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את שברי המושבה בהשעיה ממנת התרבות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. צלחת התרבות לשטוף עם תקשורת hESC והעברה לצינור 15 מ&quot;ל. היזהר שלא לשבור את הגושים לתוך תאים בודדים או שברים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב160 XG כדי גלולה שברי מושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. הקש תחתון של צינור 15 מ&quot;ל עם אצבע כדי לשחרר גלולה בר מושבה. שברים בעדינות resuspend מושבה בתקשורת hESC על פי יחס פיצול (normallya לפצל יחס בין 1: 4 ו 1: 8 הוא מתאים). להיות זהיר מאוד שלא להפוך את הגושים לתוך תאים בודדים או שברים קטנים כמו זה ישפיע replating יעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני replating ברי hESC על MEFs לשטוף 1x עם HBSS. לאט לאט להוסיף כמות מתאימה (ראה טבלה 2) של השעיה תא המכילה שברי hESC בתקשורת hESC מנות מראש מצופה MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מנות תרבות על מדף בחממה ולנוע באיטיות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר באופן שווה שברי מושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת hESC יומית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תקשורת מותנית מMEFs (MEF-CM) לשטוף 75 סנטימטר 2 בקבוק מראש מצופה MEFs x 1 עם HBSS. הוסף מדיה hESC. בעקבות 24 שעות, לאסוף התנה תקשורת ולהחליף עם תקשורת hESC טריות. חזור מדי יום לתקופה מקסימלית של 12 ימים. אחסן MEF-CM ב 4 ° C. עד צורך. </li></ol> 2 הכנת ESCs האדם לTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לצמיחה של hESCsתחת מיקרוסקופ יומי. כאשר המושבות הפכו 40-50% ומחוברות, צלחת 3 x 100 מנות מ&quot;מ עם 2.0 x 10 5 MEFs לסנטימטר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המושבות הפכו 60 - ומחוברות 70% הם מוכנים להיות transfected. מושבות &#39;חתן&#39; על ידי הסרת מושבות מובחנות או ליבות מושבה. הערה: כפי שאנו מאמינים transfection גבוה יותר ויעילות מיקוד מתרחשת כאשר תאים נמצאים בצמיחת שלב יומן, הוא הציע שייערך electroporation לפני hESCs להגיע ≥ confluency 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מושבות hESC עם HBSS ולהוסיף Accutase. הערה: אין צורך hESCs מראש פינוק עם מעכב ROCK Y-27632 עיכוב מספיק כיתרחש כאשר הודגרו עם Y-27632 במהלך שלב 2.7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 10 - 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 עד מושבות ניתנות תאים בודדים כמתחת למיקרוסקופ. תאי Triturate עם טפטפת מ&quot;ל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה hESC ומסנן לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל באמצעות straine 40 מיקרומטר תאr כדי להסיר גושי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב160 XG למשך 5 דקות. גלולה תא הגלולה בתקשורת hESC טריות וחזור כדי להסיר כל פתרון Accutase השיורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים בתקשורת hESC המכילים 10 מיקרומטר Y-27632 ולהעביר כוללת ההשעיה התא לצלחת 100 מ&quot;מ מראש מצופה עם ג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2 למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו MEFs ידבק צלחת ג&#39;לטין מצופה. לאסוף hESCs לא חסיד באמצעות פיפטה 1 מ&quot;ל לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל טרי ולקבוע צפיפות תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> .3 Electroporation של hESCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת CM-MEF מסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולהוסיף 10 גורם גדילת רקומביננטי מ&quot;ל / פיברובלסטים אנושיים ng 2 (rhFGF2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 7.5 x 106 hESCs מסעיף 2.9 לצינור חדש 15 מ&quot;ל חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 