Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

מטרת העל של הליך זה היא לתייג חלבונים מעניינים על הממברנה המיטוכונדריאלית של ER עם נוגדן לבחירתך ולנתח במקביל לתפקוד המיטוכונדריה. זה מושג תחילה על ידי איסוף הרקמה המעניינת כמו המוח, חוט השדרה או הכבד מחולדה. השלב השני הוא לבודד את המיטוכונדריה מהרקמה, במקרה זה חוט השדרה.

חוט השדרה הומוגני בריקוד. הומוגנייזר ואברונים אחרים ופסולת יום תאים מוסרים באמצעות סדרה של שלבי צנטריפוגה עד להשגת חיך מיטוכונדריאלי גולמי מיאלין, מזהם עיקרי של רקמת העצבים המרכזית מוסר על ידי ערבוב מיטוכונדריה עם תמיסה של 12% הכנה אופטית וצנטריפוזיה שוב. לאחר מכן, המיטוכונדריה המבודדת מסומנת בנוגדנים ראשוניים לבחירה, ואחריהם נוגדן משני מצומד לפלואור.

השלב האחרון הוא הוספת צבעים פלואורסצנטיים כדי לאשר זהות מיטוכונדריאלית או ליתר דיוק פרמטרים פונקציונליים. בסופו של דבר, זרימה ציטומטרית משמשת כדי להראות את השפע היחסי של ממברנות אלט מיטוכונדריאליות לאורך פיזיולוגיה או מחלה רגילה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה הוא שהיא מאפשרת תפוקה גבוהה וכימות מהיר של אלפי מיטוכונדריה בודדים.

בעלי החיים ששימשו במחקר זה טופלו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית להגנה על בעלי חיים, העוקבת אחר תקנים לאומיים כפי שהותוו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כדי להתחיל בהליך זה, הנח חוט שדרה שלם שלם שנאסף מחולדה בהומוגנייזר זכוכית של חמישה מיליליטר המכיל חמישה נפחים של מאגר הומוגניזציה. הניחו את הומוגנייזר הזכוכית על קרח והומוגניזציה של הרקמה ביד עד שלא יישארו חתיכות רקמה גדולות יותר, מה שייקח כשמונה פעימות.

העבירו את ההומוגנאט לשניים או שלושה צינורות מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-1, 300 פעמים G למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס והפיפטה הבאה של ה-S supernatant לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה של חמישה מיליליטר. הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה לגלולה והשהה בעדינות את הגלולה. ואז צנטריפוגה את המתלה והשעיה מחדש את הגלולה.

פעמיים נוספות כדי להסיר פסולת קטנה, משוך את כל הסופרנטנטים לאותו צינור אולטרה-צנטריפוגה של חמישה מיליליטר, ואז הנח את הצינורות לתוך רוטור אולטרה-צנטריפוגה. מצויד בדליים מתנדנדים, צנטריפוגה את הצינורות ב 17, 000 פעמים G למשך 15 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הצנטריפוגה, שמור את הסופרנטנט לעיבוד נוסף אם השבר הציטוזולי מעניין.

לאחר מכן, החייאה תשעה את הגלולה, שהיא החלק המיטוכונדריאלי הגולמי בארבעה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה המכיל צנטריפוגה של 50 מילי-מולרית אשלגן כלורי. הגלולה המושעה ב-17,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד, ואז השליכו את ה-supinate והשעו בעדינות את הגלולה ב-800 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה בצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש של חמישה מיליליטר בדיוק 800 מיקרוליטר של הגלולה המושהה. לאחר מכן פיפטה 200 מיקרוליטר יוד דאל ל-800 מיקרוליטר של הגלולה המרחפת כדי ליצור ריכוז סופי של 12% יוד דאל.

מערבבים את תכולת הצינור בעדינות אך ביסודיות עם פיפטה P 1000 ולאחר מכן צנטריפוגה ב 17, 000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד שואבים את שכבת המיאלין בחלק העליון של הצינור וזורקים את הספינאט בזהירות מכיוון שהפלטה עלולה להיות רופפת. Resus משהה את הגלולה בארבעה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה. לאחר מכן צנטריפוגה את הרווח שלך ב-17,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.

השליכו את ה-supinate והחזרה. השעו את הגלולה בארבעה מיליליטר של מאגר הומוגניזציה. לאחר מכן חזור שוב על הצנטריפוגה והסר את חומר השכיבה reus.

כופפו את הגלולה הסופית ב-100 עד 200 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה והעבירו לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר. קבע את כמות החלבון בכל דגימה באמצעות בדיקת כימות חלבון סטנדרטית כגון בדיקת חומצה ביונית או BCA. בעת הכנת הדגימות לכימות יש לדלל את הדגימות ואת העקומה הסטנדרטית ב-2% נתרן גופרתי כדי להבטיח מסיסות נאותה של המיטוכונדריה.

