Name: חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: למד לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בצורה מקבילית וללא הטיה באמצעות מערכי חלבון פונקציונליים בצפיפות גבוהה. שיטה זו מאפשרת ניתוח אלפי אינטראקציות במקביל לחקירת רשתות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מה-NIH. הבדיקות המוצגות באיור 1 בוצעו על ידי ד"ר ג'וזף פאסולו. אנו מודים לד"ר רועי חן על הערותיו המועילות.

1. בדיקה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולטהר את בדיקות קינאז V5-היתוך משמשות לבחינת אינטראקציות עם חלבונים אחרים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Y258 זן שמרים טריים מפוספס (מאטה pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) המכיל חלבון V5-היתוך (הביע מפאי-DEST52 GATEWAY הווקטור). השתמש בחלבון המבודד כבדיקה על microarrays. צלחת השמרים על שלם-אורציל הסינתטי (SC-Ura) / 2% דקסטרוז / אגר ולגדול על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים מתרבות קפוא (° גליצרול מניית -80 מעלות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבויות המתנע (5-20 מיליליטר) ממושבה אחת ולגדול בין לילה בSC-Ura / 2% דקסטרוז על רועד פלטפורמה (220-250 סל&quot;ד) או גלגל על ​​30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לחסן 400 מיליליטר של SC-Ura 2% raffinose התרבות / עם תרבות המתנע מספיק כדי OD סופי 600 של 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול inoculums לOD 600 של 0.6 ואחריו האינדוקציה גלקטוז של פו V5-קינאזשיאון לבנות ביטוי על ידי הוספת פתרון של תמצית שמרי 3x / Peptone (כן) בתוספת 6% גלקטוז, על ידי הוספה מספיק כדי לדלל את תקשורת האינדוקציה בפקטור של 3, כך שהריכוז הסופי של גלקטוז הוא 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לתאים על 30 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות על פלטפורמה רועדת. השתמש בבקבוק ליטר Erlenmeyer 2 כדי להבטיח אוורור מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים באמצעות JA-10 (או דומה) הרוטור על ידי ספינינג 400 מיליליטר של השעיה תא XG ב 1000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעם אחת עם 50 מיליליטר של קרח הקר PBS חיץ ולהעביר צינור חרוטי 50 מיליליטר. שטוף את הכדור שוב במאגר PBS קר כקרח (ללא חומרי ניקוי או תוספים אחרים) המשמשים לתמוגה והעברת 2 מיליליטר snap-כובע צינורות לתמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים ב 20,000 XG דקות 1 ב 4 ° C לגלולה ופיפטה משם למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות על קרח ולהמשיך בשלב תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים (גלולה 250-350 μl) עם 0.5 מ&quot;מ חרוזים zirconia ב1: 1: 1 נפח תא גלולה, חרוזים, ונאגר מלוח פוספט (PBS) תמוגה חיץ ומערבולת התערובת באמצעות פלטפורמת תסיסה 3 פעמים ב 2 מרווחי דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב -20,000 XG בmicrofuge שולחן במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant פיפטה לתוך צינור צנטריפוגות במהירות גבוהה פוליקרבונט ולהבהיר ידי ulracentrufugation למשך 30 דקות ב 150,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate הבהיר לצינור המכיל שרף prewashed Ni 2 + זיקה (~ 100 μl) דגירה על nutator לשעה 2 ב 4 ° C כדי ללכוד היסטידין 6X (שלו) מתויג חלבון V5-היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף שלוש פעמים במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם הצפת לשטוף. גלולה השרף באמצעות צנטריפוגות בראש טבלה במשך 5 דקות XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant. הוסף חוצץ לשטוף טרי לכל אחד לשטוף ולהחזיר את הצינור לnutator תסיסה במהלך השטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר STE לשטוףנ.ב. שלמים, להחיל את השרף שטף לעמודת G-25 טרי לelution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 25 μl של חיץ elution באופן צעד חכם מתחיל עם 100 מ&quot;מ Imidazole 500 מ&quot;מ imidazole במרווחים של 50 מ&quot;מ עבור הסכום כולל של 9 שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay השברים שנאספו באמצעות ג&#39;ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-עמוד) וצביעת coomassie לזהות את השבר (ים) המועשר הגבוהה ביותר לשימוש בassay ולהוסיף גליצרול 30% ולאחסן ב -80 ° C עד שימוש ב assay. </li></ol></li></ol> 2. גשוש מערכים הערה: אנא ראה שלב 2.6 סעיף זה כדי להכין את פתרון הנוגדנים לפני תחילת assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות אינטראקציות, לדלל את הנוגדן מצומדות V5-fluorophore (כלומר AlexaFluor 647) 260 / מיליליטר ng במאגר בדיקה ומערבבים היטב על ידי רועד. הערה: הכן פתרון 30 דקות לפני שימוש ומניח את הצינור על nutat זה נוגדןאו או גלגל כדי להבטיח ערבוב מלא והשעיה הומוגנית של נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הבדיקה חלבון V5-היתוך על פני טווח ריכוז של 5-500 מיקרוגרם / מיליליטר. הערה: אופטימלי עבור כל assay אינטראקציה בין חלבונים, באמצעות חיץ בדיקה. אופטימיזציה כוללת הוספה עוד בדיקות כדי לבחון חיץ. בדרך כלל 10 מיקרוגרם / מיליליטר משמש כנקודת התחלה ומותאמת בהתאם מבוסס על עוצמת האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את microarrays החלבון מהמקפיא (-20 ° C) ומביא ל4 מעלות צלזיוס במקרר רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חיץ חסימה ישירות לבעל השקופית המכיל את חלבון micorarrays ולכסות את החלק העליון עם parafilm כדי למנוע דליפה. לחסום את מערכי חסימת חיץ במשך שעה 1 על ידי רועד ב 50 סל&quot;ד בשלב ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החסימה, להעביר את המערכים לתא humidified המקורר עד 4 ° C, ולהוסיף 90 μl של בדיקה דילול ישירות על פני המערך. כיסוי ARRays עם תלוש מרים גדל ודגירת סטטי (לא רועד) בתא humidified ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערכים 3 פעמים 1 דקות כל אחד בחיץ בדיקה בשלושה צינורות 50 מיליליטר חרוטי. הוסף את השקופיות לצינורות חרוטי המכילים מאגר בדיקה טרום צונן מספיק כדי המעטפה השקופית לחלוטין. לאפשר להחליק המרים להחליק בעדינות את של microarray החלבון (לא מכריח אותו כמו זה יכול לגרום נזק למשטח המערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פתרון הנוגדן ישירות למערך מייד לאחר שסיים את השטיפה (שלב 2.5) והשכבה עם תלוש מרים גדל כמו קודם. דגירה המערכים למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את אותה שלב לשטוף כמו קודם (דקות 3 פעמים 1 בחיץ בדיקה), וספין בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 800 XG בצנטריפוגה שולחן במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. אוויר יבש המערכים בהחזיק שקופיות בחושך במשך 30 דקות לפני סריקת המערך ב647 ננומטר. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li>
<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
<li>Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIm%2C+H+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול שהוצג במקור מבוצע באמצעות 85 חלבוני היתוך קינאז-V5 שמרי חלבון ייחודיים כדי להשוות פעילות מחייבת בין משפחות שונות וקשורות של קינאזות שמרי חלבון וכתוצאה מכך ההזדהות של רשתות האינטראקציה קינאז החדשות in vivo 1. כטכנולוגית פרופיל proteomic מתעוררים, הפיתוח של תפוקה גבוהה (HTP) הקרנת proteomes באמצעות מערכי חלבון הסתמך על ספריות פפטיד, ואורגניזמים מודל אוקריוטים ופרוקריוטים 8,17; מאוחר יותר, פלטפורמת assay זה הייתה מוחלת על אאוקריוטים גבוהים יות...

