Name: דור של הטרנסגניים הידרה על ידי Microinjection העובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: למד לייצר קווים טרנסגניים יציבים בהידרה באמצעות מיקרו-הזרקת DNA פלסמידי לעוברים בשלבי התפתחות מוקדמים. שיטה זו מאפשרת מחקרי גנטיקה ותהליכי התפתחות ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על הרולד ויילה י Mathers פרס G. לHL ומענק NIH (R24 GM080527) לRESCEJ ידי היה דוקטורים עמית NRSA (NIH F32GM9037222) והוא נתמך כיום מדען פיתוח פרס מחקר מודרך מהלאומי על ידי מכון להזדקנות (K01AG04435). ברצוננו להודות לביקורות על הערותיו מועילות.

.1 הכנת פלסמיד דנ&quot;א, מחטים, וכלי הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ערכת High Speed ​​מקסי או מידי ולהתרכז DNA ל2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באמצעות משקעים אתנול. גלולה DNA צריכה להיות מומסת במים ללא יוני nuclease חינם. אחסן את הדנ&quot;א ב10-20 aliquots μl ב -20 מעלות צלזיוס. (ראה טבלת משלים 1 לרשימה של וקטורים זמינים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן מנה הזרקה באמצעות agarose לבנות שוקת להחזקת עוברים בצלחת פטרי 100 x 15 מ&quot;מ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ 75 x 50 זכוכית לתוך 100 x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי בזווית. יוצקים כ 50 מ&quot;ל של 2% מומס agarose במדיום הידרה 24 לתוך צלחת פטרי. , לחלופין לשפוך agarose לתוך הצלחת הראשונה ולצוף &quot;עובש Microinjection דגים&quot; על גבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את שקופית הזכוכית או העובש. אם שקופיות זכוכית שימשה, לחתוך agarose העודף עם bla גילוחדה ליצירת קיר. יוצקים בינוני הידרה לתוך הצלחת ולהשתמש בו באופן מיידי או לשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. ניתן לעשות שימוש חוזר מנות הזרקה אם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בין שימושים: הערה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה על חולץ micropipette באמצעות התנאים הבאים: לחמם 525, למשוך 75, מהירות 100, זמן 50. חנות המחטים על ידי לחיצה על אותם לתוך רצועה צרה של חימר בצלחת פטרי באופן שהם במקביל מוחזק לתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את פתרון ההזרקה, לשלב 3 μl של 2.5 מ&quot;ג / פתרון פלסמיד דנ&quot;א מ&quot;ל עם 2 μl של 10% פנול אדומים. מערבולת הפתרון לזמן קצר ולאחר מכן לסובב אותו עבור 10 דקות במהירות המרבית בmicrocentrifuge כדי להסיר כל חלקיקים שעלולות לסתום את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, קליפ המחט כמה מילימטרים מהקצה עם מלקחיים כדי ליצור פתח קטן. הערה: יש גמישות מסוימת בגודל המתאים של פתוחing כי הלחץ יכול להיות מותאם בשלב 3.3 ליתאים למגוון הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי, כך שהוא מחזיק את המחט במצב אנכי עם את הקצה. טען את המחט עם כ 0.5 μl של פתרון הזרקה ידי pipetting את הנוזל לתוך הקצה האחורי של המחט. לאפשר פעולת נימים למשוך את הפתרון לקצה המחט. </li></ol> 2 הכנת עוברים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על בסיס יומי לסרוק תרבות זן הידרה AEP לפוליפים בייצור ביצים. לאסוף פוליפים אלה ולהגדיר אותם בצד בצלחת תרבות נפרדת. שים לב פוליפים אלה כל כמה שעות במהלך היום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות ביצה. כאשר ביצים לפרוץ את האאקטודרם ולשבת על טבעת של תאי ectodermal חזרו בו הם מוכנים להזרקה 25. הנח פוליפים אלה בצלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים במשך שעה לפחות 1 לפני ההזרקה כדי לאפשר הפריה. הידרה &lt;/ Em&gt; זכרים ישחררו זרע ללא כל מניפולציה מיוחדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נשים נמצאות במושבה AEP עם ביצים בנויות באופן מלא, שהם כ 400 מיקרומטר בקוטר 25, או 1 לעוברי שלב 8 תאים, גם לאסוף אלה להזרקה. מייד להזריק עוברים שנכתבו על דבקות. הערה: לא ניתן להבחין בהבדל בין ביצים בנויות באופן מלא וzygotes חד תאי, ובכך אלה צריכים להיות מודגרות עם זכרים לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההזרקה, להסיר את רוב רקמת ההורים מעל ומתחת לעובר באמצעות אזמל עם להב # 15. השאר רק את העובר עם חתיכה קטנה של טור גוף המצורף, כדי לשמש כדי לתפעל את העובר עם מלקחיים במידת צורך. הערה: הרקמה שגזורה מאת העובר יהיה