חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

מטרת העל של הליך זה היא לזהות אינטראקציות חלבון, חלבון בתוך פרוטאום נתון באופן מקביל ובלתי מוטה, מה שאינו אפשרי בטכנולוגיות אחרות. זה מושג על ידי הכלאה ראשונה וחלבון מתויג אפיטופ מעניין עם ספריית חלבונים פונקציונלית מטוהרת מאוד באורך מלא המופקדת במישור קואורדינטות על פני שקופית מיקרוסקופ. לאחר שהחלבון הגיע לשיווי משקל עם כל אחד מחלבוני המטרה שלו במערך, החלק הלא קשור נשטף ואינטראקציות החלבון מתגלות עם נוגדן חד שבטי לאפיטופ המצומד לחלק פלואורסצנטי באמצעות סורק מיקרו-מערך סטנדרטי.

התמונות המתקבלות שזורות במידע לגבי העוצמה של כל תכונה ביחס לחלבון קשור ואות פלואורסצנטי. מידע זה מובא בעזרת תוכנת ניתוח המיקרו-מערך כדי ליצור רשימה של ערכי עוצמה עבור כל תכונה במערך. ניתן לייצא את המידע לגבי צמד האינטראקציה בין חלבון לחלבון לתוכנת ניתוח ביואינפורמטי במורד הזרם כדי לדרג את הנתונים הספציפיים לתכונה ולזהות אינטראקציות חלבון בין החלבון המעניין לחלבונים במיקרו-מערך.

נתוני עוצמת האות הגולמיים נאספים על פני שני מיקרו-מערכי חלבון או יותר כדי לקחת בחשבון שונות בין ובתוך הבדיקה, והנתונים מנורמלים כדי לנקד כל אחת מהאינטראקציות. הפלט המתקבל מייצר רשימת יעד של חלבונים הפועלים באינטראקציה, שניתן להשתמש בה כדי להנחות חקירה נוספת של אינטראקציות חלבון חלבון. In vivo Functional protein microarray פותח במעבדתו של מייקל סניידר לפני למעלה מ-15 שנה.

מאז, היו יישומים מוצלחים רבים של טכנולוגיה זו בשל הרבגוניות שלה ובדיקות פרוטאומיות ביוכימיות. טכניקה זו מקלה על חקר אינטראקציות חלבונים ורשתות איתות מודולריות, כמו גם קישוריות חלופית ומפלי איתות ידועים בעבר כדי לתרבית ולטהר את בדיקות ההיתוך V חמש משתמשות בזן שמרים טרי מפוספס Y 2 58 המכיל צלחת חלבון היתוך V 5, השמרים על אורציל שלם סינתטי, אגר דקסטרוז 2%, וגדלים ב-30 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים מתרבית קפואה. חסנו תרביות התחלה ממושבה אחת וגידלו בן לילה באורציל סינתטי שלם.

2% דקסטרוז על משטח או גלגל רועד ב-30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר יש לחסן 400 מיליליטר של אורציל שלם סינתטי. תרבית רפינוז 2% עם תרבית התחלה מספקת כדי להשיג צפיפות אופטית סופית ב-600 ננומטר או OD 600 של 0.1.

הגדל את החיסונים ל-OD 600 של 0.6, ולאחר מכן גרם לביטוי מבנה היתוך V חמישה קינאז על ידי הוספת מספיק תמצית שמרים של שלושה x. טון פפ בתוספת 6% גלקטוז כדי לדלל את אמצעי האינדוקציה בפקטור של שלושה או ריכוז גלקטוז סופי של 2% לגרום לתאים ב-30 מעלות צלזיוס למשך שש שעות על פלטפורמת רעידות. השתמש בבקבוק ארלנמאייר בנפח שני ליטר כדי להבטיח אוורור מתאים.

קצור את התאים על ידי סיבוב 400 מיליליטר של תרחיף התאים ב -1000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את התאים פעם אחת עם 50 מיליליטר של מאגר PBS קר כקרח והעבירו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את הגלולה שוב במי מלח קרים עם פוספט או מאגר PBS והעבירו לשני צינורות מכסה הצמד של מיליליטר לליזה.