הצורך לבצע ניתוחים הגלובליים של ביוכימיה של חלבונים ומחייבים פעילות בvivo הביא לפיתוח שיטות החדשות לאפיון אינטראקציות בין חלבונים (PPIs) ולאחר translational השינויים של proteomes כל 1,3-8. microarrays חלבון מיוצרים כmicroarrays פונקציונלי חלבון באמצעות חלבונים פונקציונליים באורך מלא 4-6,8,9, או microarrays חלבון אנליטיים המכיל נוגדני 10,11. הם מתוכננים להכיל בצפיפות גבוהה של חלבונים ערוכים על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם מגוון רחב של chemistries משטח כדי להקל על מגוון של תנאי ניסוי הנדרשים לביצוע ביוכימיים רחבים מנתחת 12. chemistries Nitrocellulose ומשטח אלדהיד לקובץ מצורף כימי באמצעות שיטות ליזין או קובץ מצורף זיקה כגון מגלשות chelated ניקל לחיבור חלבונים וגלוטתיון מתויג לקובץ מצורף זיקה בין יתר 13. </p&gt; השימוש בmicroarrays חלבון הפונקציונלי כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון דורש גישה לספריית חלבון פונקציונלי באיכות גבוהה 14. ס cerevisiae ניתנים להפקת ספרייה כגון דרך הזיווג של גבוה עותק זיקה מתויג מבני חלבון עם טכניקות טיהור chromatographic תפוקה גבוהה. הרוב המכריע של שמרי הגנום כבר רצף וכמעט כל proteome יכולה לבוא לידי ביטוי מגבוה עותק פלסמיד לטיהור וביוכימיים מנתחים 12. ברגע שהחלבונים מתקבלים וערוכים בפורמט 384 גם, הם מודפסים על גבי שקופית מיקרוסקופ המאפשרת ניתוח מהיר מקביל רב פרמטרית ביוכימיים וחקירה bioinformatic 8,14-16. microarrays החלבון שימש עבור מבחני האנזימטית ואינטראקציות עם חלבונים, שומנים, מולקולות קטנות, וחומצות גרעין בין יישומים רבים אחרים. הנגישות של חלבונים על פני השטח של proteomeמערכים להפוך אותם נוחים לסוגים שונים של זיהוי אנליטיים כוללים, חיסון-זיקה, משטח Plasmon תהודה, הקרינה ורבים טכניקות אחרות. יתר על כן, היא מאפשרת לבקרה טובה של תנאי הניסוי שבו זה יכול להיות קשה לעשות in vivo. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש המתאים של microarrays חלבון הפונקציונלי כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. יישום זה מאפשר הניתוח ביוכימי המקביל תפוקה גבוהה של פעילות חלבון מחייב שימוש אנליטי נקי במיוחד (חלבון) של עניין. C-מסוף (carboxy מסוף) מתויג חלבון פיתיון V5-היתוך של העניין מופק מפלסמיד גבוה עותק בזן שמרים מותאמים לטיהור חלבונים. תיוג C-המסוף מבטיח כי החלבון באורך מלא תורגם. החלבון השתמש במחקר זה הוא קינאז חלבון היתוך Tda1-V5, אשר מטוהר באמצעות שרף זיקת ניקל באמצעות תג His6X. CONSTRUC היתוך Tda1-V5לא מטוהר באמצעות elution הסידורי באמצעות שיפוע imidazole לelute שבריר ביותר המועשר לשימוש בassay.