160 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקופה זו הקימה את electroporator: בחר תכנית לele מעריכיctroporation ולהגדיר את הפרמטרים הבאים, מתח: 250 V, קיבוליות: 500 μF, והתנגדות: ∞-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות תא גלולה ב 0.8 מ&quot;ל של 0.22 מיקרומטר HBSS המסונן קר כקרח. מעבירים את הפתרון לקובט electroporation 0.4 סנטימטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מבנה TV-hPITX3 קדימה מיקוד (30 מיקרוגרם DNA) ומערבבים בעדינות עם טפטפת 200 μl. לדגור על קרח למשך 5 דקות. במהלך תקופה זו להסיר aliquot אחד PITX3 ZFN mRNA ולהפשיר על קרח. כאשר העברה מופשרת 7.5 μl של ZFN mRNA לDNA / תערובת תא בקובט electroporation. מערבבים בעדינות עם טפטפת 200 μl. הערה: הלוקוס על הכוונת הוא הגורם העיקרי שתורם למיקוד יעילות. קידוד לוקוסים גנים שקטים, גנים לא באו לידי ביטוי בESCs, כגון PITX3 קשים למקד באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית 6. לפיכך, פרוטוקול זה מנצל אישית מעוצב ZFNs למוקד PITX3 האנושי כדי לגרום b גדיל הדנ&quot;א כפולהreak. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate על ידי הבא במסך ההוראות המופיעה על electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 200 μl להעביר את התוכן מקובט electroporation לצינור 15 מ&quot;ל מכיל 10 מ&quot;ל תקשורת hESC. שטוף את קובט פעמיים עם 200 μl של תקשורת hESC בכל פעם ולהעביר צינור 15 מ&quot;ל. יהיו &quot;כמו רירי-&quot; פסולת בהיקף של דנ&quot;א וחלבון מתאי lysed אשר להשפיע לרעה על הישרדות תא. צנטריפוגה ב160 XG למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולטפוח בעדינות תא גלולה כדי לשחרר. להשעות Re ב30 מ&quot;ל בתוספת MEF-CM מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 וreplate על 3 x 100 מנות מ&quot;מ preplated עם MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את התקשורת מדי יום. ביום 2, Y-27632 ניתנים למשיכה ותאים שגודלו בתקשורת hESC בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 2-3 ימים hESCs צריך להיות 50-70% ומחוברות. בשלב זה מתחיל בחירת אנטיביוטיקה (לדוגמא, puromycin 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על selשיקוף על ידי הוספת מדיה hESC / puromycin טרי מדי יום. לאחר ~ 7 ימים מושבות קטנות צריכה להיות גלויות. אם לא נעשה שימוש בMEFs עמיד לאנטיביוטיקה, MEFs ניתן להשלים על ידי הוספת 1.0 x 10 4 תאים נוספים לסנטימטר 2. </li></ol> .4 המשובטים המהונדסים hESC בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 14 - 21 יום בעקבות בחירתה (כאשר מושבות הגיעו קוטר ~ 1 מ&quot;מ) להכין צלחות להתרחבות ולהקרנה. בגין על ידי הפשרת aliquot של Matrigel או Geltrex על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 5 שעות. לדלל לפי הוראות יצרנים ולהוסיף 75 μl היטב בכל צלחות 3 x 96 היטב. הכן צלחות 3 x 48 היטב על ידי ציפוי MEFs ב2.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר. דגירה שני צלחות O / N ב 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לנתח מושבות ל16-25 חתיכות באמצעות 21 מחט G בסוף פיפטה 2 מ&quot;ל על ידי חיתוך רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב Matrigel מצלחות 96 היטב ולהחליף עם supplemתקשורת ented CM-MEF. MEFs לשטוף בצלחות 48 היטב x 1 עם HBSS ולהוסיף מדיה hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 200 μl בעדינות להעביר 1/3 של המושבה גזור לתוך צלחת 48 היטב להרחבה. העבר את 2/3 האחר של המושבה גזור לתוך צלחת 96 היטב מתאימה המכילה תקשורת CM-MEF תוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על שני הצלחות על ידי שינוי בתקשורת יומית (בתוספת תקשורת CM-MEF לצלחות matrigel מצופה 96 היטב ותקשורת hESC לצלחות 48 היטב המכילות MEFs; שני בתוספת 0.5 מיקרוגרם / puromycin מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב עד 96-גם צלחות הן 100% ומחוברות ולאחר מכן בתחילה מסך באמצעות PCR. </li></ol> .5 הקרנה והרחבת שיבוטים החיוביים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין הדנ&quot;א הגנומי (שיטה המבוססת ביום 11 ב) להסיר את כל המדיה מצלחות על ידי היפוך, ואז למחוק על מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל פעמיים עם RT PBS (100 μl / גם כל שטיפה), להפוך וכתם כלצעד 5.1. צלחות מקום בf -80 מעלות צלזיוסאו 1 - שעה 2 כדי לסייע בתמוגה תא (ניתן לאחסן צלחות ללא הגבלת זמן כזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד תאים נמצאים ב-80 ° C לעשות Sarcosyl תמוגה חוצץ (ראה טבלה 4) (50 μl / טוב). לlyse תאים, צלחות חמות למשך 5 דקות ב RT אז חיץ תמוגה פיפטה לתוך כל טוב. סוגר את הקצוות של כל צלחת עם קלטת, מקום במכל רב סגר המכיל מגבות נייר לחות כדי ליצור לחות, ודגירת O / N ב 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה להוסיף 150 μl של 5M NaCl ל10 מ&quot;ל של אתנול מוחלט -20 ° C, ומערבב היטב, ומוסיף 100 μl היטב כל אחד (הערה: אתנול ילך מעונן כאשר NaCl מתווסף). צלחות ברז בעדינות לתערובת (לא פיפטה) ולהשאיר למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות ב RT. במהלך תקופה זו הפתרון ילך ברור וDNA יהיה להאיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון כמו בשלב 5.1 לאחר מכן להוסיף 150 μl של 70% אתנול היטב כל אחד. הפוך צלחת בעדינות ולמחוק כמו קודם. חזור על שלב זה 2x נוסף. הערה: מאחר DNA זירז באופן טבעי adheמיל לפלסטיק תרבית רקמה זה לא להיות וחלץ במהלך שלבי כביסה אלה.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי צלחות צנטריפוגות בקצרה במהירות השיא להתרכז DNA לתחתית של כל אחד גם אז אוויר יבש ב RT (או 37 מעלות צלזיוס) במשך דקות לפחות 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 40 - 50 T0.1E μl (pH8.0) (ראה לוח 5) או TE (pH8.0) לכל צלחות גם ומקום ב65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או 4 ° CO / N לפני השימוש לPCR. Resuspend DNA בעדינות על ידי הקשה על צידי הצלחת. השתמש 1-2 μl של תגובת PCR מחדש מושעה μl DNA / 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות להרחיב מערכת PCR תבנית ארוכה עם זרוע L hPITX3 gen. F ופריימרים R GFP זרוע L hPITX3 לבצע סינון ראשוני של שיבוטים ב58 חישול C °, 45 הארכת שניות, 35 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות Electrophorese עם 1kb Hyperladder ב1% agarose ג&#39;ל מכילים GelRed ב100 V 45 דקות ולזהות שיבוטים חיוביים באמצעות תאורת UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת שיבוטים חיוביים PCR ידי לעכל הדנ&quot;א הגנומי מexpaשיבוטים nded (ראה להלן) עם בדיקות HindIII והכלאות 5 &#39;ו 3&#39; של זרועות ההומולוגיה וקטור לכתם דרום (כפי שתואר לעיל ב1). בדיקות מופקות על ידי PCR באמצעות זוגות פריימר hPITX3 5 &#39;הבדיקה F ו R, וhPITX3 3&#39; בדיקה F ו R, מתעכל עם EcoRI וligated לתוך וקטור שיבוט כללי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלוי במספר של שיבוטים חיוביים, להכין 2 בארות של צלחת 6 היטב על ידי מראש ציפוי עם MEFs (2.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת pretreat שיבוטים חיוביים בצלחת 48 היטב עם 10 מיקרומטר Y-27632 למינימום של 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שיבוטים חיוביים עם HBSS ולהוסיף 300 μl של Accutase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מושבות ניתנות תאים בודדים, להוסיף 1 מ&quot;ל של תקשורת hESC ולאסוף לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את התקשורת מדי יום. ביום 2, Y-27632 ניתנים למשיכה ותאים שגודלו בתקשורת hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מושבות הן 70 - 80% ומחוברות, תת ולהקפיא את יתרת קולושברים בניו יורק. </li></ol>

