הקלטות מערך רב-אלקטרודה של רקמה האנושית אפילפטיים לאחר הניתוח בקליפת המוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הקלטות של מערך אלקטרודות מרובות של אירועים ex vivo, interictal ואירועים דמויי התקפים מרקמת קליפת המוח האפילפטית האנושית, ובכך לספק דרך לטפל במנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס פעילויות אפילפטיות, התחלה, התפשטות וההשפעות של תרופות אנטי אפילפטיות הן ברמת התא והן ברמת הרשת. זה מושג על ידי כריתה קפדנית של רקמת קליפת המוח האנושית מחולים עם אפילפסיה עמידה לתרופות במהלך הניתוח. השלב השני הוא הסרת קרישי הדם, כלי הדם וקרומי המוח ועודפי החומר הלבן לפני החיתוך.

לאחר מכן, חותכים את גוש הרקמה לפרוסות של 400 מיקרון. השלב האחרון הוא לשמור את הפרוסות בתנאי ממשק של חמצון גבוה וטמפרטורה מבוקרת עם זלוף איטי. בסופו של דבר, טכניקת מערך האלקטרודות הרב-אלקטרודות משמשת לתיעוד פעילות ספונטנית דמוית אינטריקטל ומעוררת אירועים דמויי איקטל.

המעבדה שלנו חוקרת את תפקידן של אינטראקציות נוירוגליות בפיזיופתולוגיה מוחית כדי לחקור כיצד תאים עצביים יכולים לייצר פעילות רשת פתולוגית בבני אדם. לאחרונה הקמנו הקלטות של מערך אלקטרודות מרובות של רקמות קליפת המוח האפילפטיות האנושיות לאחר הניתוח בשיתוף פעולה עם בתי חולים לטיפול בצוואר ובתי חולים לאפ. כיום, תומאס בלו, נוירוכירורג בבית החולים לטיפול בצוואר, יחד עם פלד אפילפטולוג וחוקר בבית החולים לאפיס ואלנה פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלי, ידגימו לכם כיצד לבצע טכניקות כאלה ולהשתמש בהן היטב.

מאיסוף רקמות אפילפטיות אנושיות ועד להקלטות MEA ex vivo, השימוש ב-ECT של רקמת קליפת המוח האנושית לריפוי חולים אפילפטיים מאפשר חקירה ישירה של נוירונים אפילפטיים אנושיים ותאי גליה המתוחזקים מבחינה תפקודית, המחוברים זה לזה ברשתות ספציפיות. חקירות מבחנה, רקמה אנושית מעניקה גישה לתאים בודדים ולפעילויות רשת, מנגנונים מבוססי יוניים, שלא ניתן לטפל בהם באופן מלא in vivo. רישום MEA של רקמת קליפת המוח האנושית יכול לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום האפילפסיה, כגון המנגנונים התאיים העומדים בבסיס אקסוגנזה והתפשטות התקפים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אפילפסיה נגעית והטיפול בהם מכיוון שהיא מאפשרת להבין את מנגנוני העמידות התרופתית ואת השפעת התרופה האנטי-אפילפטית על אירוע דמוי התקף שנרשם בפרוסות קליפת המוח האנושית. במבחנה. היתרון העיקרי של מערכי אלקטרו מרובים על פני שיטות קיימות כמו e, e, g או מיקרו אלקטרודות in vivo, הוא שהם מאפשרים גירוי ורישום לא פולשני בו זמנית של פוטנציאל שדה ופעילות מרובת יחידות מכמה צדדים של הרקמה.

כדי להתחיל בהליך, הכינו את תא הממשק על ידי מילוי החלק התחתון במים מזוקקים. לאחר מכן חבר את החדר למקור קרבוגן. לאחר מכן, חותכים חתיכת רקמת עדשה כך שתתאים לאזור השטוח של תא הפרוסות.

הנח אותו ליד צינור הקלט על מנת לאפשר לבועות לברוח מקו הקלט לפני שהן מגיעות לפרוסות. לאחר מכן, חותכים שתי חתיכות של חוט כותנה תקוע באורך זהה לפיסת רקמת העדשה. הניחו אותם בצידי האזור השטוח של החדר, קבעו את קצב הזרימה של המשאבה הפריסטלטית למיליליטר אחד לדקה.

לאחר מכן הפעל את החמצון למים בחלק התחתון של החדר. לאחר מכן הגדר את בקר הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. מכסים את החלק העליון של תא הממשק בחתיכת פרפורם ומחכים לפחות 30 דקות עד שהטמפרטורה תעלה ותתייצב.

כעת, הכינו את כלי החיתוך, הכוללים שני מלקחיים עדינים, מרית, כף קטנה ולהב, שתי צלחות פטרי מזכוכית, שתי מברשות ודבק ציאנואקרילט. לאחר מכן, הכינו את הוויברטו על ידי קביעת הפרמטרים לחיתוך. בהליך זה, הוציאו את הסוכרוז המוכן על בסיס CSF מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ומועכים אותו לרפש.

חמצן אותו עם קרבוגן. לאחר מכן העבירו 250 מיליליטר של רפש A CSF לבקבוק זכוכית ושמרו אותו בבקבוק עשה מלא בקרח לאיסוף רקמות בחדר הניתוח. בהרדמה כללית סטנדרטית, השתמש במערכת ניווט עצבי כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של קליפת המוח.

לאחר מכן, בצע חתך בעור, ואז צור חור בור בעצם, ואחריו כריתת גולגולת. לאחר מכן, הרם בעדינות את דש העצם ופתח את הדורה במספריים. לאחר מכן לבצע כריתה בלוק של קליפת המוח האפילפטית ולהימנע מקרישה נרחבת.