להתחדש וצריך להישמר כדי להבטיח שנשים יישארו במושבה הידרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, להעביר עוברים למנת ההזרקה, סידר אותם במקביל לקיר שלשוקת agarose. </li></ol> .3 Microinjection של פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר microinjector על דוכן מגנטי שיושב על צלחת ברזל. הר בעל ההזרקה, המהווה את החלק של microinjector שמחזיק את המחט, על micromanipulator ג&#39;ויסטיק. הר מניפולטור ג&#39;ויסטיק לצלחת הברזל, עם דוכן מגנטי. מניחים כל המכלול הזה בצד ימין של מיקרוסקופ לנתח ומקם את בעל ההזרקה כך שזה נראה לעין בתחום התצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת ההזרקה עם עוברים מתחת למיקרוסקופ לנתח, אוריינטציה כך שהקיר האנכי של שוקת agarose הוא בצד השמאל. הכנס את המחט לתוך מחזיק ההזרקה ולהוריד את קצה המחט לתוך מדיום הידרה בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לסובב את הידית של המזרק בכיוון השעון עד ששמן מינרלים ממלא את החלק העליון של המחט וזרם קבוע של פתרון הזרקה הוא ציין יציאת המחט לתוך hydrבינוני. אם הזרם חזק מדי, צריך להוריד את הלחץ על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון. לתרגל את הצעד הזה כדי להשיג לחץ מתאים, אשר תלוי בגודל של פתיחת המחט (כלומר, איך המחט הייתה מוצמדת בשלב 1.5) באופן שיגרתי. הערה: אם הזרם חזק מדי, העובר לא ישרוד את הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הצפייה באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להעביר את צלחת ההזרקה כך שהעובר הראשון הוא במרכז השדה. להזיז את המחט כך שהוא נוגע בעובר ש. השתמש micromanipulator כדי לחדור את העובר עם המחט. הערה: הקיר האנכי של שוקת agarose ישמור את העובר מהדחיפה הצידה על ידי המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון ההזרקה לזרום אל תוך שניות 1 או 2 עובר ולאחר מכן הסר את המחט במהירות. אם העובר יש תא אחד או יותר, להזריק כל תא בנפרד. שימוש במלקחיים לארגון מחדש של העובר כדי ליישר את התא הבא עם קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אמברי הראשוןo מוזרקת, להזיז את הצלחת כדי שהעובר הבא הוא בעמדת הזריקה ולחזור על התהליך; תמשיך עד שכל העוברים כבר הזריק. </li></ol> .4 Culturing ובקיעה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל העוברים הוחדרו לתוך צלחת עם כמה הידרה שיש לי אשכים (זה הוא להבטיח כי כל העוברים הם מופרה). דגירה עובר בחממת C ° 18 בעוד הם ממשיכים עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא הגיע לשלב שהציפורן, לעבור כל עובר מוזרק ולבודד של צלחת 24 גם מלאה בינוני הידרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר המוזרקת ל2 שבועות בחושך ב18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 2 בשבוע, לבדוק כל עובר מוזרק מתחת למיקרוסקופ לנתח. שים לב כל המקרים שבהם עובר ציפורן בשלב ניתק מהפיסה הקטנה של רקמת הורים ורקמת ההורים כבר התאחתה. הסר פוליפ מחדש זה מייד, כך שהוא לא מילstaken לגוזל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת של עוברים מוזרקים תחת אור אקווריום ב RT. בדוק את הצלחות בכל יום ולאסוף גוזלים. גוזלים חדשים יהיו לבנים כי הצבע הוורוד האופייני לפוליף הידרה מגיע מהארטמיה שהם אוכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לגוזלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות ביטוי transgene. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
<li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+genome+of+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li>
<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
<li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals%3A+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li>
<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

הידרה מתרבה באופן שגרתי לא מינית, אבל דורשת גירויים סביבתיים כדי להתחיל תאי מין הפקה. גירויים אלה אינם מוגדרים היטב עבור רוב מיני הידרה ועשויים להיות שונה מזן לזן. המשוכה משמעותית לייצור של הידרה המהונדס היא קבלת עוברים על בסיס קבוע, כי זה יכול להיות קשה בסביבת מעבדה כדי לגרום להידרה להפוך מיני. זן AEP 25, לעומת זאת, מייצר תאי מין בקלות במעבדה וזה המתח היחיד שהיה בשימוש עד כה לביצוע קווים מהונדסים. השיטה הנפוצה ביותר לגרימת ייצור תא מ...