<table><tbody><tr><td>צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>או תמצית</td></tr><tr><td>שמרים בקטו</td> דומות <td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura נשירה מדיה</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית קטנים</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוק גדול Erlenmeyer</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה רוטור</td><td></td><td></td><td></td>JA-10</tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה (500 מ"ל)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור בז (50 מ"ל)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>טבליות PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FastPrep (צינור</td><td></td><td></td><td></td> מכסה בורג 2 מ"ל</tr>) <tr><td>מכונת FastPrep MP</td><td>Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זירקון</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול (pH = 7.4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב שלם (ללא EDTA)</td><td></td><td>קוקטייל מעכב פוספטאז Roche</td> 11873580001 <td></td></tr><tr><td>1</td><td>סיגמא</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ATP סיגמא</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור טלטול (30 מעלות; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nickel Affinity Resin</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 עמודה</td><td>GE מדעי החיים</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ג'ל (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מונוקלונלי V5 נוגדן</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 מתויג מונוקלונלי V5 נוגדן</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מערכי חלבון Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix סורק</td><td>מכשירים</td><td></td><td></td>מולקולריים</tr><tr><td>מרים החלקות</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>מאגר ליזה: 0.1% טריטון X-100, 0.5 מ"מ DTT, 2 מ"מ MgCl2, 500 מ"מ NaCl, 50 מ"מ אימידזול (pH 7.4), קוקטייל מעכב פרוטאז שלם &ndash; ללא EDTA, קוקטייל מעכב פוספטאז 1, 1 מ"מ PMSF&nbsp; (הוסף ממש לפני השימוש)</td><td></td><td></td><td>הוסף את הריאגנטים ל-1x PBS (0.01 M מאגר פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי, 0.137 M נתרן כלורי; pH 7.4) כדי להשיג את הנפח הרצוי של תמיסת ליזה</td></tr><tr><td>מאגר חוסם: 1% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>הוסף את הריאגנטים ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר</td></tr> <tr><td>חסימהמאגר בדיקה: 2 מ"מ MgCl2, 0.5 מ"מ DTT, 0.05% טריטון X-100, 50 מ"מ NaCl, 500 &mu; M ATP (עבור קינאזות), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>הוסף את המגיב ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר הבדיקה</td></tr><tr><td>מאגר כביסה: 0.1% טריטון X-100, 500 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ DTT, 50 מ"מ אימידזול (pH 7.4), 2 מ"מ MgCl2</td><td></td><td></td><td>הוסף את המגיב ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר</td></tr> <tr><td>הבדיקהמאגר פליטה: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 &ndash; 500 מ"מ אימידזול (pH 7.4), קוקטייל מעכב פרוטאז מלא &ndash; קוקטייל מעכב פוספטאז ללא EDTA, 1 מ"מ PMSF (הוסף ממש לפני השימוש)</td><td></td><td></td><td>לפני שמתחילים, חשוב לשים לב לשיפוע הריכוז של אימידזול (50 &ndash; 500 מ"מ) וליצור צינורות נפרדים לכל ריכוז (רצוי ליצור את המרווח במרווחים של 50 מ"מ). הוסף את המגיב ל-1x PBS כדי להשיג את הנפח הרצוי של מאגר בדיקה</td></tr><tr><td>3x YEP +6% גלקטוז: ממיסים 30 גרם תמצית שמרים ו-&nbsp; 60 גרם פפטון ב-700 מ"ל של H2O, וחיטוי. יש להוסיף 300 מ"ל גלקטוז 20% גלקטוז מעוקר במסנן (משקל/נפח)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; אין לבצע חיטוי גלקטוז</td></tr></tbody></table>