<ol><li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+Allows+Context-Specific+Isolation+of+Progenitors+of+GABAergic+or+Dopaminergic+Neurons+During+Neural+Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).</li>
<li>Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+periods+of+neural+induction+and+propagation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors+with+EGF+and+FGF2+enhances+Lmx1a+expression+and+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential.</a> Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).</li>
<li>Collin, J., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+putting+a+finger+on+stem+cell+biology%3A+zinc+finger+nuclease-driven+targeted+genetic+editing+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects%3A+zinc-finger+nucleases+as+gene+therapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents.</a> Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iESCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+in+human+stem+cells+using+zinc+finger+nucleases+and+integrase-defective+lentiviral+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery.</a> Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).</li>
<li>Boch, J., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthomonas+AvrBs3+family-type+III+effectors%3A+discovery+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function.</a> Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+embryonic+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).</li>
<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).</li>
<li>Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+is+an+inducing+factor+in+generating+floor+plate+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).</li>
<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הדור של שורות תאי כתב מציע אמצעי רב עוצמה למעקב אחר, לחזות ובודד תאים של ריבית מאוכלוסייה הטרוגנית נגזרת מhESCs. עם זאת, גן המיקוד באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית הוכיח להיות מאוד יעיל לESCs אדם 3. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקה פשוטה יחסית להכנסת RP לאקסון אחד לוקוס PITX3, בhESCs באמצעות וקטור מיקוד זמין באופן נרחב יחד עם ZFNs. בידיים שלנו את מערכת מיקוד הגן היא יעילה, עם 19% משיבוטי puromycin עמיד המכילים מוקד PITX3 ממוקד בצורה נכונה (דומה...

