שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע אם שינויים בתדירות המוטציות עם שכפול מוגבר. גיל תאי השמרים נובע פשוט מסבבים נוספים של חלוקת תאים או משינויים ספציפיים לגיל בשיעורי המוטציות המצטברות. זה מושג על ידי מדידה ראשונה של תדירות ושיעורי המוטציות בתאים צעירים על ידי פיזור תאים על מדיה סלקטיבית ולא סלקטיבית כדי לחשב תדירות מוטציות חזויה עבור תאים בגילאים הולכים וגדלים עקב הצטברות מוטציות בכל סבב של חלוקת תאים.

לאחר מכן, אוכלוסיית תאי שמרים מסומנת בביוטין שגדל בתרבית נוזלית והתאים המסומנים המקוריים משוחזרים על ידי מיון מגנטי כדי להשיג תאי אם מזדקנים שעברו מספר חלוקות תאים. לאחר מכן תאי אם מזדקנים גדלים מחדש כדי להגדיל את גילם ואז ממוינים שוב או נצבעים לצלקות התחת, ולאחר מכן מתפשטים על מדיה סלקטיבית ולא סלקטיבית על מנת לקבוע את גיל השכפול הממוצע שלהם ומתקבלות תוצאות המראות אם יש עליות או ירידות ספציפיות לגיל במוטציות המצטברות על סמך השוואה של תדירות המוטציות שנצפתה בניסוי לתדירות המוטציות החזויה עבור תאים של גיל ממוצע נצפה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההזדקנות, כגון האם שינויים בשיעורי הנזק הגנטי המצטבר תורמים להזדקנות נורמלית, או האם ההשפעות משנות תוחלת החיים של גורמים גנטיים וסביבתיים שונים, בין היתר בשל שינויים בשיעורי המוטציות.

את ההליך מליסה פטרסון, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, כדי לקבוע קצב מוטציות בסיסי ליצירת תאים באמצעות בדיקות תנודות לתאים שגדלו בתנאי תרבית סטנדרטיים. עבור כל תרבית שכפול יש לדלל תאים אחד עד 2000 ולפזר אחד עד ארבעה מיקרוליטר על תווך לא סלקטיבי כדי לקבוע יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. גלולה את התאים הנותרים ב-2,400 Gs למשך דקה אחת במיקרו צנטריפוגה והשתמש ב-100 מיקרוליטר מים כדי להשעות אותם לפני התפשטותם על תווך סלקטיבי לזיהוי מוטציות.

לאחר דגירה של הצלחות ב-30 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים, ספירת המושבות קובעת את קצב המוטציות והתדירות הראשוניים על פי פרוטוקול הטקסט הנלווה לתיוג Charmy CCI עם ביוטין התחל על ידי פס התרבית ממלאי גליצרול על מדיום YPD ודגירה ב-30 מעלות צלזיוס למשך יום עד שלושה ימים. בעזרת קצה פיפטה סטרילי העבירו תאים מהצלחת למיליליטר מים לפחות. יש לזכור כי סנטימטר עד סנטימטר וחצי של חלק שגדל בעובי של הפס ייתן כ -10 לשמונת התאים.

השתמש בציטומטר המו כדי לקבוע את צפיפות התאים המדויקת עבור כל זן או מצב טיפול. השתמש במלאי ריאגנט ביוטין של חמישה מילי-מולרי כדי לסמן 10 עד שמונה תאים לנקודת איסוף בהתאם לנוהל הסטנדרטי של היצרן. בצע את כל שלבי הצנטריפוגה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר הכביסה הסופית.

השתמש במים כדי להשהות את התאים המסומנים לריכוז סופי של 10 עד שמונה תאים למיליליטר כדי לבדוק את כדאיות התאים לדלל 10 מיקרוליטר תאים עם 23 מיקרוליטר מים ו-67 מיקרוליטר של 0.4% Triam blue ב-XPBS אחד לדגור על התאים למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש בציטומטר המו כדי לקלוע תאים חיים או לא מוכתמים ומתים או מוכתמים. לאחר מדידת ערכי בסיס לגיל התא ותדירות המוטציות, על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו את התאים המסומנים בביוטין ל-20 מיליליטר של מדיום YPD. העמידו פנים לשמונת התאים.

גדל את התרביות במשך 16 עד 18 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לכ-10 עד שמונה תאים למיליליטר. אל תאפשר לתאים להגיע לשלב נייח ובמידת הצורך שמור את התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר שעות כדי לייעל את תזמון תקופת הגידול והאיסוף. לאחר קביעת צפיפות התאים וכדורי התאים בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים על ידי הוספת 30 מיליליטר של תיוג חרוזים, חיץ ומערבולת, ואז סובבו את התרחיף ושפכו את הסופרנטנט.

לאחר שטיפה שנייה אנו משעים את התאים ב -50 מיקרוליטר של מאגר תיוג חרוזים. העמידו פנים לשמונת התאים הכוללים על ידי מערבולת. הוסיפו שני מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים, העמידו פנים לשמונת התאים הכוללים ולאחר המערבולת דגרו לזמן קצר על קרח למשך 10 דקות תוך היפוך מעת לעת.

לאחר מכן, השתמש ב-30 מיליליטר של מאגר תיוג חרוזים כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. לאחר מכן הוסף 0.5 מיליליטר של מאגר תיוג חרוזים. העמידו פנים לשמונת התאים הכוללים ומערבלו לזמן קצר את הגלולה על הגדרה בינונית רק עד שהתאים מושעים מחדש.