עבור כל תערובת צביעה שתיבדק, פיפטה 25 מיקרוגרם מהמיטוכונדריה המבודדת לתוך צינור מיקרו צנטרי של 1.7 מיליליטר. הקפד לכלול דגימה לא מוכתמת בכל ניסוי וכן בקרת איזוטיפ מתאימה לכל צנטריפוגה שנבדקה נוגדנים כל דגימה ב-17,000 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס במיקרו צנטריפוגה שולחנית. לאחר מכן הסר את הסופינט והשהה מחדש את המיטוכונדריה המבודדת ב-50 מיקרוליטר של מאגר מיטוכונדריה.

בתוספת 10% BSA נטול חומצות שומן, דגרו את התמיסה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוגרם של הנוגדן הראשוני לכל מיליליטר תמיסה. דגרו על המיטוכונדריה המבודדת עם הנוגדן הראשוני למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לשטוף את הנוגדן הלא קשור, לצנטריפוגה כל דגימה ולהשליך את הנטנט שוכב. לאחר מכן, השעו בעדינות את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיטוכונדריה, ולאחר מכן חזרו על שלב הצנטריפוגה, השליכו את ה-natant שוכב והשעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של מאגר מיטוכונדריה.

הוסף 0.5 מיקרוגרם של הנוגדן המשני לכל מיליליטר דגימה. לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה כל דגימה והשליכו את הסופינאט המכיל את הנוגדן המשני הלא קשור. ריס.

השעו את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר מיטוכונדריה וצנטריפוגה את הדגימה. שוב. לאחר מכן הסר את הסופינט ואת ריס. השעו את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר מיטוכונדריה כדי להבטיח שהאירועים הנצפים הם אכן מיטוכונדריה.

צבעו את הדגימה בצבע פלואורסצנטי ספציפי למיטוכונדריה כגון גשש MIT ירוק מוויטרוגן למשך 15 דקות בחושך. אם אין צורך בצביעה נוספת כדי לחקור פרמטרים פונקציונליים אחרים, העבר את הדגימה המסומנת לצינור המתאים לטעינה בציטומטר זרימה. שמור את הדגימות על קרח והמשך לציטומטר זרימה לרכישה כדי לוודא שלמיטוכונדריה המבודדת יש כתם פוטנציאלי טרנסממברני שלם המיטוכונדריה עם 100 ננו-מולרי טטראתיל מוט דומין מתיל אסטר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך כבקרה לצביעה עם טטראתיל מוט דומין.

מתיל אסטר מכתים את המיטוכונדריה המבודדת עם 100 ננו-מולרי טטראתיל מוט דומין מתיל אסטר בנוכחות 100 מיקרומולרי קרבוניל ציאניד m כלורו פנול HydroOne. כימיקל זה הוא ניתוק מיטוכונדריאלי ויבצע דה-פולריזציה של המיטוכונדריה כדי לוודא שהמיטוכונדריה המבודדת מייצרת סופראוקסיד מכתים את המיטוכונדריה עם אינדיקטור סופראוקסיד מתאים כגון מיטוזות, גרביים אדומות ממבחנה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך כבקרה לייצור סופראוקסיד מיטוכונדריאלי. הישאר במיטוכונדריה המבודדת עם צבע בנוכחות 10 אנטימיצין מיקרומולרי.

אנטימיצין A הוא מעכב של קומפלקס שלוש של שרשרת הנשימה ויגביר את ייצור הסופראוקסיד המיטוכונדריאלי לפני תחילת הרכישה. הגדר את המכשיר כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן מערבבים את הדגימות על ידי הקשה עדינה על הצינור, אך אל תתערבלו.

התחל לאסוף את האירועים הראשוניים בלחץ נמוך במהלך השער. הקפד לשער על כלל האוכלוסייה. לאחר מכן, התאם את המתחים של ההיסטוגרמות בהתאם.

שיא המדגם הלא מוכתם מתאים בדרך כלל לעשור השני. לאחר מכן, לאחר הקמת השערים ועיבוד הדגימות, העבר את הלחץ לציטומטריית זרימה גבוהה. ניתוח של תכשירי חוט השדרה זיהה כי 94% מהאירועים היו חיוביים לצבע הספציפי למיטוכונדריה.

בניסוי זה, 30% מהאירועים החיוביים של המיטוכונדריה סומנו עם נוגדן ספציפי לאיחוי MIT 2, שהוא חלבון המעורב באיחוי הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. ניתוח הפוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריאלי באמצעות טטראתיל רומין מתיל אסטר מצא כי ל-95% מהמיטוכונדריה המבודדת יש פוטנציאל טרנסממברני שלם. צביעה זו הוכחה כספציפית שכן ירידה משמעותית בצביעה נצפתה כאשר בוצעה בנוכחות מיטוכונדריה לא תפקודית מיטוכונדריאלית נמצא כמייצרת כמות בסיסית של תחמוצת SUP כפי שנמדד באמצעות צבע חדיר ממברנה.

זה הופך לתגובת P פלואורסצנטית עם תחמוצת SUP. טיפול במיטוכונדריה עם אנטימיצין A מביא לעלייה של כ-10% בייצור הסופראוקסיד לאחר השליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שש עד שבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.