פרוטוקולי התמיינות תאי גזע עובריים (ESC) זרם לגרום לאוכלוסיות תאים הטרוגנית, במיוחד ביחס לגזירה של פנוטיפים עצביים ספציפיים. כך, למרות שתרבויות להכיל את הפנוטיפ הסלולרי הרצוי, עצבי אחרים, סוגים מובחנים בלתי הלא עצבי ותא הם לעתים קרובות הווה 1. מאפיינים אלה מגבילים את היישום של ESC נגזר מקורות תא לשימוש בטיפול בתחליפי תא ובדוגמנות מחלה מבחנה. שורות תאי כתב גנטיות מציעות אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של עניין, ובלבד שהביטוי של חלבון הכתב (RP) מתרבה ביטוי אנדוגני. שימוש במקדמים באופן מיידי במעלה הזרם של אזור קוד גנטי יכול לשמש כדי להפיק כתבים גנטיים גולמיים אך מבנים כגון חסרי אלמנטי רגולציה המדויקים השולטים על ביטוי גני אנדוגני. בניגוד לכך, רקומבינציה הומולוגית מציעההזדמנות להבטיח ביטוי באיכות גבוהה של RP. בעבר, מיקוד וקטורים מיועדים לרקומבינציה הומולוגית בלוקוסים ספציפיים של עניין היה בשימוש למקד RPS בעכבר ESCs (mESCs) באמצעות electroporation כאמצעי למשלוח DNA 1,2. עם זאת הדור של שורות תאי כתב באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית הוא מאוד לא יעיל לESCs האנושי (hESCs), ובכך תועד רק בקומץ של מקרים (שנסקר ב3). על ידי שימוש בחלבון מהונדס chimeric המכיל שילוב של פוק אני nuclease עם מוטיבים אבץ אצבע ספציפי לאתר, ידועים קולקטיבי אבץ האצבע nucleases (ZFNs), יכולות להיות הציגו הפסקות כפולות גדיל DNA בלוקוסים הגנומי שנקבע מראש. כאשר וקטור DNA עם הומולוגיה לשני הצדדים של הפסקת גדיל הדנ&quot;א כפול הוא הוסיף, האתר הגנומי ניתן לתיקון על ידי רקומבינציה הומולוגית, המאפשר שילוב של רצף תורם DNA. טכניקה זו הוכיחה f שימושיתאו עריכה הגנומי בשני תאים ראשוניים אנושיים 4,5 וhESCs 6,7. nucleases עבודה מאוחרת יותר נצלה שעתוק כמו activator-מפעיל (TALENs), גורמי שעתוק המשמשים את מפעל פתוגנים 8, כדי לסייע בעיצוב של nucleases ספציפי לאתר 9. בפרוטוקול הבא אנחנו מדגימים את הדור של שורת תאי כתב hESC ידי electroporation של EGFP המכיל וקטור מיקוד הומולוגי 6 יחד עם ZFNs לhomeobox יותרת המוח האנושי 3 הלוקוס (PITX3). בעקבות בחירתה אנטיביוטיקה ל2-3 שבועות, hESCs עם DNA המשולב בצורה נכונה יכול להיות ידני הרים, הרחיב והוקרן בתחילה באמצעות PCR, ומאומתים בהמשך על ידי סופג דרום.