יוצקים את התרחיף דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר כדי להסיר את כל גושי התאים שנותרו. במידת הצורך, השאירו תאים על הקרח למשך שעה עד שעתיים לפני הטעינה על העמוד. עקוב אחר הפרוטוקול המומלץ של היצרן עבור העמודות המגנטיות תוך שימוש עד פעמיים 10 עד תשעת התאים בסך הכל לכל .

הקפד להסיר כל אוויר בעת העמסת העמודים ולהסיר ולהחליף את העמוד על המפריד בין השטיפות כדי למנוע תאים להילכד בין החרוזים. בעת שימוש במפרידים מרובי עמודות לעיבוד עמודות מרובות של אותה דגימה, הוצא את כולם לאותו צינור איסוף כדי להפחית את זמן הטיפול ולהפחית את אובדן התאים במידת הצורך. שמור את הזרימה משלבי הקישור והשטיפה כדי לנתח תאים צעירים המיוצרים על ידי תאי האם לאחר ריכוז התאים על ידי צנטריפוגה ב-3000 Gs למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, שאב את כל המאגר מלבד מיליליטר אחד.

העמידו פנים לשמונת התאים המקוריים המסומנים בביוטין. ואז מערבולת קצרה כדי להשעות את התאים במאגר שנותר. השתמש בכחול טריאם כדי לצבוע כמות גדולה של תאים מדוללים והשתמש בציטומטר המו כדי לקבוע את צפיפות התאים ואת כדאיותם.

לאחר מכן חשב את המספר הכולל של התאים ששוחזרו. אם מספר התאים גבוה משמעותית מהצפוי, העבירו את דגימת הפליטה דרך עמודה אחרת כדי לנסות להסיר תאים צעירים מזהמים. אם מספר התאים נמוך משמעותית מהצפוי, העבר את הזרימה שנשמרה.

דגימה בעמודה אחרת כדי לנסות לשפר את התפוקה של תאי אם אם תרצה. לגדל מחדש תאים כדי להגדיל את גיל השכפול ולעקוב אחר תיוג ומיון החרוזים ללא תיוג ביוטין. כדי לקבוע את גיל השכפול, העבירו 25 מיקרוליטר של תאים משוחזרים לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר והשתמשו במיליליטר אחד של XPBS אחד כדי לשטוף את התאים פעמיים כדי לסמן צלקות ניצנים על פני התאים.

השתמש ב-180 מיקרוליטר של XPBS אחד ו-20 מיקרוליטר של WGA מצומד פלואורסצנטי כדי להשהות מחדש את התאים, לכסות את צינור הצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר בנייר כסף ולדגור עם נדנוד עדין ב-30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאחר הדגירה. השתמש ב-XPBS אחד כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. לאחר מכן למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, השתמש במגיב אנטיפה כדי להרכיב את התאים על שקופיות כדי למנוע תנועת תאים במהלך ההדמיה.

ריפוי מלא של המגלשות בחושך עד מספר ימים. ספרו צלקות ניצנים על לפחות 50 תאים לדגימה כדי לקבל מדד מייצג של גיל התא. לחלופין, לאחר השעיית התאים ב-XPBS אחד, בצע ציטומטריית זרימה באמצעות ההגדרות המתוארות בגרף פרוטוקול הטקסט צלקות ניצנים על תאים צעירים ותאי גיל שנספרו במיקרוסקופיה על ציר Y כנגד הממוצע הגיאומטרי המנורמל של הקרינה המצומדת WGA מאותן אוכלוסיות תאים על ציר ה-x.

לבסוף, השג את המשוואה של קו מגמה ליניארי עבור קשר זה לתחליף עוקב, הממוצע הגיאומטרי המנורמל של WGA מצומד עוצמת הקרינה של אוכלוסיית תאים עבור X במשוואה ופתור עבור Y כדי לקבוע את גיל התא הממוצע של דגימה. גרף זה ממחיש כי שיעור המוטציות בגן אחד היה דומה לפני ואחרי תיוג ביוטין באוכלוסיות שמרים צעירות עצמאיות, תדירות המוטציות הייתה דומה גם בתאים צעירים לפני ואחרי תיוג ביוטין כאשר גדלו ב-20 מעלות צלזיוס או 30 מעלות צלזיוס. הגרף המוצג כאן מדגים מה ניתן לראות בעת ספירת תאים משוחזרים לאחר תיוג ומיון ביוטין של תאים לא מטופלים או תאים שטופלו במי חמצן מילי-מולרי אחד לאחר המיון הראשון.

מספר התאים עשוי להיראות גבוה מהצפוי לאחר המיון הראשון, וצפוי אובדן מתקדם קטן של תאים עם המשך המיון. גיל השכפול נקבע על ידי ספירה ידנית של תוויות פלואורסצנטיות, אך צלקות על תאים כפי שמודגם כאן כפי שניתן לראות באיור זה. האות הפלואורסצנטי אך הצלקת מציטומטריית הזרימה הושווה לספירה ידנית כדי להשיג קשר ליניארי המאפשר לקבוע את גיל השכפול של אוכלוסיות תאי האם והביקורת על ידי ציטומטריית זרימה.

גרפים אלה מציגים דוגמאות לתדירות מוטציות נצפית דומה או מוגברת של תאי אם מבוגרים בהשוואה לתדרים החזויים המחושבים מהגיל הממוצע של תאי האם ותדירות המוטציות ושיעורי המוטציות שהתקבלו עבור אוכלוסיות תאים צעירות. תלוי במיקום הגנומי של הגן יכול אחד בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו צביעה למיני חמצן תגובתיים או מורפולוגיה קולרית כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו שינויים בפיזיולוגיה של התא קשורים לשינויים הקשורים לגיל בהצטברות מוטציות.