חותכים גוש קליפת המוח בעובי סנטימטר אחד ומניחים אותו לתוך הסוכרוז המחומצן הקפוא המבוסס על CSF. לאחר מכן, העבירו את הרקמה בסוכרוז קפוא על בסיס A CSF למעבדה במהירות האפשרית, אך הימנעו מזעזועים מכניים. כעת, מלאו צלחת פטרי ואת מגש חיץ הוויברטו ברפש A CSF מחומצן על בסיס סוכרוז והמשיכו לחמצן את רפש A CSF בקרבוגן.

לאחר מכן הוציאו בזהירות את הטישו מהבקבוק בעזרת כף והניחו אותו בצלחת הפטרי. בעזרת המלקחיים הסר בזהירות את קרישי הדם, כלי הדם וקרומי המוח כדי למנוע התנגדות במהלך החיתוך. חותכים את הצד של הרקמה בעזרת להב כדי לקבל משטח שטוח מקביל ככל האפשר לצד הנגדי של הרקמה.

לאחר מכן הדביקו את הרקמה על צלחת דגימת הוויברטו על מנת להכין פרוסות קליפת המוח הרוחביות. לאחר מכן, הניחו אותו במגש החיץ וחתכו פרוסות בעובי 400 מיקרון במהירות נמוכה. לאחר מכן, חותכים כמה חתיכות רקמת עדשה בעזרת מרית ומברשת.

העבר את פרוסות רקמת העדשה הללו לתא הממשק. דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני ההקלטה. בהליך זה, חבר את מערכת הזלוף למשאבה פריסטלטית ואת מערכת ה-MEA למחשב.

לאחר מכן הנח שבב MEA ריק בתוך המגבר. לאחר מכן, הגדר את בקר הטמפרטורה לחימום אלמנט הצינורית בתא MEA ל -37 מעלות צלזיוס. התחל את הזלוף של ה- A CSF המחומצן בחמישה עד שישה מיליליטר לדקה.

לאחר מכן, פתח את תוכנת ההקלטה. ודא שכל האלקטרודות של MEA מחוברות היטב ושאין רעש עקב הזלוף. עכשיו שפכו קצת הקלטה מחוממת A CSF בצלחת פטרי זכוכית.

העבירו פרוסה מתא הממשק לצלחת הפטרי על ידי אחיזת רקמת העדשה. לאחר מכן נתק בזהירות את הפרוסה מהרקמה על ידי טבילתה בתמיסה, או השתמש במברשת קטנה כדי להקל על הניתוק. לאחר מכן, מלאו את שבב ה-MEA בקצת CSF.

מעבירים את הפרוסה לשבב MEA בעזרת מרית עם פיפטה מפלסטיק. הסר בעדינות את התמיסה כדי לגרום לפרוסה להיצמד לאזור האלקטרודה ולשמור אותה במקומה עם עוגן פלטינה. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של הקלטת CSF לשבב MEA והנח אותו במגבר.

לאחר מכן התחל את הזילוף בחמישה עד שישה מיליליטר לדקה. לאחר מכן, בדוק את מיקום הפרוסה באזור ההקלטה של MEA. על ידי שימוש בתוכנת צג MEA, התאם אותה במידת הצורך.

על מנת להקליט משכבות קליפת המוח ולצלם תמונה, התחל את ההקלטה. זהו עקבות מייצגים של פעילות פרוסה בקליפת המוח האנושית שתועדה על ידי אלקטרודת MEA. ב-A CSF רגיל, ניתן לצפות בפעילות ספונטנית דמוית אינטריקטל 15 דקות לאחר הזלוף עם שישה מילי-מולרי אשלגן A CSF ללא מגנזיום.

ההתקף הראשון מופיע ואחריו אירועים אחרים במרווחים של שתיים עד שלוש דקות. העקבה הכחולה ממחישה את הפעילות שהוגדלה. פאנל זה מציג את המעבר הגבוה של הנתונים המסוננים ב-250 הרץ, החושף פעילות מרובת יחידות כאשר מתקרבים כאן יש הקלטה מייצגת של התקף מכל אלקטרודות MEA ללא מגנזיום.

שישה מילי-מולרי אשלגן A CSF. כל ריבוע מייצג אלקטרודה של מערך MEA בגודל 12 על 12 ומציג חלון זמן 82. הקו המקווקו מציין את מיקום המשטח בקליפת המוח ביחס למערך MEA.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להעביר בבטחה רקמת קליפת המוח האנושית, להכין ולאחסן פסוריאזיס קורטיקו בר קיימא, ולבצע הקלטות MEA של פעילויות אפילפטיות ספונטניות ומושרות בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שיהיה שיתוף פעולה הדוק בין הצוות הקליני בבית החולים לבין החוקרים במעבדה. לעולם אל תשכח שעבודה עם רקמה אנושית עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לבצע הגנה, כגון לבישת כפפות על מנת למנוע כל מחלה זיהומית אפשרית לאחר הליך זה. טכניקות אחרות כגון הדמיה פלואורסצנטית, מנורת תיקון, הקלטה, מיון ספייק וניתוח היסטולוגי יכולות להיות משולבות עם הקלטות EMA כדי לתאם תכונות סינפטיות, התנהגות תא בודד, דינמיקת יונים וחריגות תאים ומולקולריות לפעילויות האוכלוסייה.

ביצוע הקלטות MEA של רקמות אפילפטיות אנושיות יכול לסלול את הדרך לחוקרים לחקור אפילפסיות נגעיות על מנת להבהיר את המנגנונים העומדים בבסיס אקסוגנזה ועמידות לפרמקו, כמו גם את תפקיד האינטראקציה הנוירוגליאלית בתופעה זו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.