<table><tbody><tr><td>פיברובלסטים עובריים של עכבר (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>קורנינג</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td> מסננת תאים <td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>- 40 &mu; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 מ"מ - 0.22 &mu; מסנן m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>קובטה אלקטרופורציה 0.4 ס"מ</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>מבנה מיקוד TV-hPITX3 אנושי</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN; Human PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr>טכנולוגיות<td></td><td></td> <td>חיים של Dulbecco10566-016</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, מקור ארה"ב (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מדיום/חומרים מזינים F-12 (DMEM/F12) Life</td> <td>Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות&nbsp; (נאה)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine תמיסת מלח נתרן (סרקוזיל) (30%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל)</td><td>Bioline</td><td>Australia BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>הרחב מערכת PCR בתבנית ארוכה</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm gen. F (פריימר): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, אוסטרליה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm GFP R (פריימר): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, אוסטרליה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>ביוליין אוסטרליה</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, אוסטרליה</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

ג&#39;ין משופר nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

מגבלה העיקרית אחת עם פרוטוקולי התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) הנוכחיים היא הדור של אוכלוסיות תאים הטרוגנית. תרבויות אלה מכילות תאים של עניין, אלא גם נגועות בESCs מובחן, נגזרים שאינם עצביים ותת עצביים אחרים. זה מגביל את השימוש שלהם במבחנה וביישומי vivo, כגון דוגמנות במבחנה לגילוי סמים או טיפול בתחליפי תא. כדי לסייע להתגבר על זה, שורות תאי כתב, אשר מציעות אמצעים כדי לחזות, מסלול ובודד תאים של עניין, יכולות להיות מהונדסות. עם זאת, כדי להשיג את זה בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות רקומבינציה הומולוגית הקונבנציונלית היא מאוד לא יעילה. פרוטוקול זה מתאר מיקוד של homeobox יותרת המוח 3 הלוקוס (PITX3) בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות nucleases אבץ אצבע מעוצב בהתאמה אישית, המציג את הפסקות DNA גדיל פעמיים ספציפיות לאתר, יחד עםPITX3 - וקטור תורם DNA -specific EGFP. בעקבות הדור של הקו הסלולרי כתב PITX3, זה יכול לאחר מכן להיות מובחן באמצעות פרוטוקולים שפורסמו לשימוש במחקרים כגון במבחנה דוגמנות מחלה או החלפת תא הטיפול בפרקינסון.