הידרה נעשתה שימוש כדי ללמוד התחדשות, היווצרות דפוס, ותאי גזע עבור כ 250 שנים 2 יש הידרה תכנית גוף פשוטה המורכבת של שושלות שלושה תאים:. אפיתל ectodermal, אפיתל endodermal, וביניים. הגוף צינורי נוצר על ידי ectodermal ושושלות אפיתל endodermal, כל אחד מהם הוא שכבת תא בודדת. כל תאי האפיתל בעמודת הגוף הם mitotic. כאשר תאי האפיתל הם עקורים לגפיים 3, הראש (פה וזרועות) בסוף הפה או ברגל (הדיסק הבסיסי) בסוף aboral, הם יעצרו בשלב G2 של מחזור התא ולשנות תא גורל 4. התאים של שושלת ביניים מתגוררים בתוך החללים שבין תאי האפיתל. שושלת זו נתמכת על ידי תאי גזע multipotent הנמצאים בשכבת האפיתל ectodermal של העמודה גוף 5. תאי גזע ביניים מעוררים שלושה cel סומטייםסוגי l (עצבים, תאי בלוטה, וnematocytes) ותאי הנבט 6,7. כחבר המיון הצמחי Cnidaria, קבוצת האחות לכל bilaterians, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים בין בעלי חיים רב תאיים. עד לאחרונה, מאמצים אלה הקשו על ידי החוסר של שיטות אמינות להפרעות של תפקוד גן. עם זאת, עם התפתחותה של המתודולוגיה מהונדס 1, אנו יכולים לנצל את מלוא יתרונות של הידרה כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים הבסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב תאיים, כגון תפקוד תאי גזע, התחדשות, ודפוסים עכשיו. קווים המהונדס הידרה נקבעים על ידי הזרקה של DNA פלסמיד לעוברי, מה שגורם אינטגרציה אקראית וביטוי chimeric בתדירות משמעותית של גוזלים. קו עם ביטוי אחיד בשושלת מסוימת יכול להיות שהוקם על ידי התפשטות מינית. היכולת להפיץ transg clonallyenic הידרה קווים היא יתרון על רוב המודלים של בעלי חיים, אשר יכול להיות מופץ רק על ידי רבייה מינית. בנוסף, ניתן לעקוב אחר תאים מהונדסים בקלות in vivo בשל השקיפות של בעלי החיים והעדר חלבוני ניאון אנדוגני 8. בשבע השנים שחלפה מאז קווי הידרה מהונדסים הראשונים נעשו 1, קווים כאלה היו בשימוש עבור מגוון רחב של יישומים. ביטוי של חלבוני ניאון בתאים מסוגים שונים, הפך אותו ניתן לעקוב אחר תנועת תא, לצפות בשינויים בצורת תא, ולעקוב אחר גורל תא הן בתנאים מסוג בר ולאחר ההפרעות כימיות 1,5,9-12. בנוסף, ביטוי של חלבוני ניאון שונים בשושלות השונות מאפשר לבידוד FACS של אוכלוסיות תאים ספציפיות. טכניקה זו הייתה בשימוש כבר הרצף של mRNAs הספציפי בתאי הגזע וRNA הקטן השושלת הספציפית 13,14. בעוד האמרגן שלאחד משני הגנים אקטין הידרה כבר בשימוש נרחב ביותר, יזמים מסוימים כמה תאים מסוג זוהו ולהשתמש בכונן ביטוי של GFP בהידרה המהונדס 9,11,15,16. בעתיד, יזמים ספציפיים תא מהסוג יאפשר לתצפית והאיסוף של כל סוג תא מסוים. בנוסף, גישה מהונדס הייתה בהצלחה המשמשת להגדרת האלמנטים רגולטוריים cis-בפועל של אמרגן Wnt3 17. פיתוח שיטות מהונדסים בהידרה מספק גישה חזקה לבדיקת תפקודם של גנים על ידי ביטוי מחוץ לרחם, ביטוי יתר, ומציאה. בעלי חיים מהונדסים נעשו שמבטאים חלבוני fluorescently- מתוייגים על מנת לבחון שתי פונקציה ולוקליזציה סלולרית 18-20. בנוסף, הביטוי של סיכות ראש RNA ב3&#39;UTR של transgene GFP מוביל למציאה של גני המטרה 21,22. בגישות