חיטוט microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

microarrays חלבון הפונקציונלי בצפיפות גבוהה המכיל ~ 4,200 חלבוני שמרי רקומביננטי נבחנים לאינטראקציות חלבון-חלבון קינאז באמצעות חלבון היתוך הזיקה מטוהרת השמרים קינאז המכיל תג V5-epitope לקריאה החוצה. קינאז המטוהר מתקבל באמצעות התרבות של זן שמרים מותאמים לייצור חלבון גבוה עותק מחסה פלסמיד המכיל היתוך קינאז-V5 לבנות תחת אמרגן מושרה GAL. השמרים הוא גדלו בתקשורת כובל עם מקור פחמן ניטראלי עבור 6 שעות אחרי אינדוקציה עם גלקטוז 2%. בשלב הבא, התרבות שנקטפו וקינאז הוא מטוהר באמצעות טכניקות chromatographic זיקה סטנדרטית להשיג קינאז חלבון נקי במיוחד לשימוש בassay. קינאז המטוהר מדולל עם חיץ קינאז לטווח מתאים עבור assay וmicroarrays החלבון חסום לפני הכלאה עם microarray החלבון. לאחר ההכלאה, המערכים מששו עם antib V5 חד שבטיody לזהות חלבונים מחויבים לחלבון קינאז-V5. לבסוף, המערכים נסרקים באמצעות סורק microarray סטנדרטי, והנתונים מופק לניתוח אינפורמטיקה במורד הזרם 1,2 לקבוע אמון גבוה שנקבע של אינטראקציות חלבון לאימות במורד הזרם in vivo.

פעילות האינטראקציה בין חלבונים נצפתה באמצעות קורא שבבים סטנדרטי על מנת להעריך את היתוך החלבון kinase Tda1-V5 לבנות כחלבון פיתיון נגד microarray חלבון פונקציונלי שמרים המכיל כ -4,200 ס הייחודי חלבוני GST-היתוך cerevisiae. חקירה נוספת עם תוכנת GenePix גילתה שפע של אירועים מחייבים של עוצמות משתנות. הזיקה הייתה ללמוד מהעוצמת המדורגת של האות נגזרת מנוגדנים מצומדות V5-Fluorophore חד שבטיים חייבים היעד שלה (V5-קינאז). אלגוריתם ניקוד ProCat 2 שימש לזהות אינטרא...