בעקבות שיתוף electroporation של זוג אבץ אצבע PITX3 המותאם אישית תוכנן יחד עם PITX3 - וקטור תורם DNA -specific EGFP, ובחירת puromycin שלאחר מכן, שיבוטים hESC חיוביים בתחילה זוהו באמצעות הקרנה הגנומי PCR (איור 1). הכלאה כתם הדרומית של שיבוטים אלה PCR החיוביים עם 5 'ו 3' בדיקות ספציפיות אישרה מיקוד נכון לאקסון 1 של מוקד PITX3 (איור 2), עם יעילות של 19%. תמונות Immunofluorescent שמוצגים באיור 3 מדגי...

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא למקד ביעילות טרנסגנים למוקדי עניין בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ שתוכננו בהתאמה אישית לשם כך. תאי גזע עובריים אנושיים או HSCs מורחבים כדי לייצר מספיק חומר לאלקטרופורציה, ואז מתעכלים כדי לייצר תאים בודדים. ה-mRNA הבא המקודד שני נוקלאזות אצבע אבץ בעיצוב מותאם אישית עובר אלקטרופוטציה לתוך ה-HSCs עם רצף תורמי ה-EGFP הליניארי ולאחר מכן מצופים על עובריים טריים של עכברים, פיברובלסטים או MEFs.נוקלאזות אצבע האבץ האלקטרופורטיות הכנס שבירת גדיל כפול לאקסון הראשון של בור X שלושה לוקוס בתאים. לאחר מכן רצף התורמים EFGP, המוקף בזרועות מכוונות עם הומולוגיה לרצף אתר הבלמים של גדיל ה-DNA הכפול משולב במהלך חלוקת התא לאחר 14 עד 21 יום. שליש ממושבת HESC בודדת מועבר לכל באר של צלחת 96 בארות מצופה מטריג'ל ושני השלישים הנותרים מועברים לבאר מקבילה של צלחת 48 בארות המכילה ME Fs טרי.לאחר מכן מבוצעת כתמים דרומיים כדי לאשר אינטגרציה נכונה. לאחר אישור שיבוטים חיוביים, הם מורחבים ולאחר מכן מוקפאים לשימוש נוסף. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני המתודולוגיה הקיימת, כגון רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית, הוא שאצבעות אבץ יוצרות שבירות גדיל כפול קבועות מראש של DNA, המאפשרות מיקוד יעיל של טרנסגנים כדי לקבוע מראש מיקומים בתאי גזע עובריים אנושיים.למרות שכאן אנו מכניסים גן טרנס לבור X 3 של תאי גזע אנושיים, ניתן להתאים שיטה זו לכל מערכת אחרת שבה השימוש בקווי תאים מדווחים יהיה יתרון. התחל פרוטוקול זה על ידי הרחבת תאי גזע עובריים אנושיים או HSCs לטרנספקציה כמתואר במסמך הנלווה. כאשר המושבות הופכות ל-60 עד 70% מתלכדות, הנח את לוחית תרבית הרקמה על מיקרוסקופ מנתח.השתמש במחט בגודל 21 בקצה פיפטה של שני מיל ליטר כדי לטפח את המושבות על ידי הסרת מושבות מובחנות או ליבות מושבה. לאחר שטיפת מושבות HESC שואבות את המדיום. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר HBSS ודוגרים למשך שתי דקות.לאחר שאיבת הדגירה, ה-HBSS מוסיף חמישה מיליליטר אקוטן ודוגר במשך 10 עד 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד שהמושבות הופכות לתאים בודדים כפי שהם נראים במיקרוסקופ. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד משולש את התאים. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר מדיום HESC ובעזרת מסננת תאים של 40 מיקרון, סנן אותו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.כדי להסיר גושי תאים, צנטריפוגה את הזרימה בכוח הכבידה פי 160 למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב Resus, השעו את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מדיום HESC טרי וסובבו שוב כדי להסיר שאריות של תמיסת אקוטן. השעו מחדש את התאים במדיום HESC המכיל 10 מיקרומולרי Y 2 7 6 3 2 והעבירו אותם לכלי 100 מילימטר מצופה מראש בג'לטין מודגר 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות לפחות.במהלך תקופה זו, ה-MEFs ידבקו לכלי המצופה ג'לטין. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לאסוף את ה-SSCs הלא נדבקים לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר ולקבוע את צפיפות התאים באמצעות ציטומטר המו כהכנה לאלקטרופורציה. העבר 7.5 מיליון HSCs כפי שהוכן בחלק הקודם של סרטון זה לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר וצנטריפוגה בכוח משיכה פי 160 למשך חמש דקות.לאחר הסיבוב Resus, השעו את גלולת התא ב-0.8 מיליליטר של HBSS קר כקרח 0.22 מיקרון והעבירו את התמיסה לווטרינר אלקטרופורציה סטרילי של 0.4 סנטימטר. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוגרם של בור TVH X שלוש מיקוד קדימה. בנה DNA וערבב בעדינות עם פיפטה של 200 מיקרוליטר דגירה על קרח במשך חמש דקות במהלך הפשרת הדגירה ו-aliquot של בור X שלושה ZFN mRNA על קרח.לאחר ההפשרה, העבירו 7.5 מיקרוליטר לתערובת תאי ה-DNA לתוך האלקטרופורציה, Q vet מעורבב בעדינות עם פיפטה של 200 מיקרוליטר. לחץ על הכפתור האדום באלקטרו כדי להעביר את התאים. לאחר מכן, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, העבירו את התוכן מה-Electroporation Q Vet לצינור של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום HESC.שטפו את ה-Q VET פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מדיום HESC ואספו את תמיסות הכביסה באותו צינור של 15 מיליליטר. כדי להסיר את הריר שנוצר כמו פסולת המורכבת מ-DNA וחלבון מהתאים הליזים. צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 160 למשך חמש דקות.