לאחר סיבוב התאים ב-20,000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס, הסר את המאגר בעזרת פיפטה והניח את הצינורות על קרח. ליסה את התאים עם חרוזי זירקוניה של 0.5 מילימטר בנפח אחד לאחד של כדור תאים לחרוזים לליזה PBS, מאגר. לאחר מכן מערבל את התערובת שלוש פעמים באמצעות פלטפורמת תסיסה למרווחי זמן של שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה את הליזאט פי 20, 000, G במיקרו פוגה שולחנית למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הליזט המובהר לצינור המכיל כ-100 מיקרוליטר של שרף זיקה ניקל שטוף מראש ודגרו על אגוז למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. כדי ללכוד את ההיסטמין שש x מתויג V חמישה חלבון היתוך גלולה את השרף באמצעות צנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות ב-1000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לאחר הסרת הסופרנטנט.

שוטפים את השרף עם מאגר כביסה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס על המוטטור. חזור על הכביסה פעמיים נוספות עם מאגר כביסה טרי. יש להוציא את החלבונים בשני נפחים של 100 מיקרוליטר של 200 מילי-מולארי.

מוסיפים גליצרול לריכוז סופי של 30% מהדגימות ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש בבדיקה. כדי לזהות אינטראקציות. לדלל את הנוגדן המצומד V חמש פלואורו ארבע ל-260 ננוגרם למיליליטר בבדיקה, לחצוץ ולערבב היטב על ידי ניעור.

לאחר מכן יש לדלל את חלבון ההיתוך V five בטווח ריכוזים של חמישה עד 500 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוציאו את מערכי החלבון מהמקפיא והכניסו למקרר לארבע מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש. הוסף את המאגר החוסם ישירות למחזיק השקופיות המכיל את מערכי החלבון וכסה את החלק העליון בפרפורם כדי למנוע דליפה.

חסום את המערכים במאגר חוסם למשך שעה על ידי טלטול ב-50 RP על במה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, העבירו את המערכים לתא לח, מרוצף לארבע מעלות צלזיוס והוסיפו 90 מיקרוליטר של בדיקה מדוללת ישירות למשטח המערך. שכבו את המערכים עם החלקה מוגבהת של מרים ודגרו מבלי לרעוד בתא הלח בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי לאחר הדגירה, הוסיפו את המגלשה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל מספיק מאגר בדיקה מקורר מראש כדי לעטוף לחלוטין את המגלשה, מה שמאפשר להחלקה של המרים להחליק בעדינות ממיקרו-מערך החלבון.

שטפו את המערכים שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחד בשלושה צינורות חרוטיים. מרחו את תמיסת הנוגדנים ישירות על המערך מיד לאחר השלמת הכביסה ושכבו עם החלקת מרים שנמחקה. כמו קודם, דגרו את המערכים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בתא הלח.

בצע את אותו שלב כביסה כמו קודם, וסובב בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ב 800 פעמים G בצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, יבש את המערכים באוויר במחזיק שקופיות בחושך למשך 30 דקות לפני סריקת המערך ב-647 ננומטר. בניסוי זה נחקרה פעילות הקישור של TDA אחד V 5.

מיקרו-מערכי חלבון שמרים שזוהו בשכפול עם כ-4,200 חלבוני היתוך GST באורך מלא הודגרו עם בקרת הווקטור הריק או עם בדיקות TDA 1 V 5. הלוחות המוכנסים משווים את האזור הזהה בשני המערכים. ראוי לציין במיוחד את RIM 11, שבאופן מעניין זוהה גם כמטרה זרחנית של TDA במחקר שפורסם בעבר.

לאחר זיהוי המטרות, ניתן לבדוק אותן לפעילות ביוכימית ותפקודית in vivo. אם אתה צופה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד להשתמש במיקרו-מערכי חלבון פונקציונליים כאמצעי לזיהוי אינטראקציות חלבון מועמדות לאימות וחקירה נוספת in vivo.