אלה נדרש GFP לזהותולעקוב אחר הרקמות מהונדסים במהלך היצירה של הקו המהונדס. עם זאת, סביר להניח כי במקרים מסוימים מולקולת GFP הייתה מפריעה לתפקוד של החלבון מתויג. מחקר שנערך לאחרונה מוכיח כי ניתן לארגן גני הידרה בתצורת אופרון, כלומר, תעתיקי polycistronic נעשים, אשר לאחר מכן הם מופרדים על ידי בנוסף, מנהיג שחבור טרנס ותורגמו בנפרד 23. על ידי הצבת גן קידוד חלבון או סיכת ראש RNA במצב במעלה הזרם של אופרון וגן חלבון פלואורסצנטי בעמדה במורד הזרם, אחד יכול לעקוב אחר רקמות מהונדסים מבלי לתייג את הגן המקודד את חלבון סיכת הראש או RNA. שיטה זו נעשתה שימוש כדי להביע את סיכת ראש RNA בתצורת אופרון עם DsRed2 על מנת להשיג גן מציאה 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>דוא"ל: סלינה ג'וליאנו ב-celina.juliano@yale.edu או Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>ערכת מקסי במהירות גבוהה</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>BD פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 מ"מ זכוכית מיקרוסקופ שקופית</td><td>סיגמא</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוהזרקת דגים עובש</td><td>IBI מדעי</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט זכוכית עם נימה</td> מכשיר <td>סאטר</td><td>BF100-50-10</td><td>OD: 1.0 מ"מ, תעודת זהות: 0.50 מ"מ, אורך 10 ס"מ</td></tr><tr><td>מכשיר סאטר מיקרופיפטה בוער/חום</td><td></td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים תכשיטנים, דורמונט #5</td><td>סיגמא</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל #15</td><td>פישר</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ברזל</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>ג'ויסטיק מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של הטרנסגניים הידרה על ידי microinjection העובר

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

כחברה בפילום Cnidaria, הקבוצה האחות לכל הדו-תאיים, הידרה יכולה לשפוך אור על תהליכים ביולוגיים בסיסיים המשותפים לבעלי חיים רב-תאיים. הידרה משמשת כמודל לחקר התחדשות, היווצרות דפוסים ותאי גזע. עם זאת, מאמצי המחקר נפגעו בשל היעדר שיטה אמינה להפרעות גנים לחקר תפקוד מולקולרי. התפתחות השיטות הטרנסגניות החיתה את חקר הביולוגיה של הידרה 1. הידרה טרנסגנית מאפשרת מעקב אחר תאים חיים, מיון כדי להניב אוכלוסיות תאים טהורות לניתוח ביוכימי, מניפולציה של תפקוד הגנים על ידי נוקדאון וביטוי יתר, וניתוח תפקוד המקדם. DNA פלסמיד המוזרק לעוברים בשלב מוקדם משתלב באופן אקראי בגנום בשלב מוקדם של ההתפתחות. התוצאה היא אבקועים המבטאים טרנסגנים בכתמי רקמה באחת או יותר משלוש השושלות (אפיתל אקטודרמלי, אפיתל אנדודרמלי או אינטרסטיציאלי). שיעור ההצלחה של השגת אבקוע עם רקמה טרנסגנית הוא בין 10% ל-20%. ריבוי א-מיני של האבקוע הטרנסגני משמש להקמת קו טרנסגני אחיד בשושלת מסוימת. יצירת הידרה טרנסגנית היא פשוטה וחזקה באופן מפתיע, וכאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן ליישם בקלות בעלות נמוכה.