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

מטרת העל של הליך זה היא לזהות אינטראקציות חלבון, חלבון בתוך פרוטאום נתון באופן מקביל ובלתי מוטה, מה שאינו אפשרי בטכנולוגיות אחרות. זה מושג על ידי הכלאה ראשונה וחלבון מתויג אפיטופ מעניין עם ספריית חלבונים פונקציונלית מטוהרת מאוד באורך מלא המופקדת במישור קואורדינטות על פני שקופית מיקרוסקופ. לאחר שהחלבון הגיע לשיווי משקל עם כל אחד מחלבוני המטרה שלו במערך, החלק הלא קשור נשטף ואינטראקציות החלבון מתגלות עם נוגדן חד שבטי לאפיטופ המצומד לחלק פלואורסצנטי באמצעות סורק מיקרו-מערך סטנדרטי.התמונות המתקבלות שזורות במידע לגבי העוצמה של כל תכונה ביחס לחלבון קשור ואות פלואורסצנטי. מידע זה מובא בעזרת תוכנת ניתוח המיקרו-מערך כדי ליצור רשימה של ערכי עוצמה עבור כל תכונה במערך. ניתן לייצא את המידע לגבי צמד האינטראקציה בין חלבון לחלבון לתוכנת ניתוח ביואינפורמטי במורד הזרם כדי לדרג את הנתונים הספציפיים לתכונה ולזהות אינטראקציות חלבון בין החלבון המעניין לחלבונים במיקרו-מערך.נתוני עוצמת האות הגולמיים נאספים על פני שני מיקרו-מערכי חלבון או יותר כדי לקחת בחשבון שונות בין ובתוך הבדיקה, והנתונים מנורמלים כדי לנקד כל אחת מהאינטראקציות. הפלט המתקבל מייצר רשימת יעד של חלבונים הפועלים באינטראקציה, שניתן להשתמש בה כדי להנחות חקירה נוספת של אינטראקציות חלבון חלבון. In vivo Functional protein microarray פותח במעבדתו של מייקל סניידר לפני למעלה מ-15 שנה.מאז, היו יישומים מוצלחים רבים של טכנולוגיה זו בשל הרבגוניות שלה ובדיקות פרוטאומיות ביוכימיות. טכניקה זו מקלה על חקר אינטראקציות חלבונים ורשתות איתות מודולריות, כמו גם קישוריות חלופית ומפלי איתות ידועים בעבר כדי לתרבית ולטהר את בדיקות ההיתוך V חמש משתמשות בזן שמרים טרי מפוספס Y 2 58 המכיל צלחת חלבון היתוך V 5, השמרים על אורציל שלם סינתטי, אגר דקסטרוז 2%, וגדלים ב-30 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים מתרבית קפואה. חסנו תרביות התחלה ממושבה אחת וגידלו בן לילה באורציל סינתטי שלם.2% דקסטרוז על משטח או גלגל רועד ב-30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר יש לחסן 400 מיליליטר של אורציל שלם סינתטי. תרבית רפינוז 2% עם תרבית התחלה מספקת כדי להשיג צפיפות אופטית סופית ב-600 ננומטר או OD 600 של 0.1.הגדל את החיסונים ל-OD 600 של 0.6, ולאחר מכן גרם לביטוי מבנה היתוך V חמישה קינאז על ידי הוספת מספיק תמצית שמרים של שלושה x. טון פפ בתוספת 6% גלקטוז כדי לדלל את אמצעי האינדוקציה בפקטור של שלושה או ריכוז גלקטוז סופי של 2% לגרום לתאים ב-30 מעלות צלזיוס למשך שש שעות על פלטפורמת רעידות. השתמש בבקבוק ארלנמאייר בנפח שני ליטר כדי להבטיח אוורור מתאים.קצור את התאים על ידי סיבוב 400 מיליליטר של תרחיף התאים ב -1000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את התאים פעם אחת עם 50 מיליליטר של מאגר PBS קר כקרח והעבירו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את הגלולה שוב במי מלח קרים עם פוספט או מאגר PBS והעבירו לשני צינורות מכסה הצמד של מיליליטר לליזה.לאחר סיבוב התאים ב-20,000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס, הסר את המאגר בעזרת פיפטה והניח את הצינורות על קרח. ליסה את התאים עם חרוזי זירקוניה של 0.5 מילימטר בנפח אחד לאחד של כדור תאים לחרוזים לליזה PBS, מאגר. לאחר מכן מערבל את התערובת שלוש פעמים באמצעות פלטפורמת תסיסה למרווחי זמן של שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה את הליזאט פי 20, 000, G במיקרו פוגה שולחנית למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הליזט המובהר לצינור המכיל כ-100 מיקרוליטר של שרף זיקה ניקל שטוף מראש ודגרו על אגוז למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. כדי ללכוד את ההיסטמין שש x מתויג V חמישה חלבון היתוך גלולה את השרף באמצעות צנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות ב-1000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לאחר הסרת הסופרנטנט.