לאחר הסיבוב, שאפו את הסופרנטנט והקישו בעדינות על כדור התא כדי לשחרר את הוצאות ריס ב-30 מיליליטר. M-E-F-C-M בתוספת RH FGF 2 ו-10 מיקרומולר Y 2 7 6 3 2 וצלחת על שלוש צלחות 100 מילימטר המכילות MEFs. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 95% O2.שינוי המדיום מדי יום ביום השני, משוך Y 2 76 32 ותאים ברוטו במדיום HESC בלבד. לאחר יומיים-שלושה, ה-HES CS אמור להיות 50 עד 70% במקביל בשלב זה. התחל בבחירת אנטיביוטיקה.שמרו על המבחר על ידי הוספת HESC טרי לכל מדיום מיצין מדי יום. לאחר כשבעה ימים, מושבות קטנות אמורות להיות גלויות אם לא משתמשים ב-MEFs עמידים לאנטיביוטיקה. ניתן להשלים MEFs על ידי הוספת אחד כפול 10 מהתאים הרביעיים לסנטימטר מרובע.14 עד 21 יום לאחר הברירה כאשר המושבות הגיעו לקוטר של מילימטר אחד. הכן צלחות להרחבה והקרנה על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של מטריג'ל או ג'ל TRE לכל באר של 3 96. צלחות באר מכינות גם 3 48 צלחות באר של MEFs בשתי פעמים 10 עד הרביעי תאים לסנטימטר רבוע דוגרים על שתי קבוצות הלוחות למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למחרת.השתמש במחט בגודל 21 בקצה פיפטה של שני מיליליטר כדי לנתח מושבות HESC ל-16 עד 25 חתיכות על ידי חיתוך רשת. לאחר מכן, שאפו את המטריגל מ -96 צלחות באר והחליפו אותו במדיום CM MEF בתוספת R hf, GF שתיים ולכל מיצין. שטפו את ה-MEFs ב-48 צלחות הבאר עם HBSS ולאחר מכן הוסיפו מדיום HESC עם פר מיצין באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.העבירו בעדינות שליש מהמושבה המנותחת לצלחת של 48 בארות להרחבה. העבירו את שני השלישים הנותרים של המושבה המנותחת לצלחת 90 הבארות המתאימה המכילה תוספת מדיום C-M-M-E-F. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא העברת חלקי המושבה.אנו מציעים לך לתרגל את חלקי הצבע של העברה וניתוח לפני כן. שמרו על שתי הצלחות על ידי החלפת מצע תוסף האנטיביוטיקה מדי יום. הרחב עד שצלחות 96 הבאר יהיו 100% מתכנסות ברגע שהלוחות מתלכדים.הסר את כל המדיום מהצלחות על ידי היפוך, ואז כתם על מגבות נייר. המשך להכין את ה-DNA הגנומי ל-PCR כמתואר במסמך הנלווה לאחר השעיית ה-DNA ב-TE או TO 0.1 E.בצע PCR באמצעות מערכת ה-PCR של התבנית הארוכה הרחבה כמתואר במסמך הנלווה, השתמש באחד עד שניים מיקרוליטר של DNA מושעה לכל תגובת PCR של 10 מיקרוליטר לאחר בדיקת PCR לשיבוטים חיוביים על ידי אלקטרופורזה ואשר על ידי כתמים דרומיים. לאחר אישור שיבוטים חיוביים, המשך עם תת-תרבות והקפיא את שאר שברי המושבה כדי להנדס PIT X שלוש.קו תא מדווח hecs. בשיתוף פעולה עם זוג אצבעות אבץ מעוצב בהתאמה אישית ובור X שלושה EGFB ספציפי לווקטור תורם DNA ספציפי לבור X כמתואר במאמר וידאו זה לאחר PERY ובחירה, זוהו שיבוטים חיוביים של HESC באמצעות בדיקת PCR גנומית כפי שניתן לראות כאן. היו שיבוטים חיוביים רבים כפי שצוין על ידי רצועות ב-9 84 זוגות בסיסים.הכלאת הכתם הדרומי של שיבוטים חיוביים ל-PCR בוצעה לאחר מכן באמצעות חמש ושלוש בדיקות ספציפיות. איור זה מציג את הסכימה של וקטור המטרה הליניארי וכן את מיקומם של חמשת ושלוש הגשושיות החיצוניות כאן. מוצגים חמשת ושלושת הכתמים הדרומיים הן מסוג בר והן של אללים ממוקדים.הרצועה הבודדת בנתיב הטיפוס הפראי מצביעה על שני אללים זהים בעקבות מיקוד נכון של הטרנסגן לבור x נצפות שלוש רצועות לוקוס שתיים. האחד מתאים לאלל הממוקד נכון והשני לאלל מסוג הפראי. לאחר השליטה, ניתן לבצע מתודולוגיה זו תוך חודשיים-שלושה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למקד תאי גזע אנושיים באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ, כמו גם כיצד להשתמש באסטרטגיות PCR וכתם דרומי כדי לסנן CLs ממוקדים כהלכה.

zinc-finger-nuclease-enhanced-gene-targeting-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

למרות הפיתוחים אחרונים בהתאמה גנטית, transfection של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נותר תהליך גחמני. למיטב ידיעתנו, שיטות שיטתיות ויעילות לתאי אדם transfect מושרים pluripotent גזע (iPSCs) לא דווחה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עמידים ביעילות transfect וnucleofect iPSCs אדם.

Transfecting וNucleofecting תאי גזע אנושיים pluripotent מושרים

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

עריכת גנים בתיווך TALEN בלוקוס AAVS1 בנמל המבטחים מאפשרת הוספת טרנסגנים ביעילות גבוהה ב-iPSCs אנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת iPSCs להעברת TALEN וקטור תורם, טרנספקציה של iPSCs ובחירה ובידוד של שיבוטי iPSC כדי להשיג אינטגרציה ממוקדת של גן GFP ליצירת קווי דיווח.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

למד שיטה יעילה לעריכת גנים בתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ מותאמות אישית. הפרוטוקול מדגים מיקוד מדויק של טרנסגנים ללוקוס PITX3 לחקר התפתחות מערכת העצבים המרכזית.

ג'ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

גלה סרטונים נוספים