הקמת קווי הידרה מהונדסים להאכיל את הגוזלים מהונדסים כל 2-3 ימים עם Nauplii הארטמיה. גוזלים לפעמים לא אוכלים ליום או ימים לאחר הבקיעה. כמה גוזלים חדשים לעולם לא לאכול, ולכן לא ישרדו. אם הגוזל הוא מהונדס באו ectodermal (איור 1 א) או רקמת האפיתל endodermal, לאפשר את בעל החיים לניצן ולאסוף את הניצנים שיש לי הרקמה המהונדס ביותר (איור 1 ב, ג). תמשיך לעשות את זה עם הניצני...

הידרה טרנסגנית יציבה מיוצרת על ידי הזרקת מיקרו של DNA פלסמיד לעוברים ואחריה אינטגרציה גנומית אקראית והתפשטות א-מינית כדי ליצור קו אחיד. הידרה טרנסגנית משמשת למעקב אחר תנועות תאים, ביטוי יתר של גנים, חקר תפקוד המקדם או הפלת ביטוי גנים באמצעות RNAi.

דור של הטרנסגניים הידרה על ידי Microinjection העובר

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להזריק מיקרו DNA פלזמה לעוברי הידרה כדי לייצר קווים טרנסגניים. זה מושג על ידי הכנת תמיסת DNA פלזמה והעמסתה למחט הזרקה. לאחר מכן, תמיסת ה-DNA של הפלזמה מוזרקת לעוברי הידרה בין שלב התא הראשון לשמונה.לאחר מכן נותנים לעוברי ההידרה להתפתח ולבקוע ונבחרים צעירים עם רקמה טרנסגנית. השלב האחרון הוא לייצר קו טרנסגני אחיד על ידי ניצנים א-מיניים של החיה הטרנסגנית המקורית. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת להמחשת ביטוי טרנסגני בהידרה.שיטה זו תוכננה עבור חוקרים שרוצים לייצר קווי הידרו טרנסגניים בעלות נמוכה, ובכך לאפשר יישום רחב יותר של טכנולוגיה שימושית זו, הן עבור חוקרי הידרו הנוכחיים, אך גם עבור אלה שרק רוצים להתחיל להשתמש במודל זה. הידרה טרנסגנית משמשת לחקר דינמיקת רקמות, לוקליזציה של חלבונים, תפקוד גנים על ידי נוקדאון וביטוי יתר, וגם תפקוד מקדם. לאחר הכנת DNA פלזמה על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו צלחת הזרקה על ידי הנחת מיקרוסקופ זכוכית בגודל 75 על 50.החלק לתוך צלחת פטרי בגודל 100 על 15 מילימטר בזווית ממיס 2% אגרוס ב -50 מיליליטר של מדיה הידרה. תן לזה להתקרר. לאחר מכן שפכו אותו לתוך צלחת הפטרי לאחר שהאגרוס התמצק, הסר את מגלשת הזכוכית ובעזרת סכין הגילוח, חתוך את כל האגרוס העודף ליצירת קיר.לאחר מכן שפכו מיד מדיום הידרה לתבשיל והשתמשו בו מיד או אחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. להכנת תמיסת ההזרקה, שלב שלושה מיקרוליטר של 2.5 מיליגרם לתמיסת DNA פלזמה מיליליטר עם שני מיקרוליטרים של תמיסה אדומה של 10% פנול. מערבל את התמיסה לזמן קצר ולאחר מכן סובב אותה במשך 10 דקות במהירות מקסימלית במיקרו צנטריפוגה כדי להסיר חלקיקים שעלולים לסתום את המחט תחת מיקרוסקופ מנתח.