שוטפים את השרף עם מאגר כביסה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס על המוטטור. חזור על הכביסה פעמיים נוספות עם מאגר כביסה טרי. יש להוציא את החלבונים בשני נפחים של 100 מיקרוליטר של 200 מילי-מולארי.מוסיפים גליצרול לריכוז סופי של 30% מהדגימות ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש בבדיקה. כדי לזהות אינטראקציות. לדלל את הנוגדן המצומד V חמש פלואורו ארבע ל-260 ננוגרם למיליליטר בבדיקה, לחצוץ ולערבב היטב על ידי ניעור.לאחר מכן יש לדלל את חלבון ההיתוך V five בטווח ריכוזים של חמישה עד 500 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוציאו את מערכי החלבון מהמקפיא והכניסו למקרר לארבע מעלות צלזיוס ממש לפני השימוש. הוסף את המאגר החוסם ישירות למחזיק השקופיות המכיל את מערכי החלבון וכסה את החלק העליון בפרפורם כדי למנוע דליפה.חסום את המערכים במאגר חוסם למשך שעה על ידי טלטול ב-50 RP על במה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, העבירו את המערכים לתא לח, מרוצף לארבע מעלות צלזיוס והוסיפו 90 מיקרוליטר של בדיקה מדוללת ישירות למשטח המערך. שכבו את המערכים עם החלקה מוגבהת של מרים ודגרו מבלי לרעוד בתא הלח בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי לאחר הדגירה, הוסיפו את המגלשה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל מספיק מאגר בדיקה מקורר מראש כדי לעטוף לחלוטין את המגלשה, מה שמאפשר להחלקה של המרים להחליק בעדינות ממיקרו-מערך החלבון.שטפו את המערכים שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחד בשלושה צינורות חרוטיים. מרחו את תמיסת הנוגדנים ישירות על המערך מיד לאחר השלמת הכביסה ושכבו עם החלקת מרים שנמחקה. כמו קודם, דגרו את המערכים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בתא הלח.בצע את אותו שלב כביסה כמו קודם, וסובב בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ב 800 פעמים G בצנטריפוגה שולחנית למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, יבש את המערכים באוויר במחזיק שקופיות בחושך למשך 30 דקות לפני סריקת המערך ב-647 ננומטר. בניסוי זה נחקרה פעילות הקישור של TDA אחד V 5.מיקרו-מערכי חלבון שמרים שזוהו בשכפול עם כ-4,200 חלבוני היתוך GST באורך מלא הודגרו עם בקרת הווקטור הריק או עם בדיקות TDA 1 V 5. הלוחות המוכנסים משווים את האזור הזהה בשני המערכים. ראוי לציין במיוחד את RIM 11, שבאופן מעניין זוהה גם כמטרה זרחנית של TDA במחקר שפורסם בעבר.לאחר זיהוי המטרות, ניתן לבדוק אותן לפעילות ביוכימית ותפקודית in vivo. אם אתה צופה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד להשתמש במיקרו-מערכי חלבון פונקציונליים כאמצעי לזיהוי אינטראקציות חלבון מועמדות לאימות וחקירה נוספת in vivo.

probing-high-density-functional-protein-microarrays-to-detect-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

סרטון זה מדגים את ההדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון בצומת העצבי-שרירי Drosophila (NMJ) באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA). לאחר בידוד דפנות הגוף, חלבונים המקיימים אינטראקציה נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים מצומדים PLA. הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת בדיקות עם אוליגונוקלאוטידים מחברים, ויוצרים DNA מעגלי, אשר מוגבר לאחר מכן על ידי הגברת מעגל מתגלגל. בדיקות פלואורסצנטיות נקשרות ל-DNA המוגבר, ומאפשרות הדמיה של אינטראקציות חלבון-חלבון ב-NMJ.

איתור אינטראקציות חלבון-חלבון בזחלי דרוזופילה באמצעות בדיקת קשירת קרבה

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למד לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בצורה מקבילית וללא הטיה באמצעות מערכי חלבון פונקציונליים בצפיפות גבוהה. שיטה זו מאפשרת ניתוח אלפי אינטראקציות במקביל לחקירת רשתות תאית.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

גלה סרטונים נוספים