השתמש במלקחיים כדי להצמיד את המחט כמה מילימטרים מהקצה כדי ליצור פתח קטן. כוון את צלחת הפטרי המכילה את המחט כך שהמחט תהיה במצב אנכי עם הקצה כלפי מטה. לאחר מכן פיפטה כ-0.5 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה לקצה האחורי של המחט.כדי להכין עוברים להזרקה, התחל בסריקת הידרה, תרבית זן EP לאיתור פוליפים המייצרים ביציות. אוספים את הפוליפים הללו ומעבירים אותם לתבנית תרבית נפרדת. התבונן בפוליפים אלה כל כמה שעות במהלך היום כדי לעקוב אחר התקדמות היווצרות הביציות.כאשר ביציות פורצות את האקטודרם ויושבות על טבעת של תאי עור נסוגים, הן מוכנות להזרקה מניחות פוליפים עם ביציות מוכנות להזרקה בצלחת עם מספר הידרות שיש להן אשכים לפחות שעה לפני ההזרקה כדי לאפשר הפריה אם נקבות נמצאות במושבת EP עם ביציות שנוצרו במלואן או עוברים בשלב אחד עד שמונה תאים. אספו גם אותם להזרקה לפני ההזרקה. השתמש באזמל עם להב מספר 15 כדי להסיר את רוב רקמת ההורה מעל ומתחת לעוברים שהחלו להיבקע, ולהשאיר אותם עם רק חלק קטן מעמוד הגוף של ההורה מחובר.שמור את הרקמה המנותחת במדיום הידרה מכיוון שהיא תתחדש ותבטיח שהנקבות יישארו במושבת ההידרה. השתמש בפיפטה במרעה כדי להעביר את העוברים המבקעים לצלחת הזרקה, וסידר אותם במקביל לדופן שוקת האגרוס. להכנת מזרק המיקרו המותקן על מעמד מגנטי שיושב על צלחת ברזל.התקן את מחזיק ההזרקה, שהוא חלק ממזרק המיקרו המחזיק את המחט על מניפולטור מיקרום ג'ויסטיק. בעזרת מעמד מגנטי התקן את מניפולטור הג'ויסטיק על לוחית הברזל. לאחר מכן הנח את כל ההתקנה בצד ימין של מיקרוסקופ מנתח ומקם את מחזיק ההזרקה כך שיהיה גלוי בשדה התצפית.הנח את צלחת ההזרקה עם עוברים מתחת למיקרוסקופ החיתוך המכוון כך שהקיר האנכי של שוקת האגרוס יהיה שמאלה. הכנס את המחט למחזיק ההזרקה והורד את קצה המחט לתוך מדיום ההידרה שבצלחת. לאחר מכן, סובב לאט את כפתור המזרק בכיוון השעון עד ששמן מינרלי ממלא את החלק העליון של המחט ונצפה זרם קבוע של תמיסת הזרקה היוצא מהמחט לתוך מדיום ההידרה.אם הזרם חזק מדי, הורד את הלחץ על ידי סיבוב הכפתור נגד כיוון השעון. מרכז את העובר בשדה הראייה, והזז את המחט כך שהיא תיגע בעובר. לאחר מכן השתמש במניפולטור המיקרום כדי לנקב את העובר עם המחט ולאפשר לתמיסת ההזרקה לזרום לתוך העובר למשך שנייה או שתיים לפני הסרת המחט במהירות.אם לעובר יש יותר מתא אחד, יש להזריק כל תא בנפרד. המשיכו עד להזרקת כל העוברים. לאחר שכל העוברים הוזרקו, העבירו אותם לכלי עם כמה הידרה, פוליפים EP שיש להם אשכים ודגרו אותם ב-18 מעלות צלזיוס בזמן שהם ממשיכים לעבור אמבריוגנזה.כאשר העוברים מגיעים לשלב הקוטיקולה, העבירו כל עובר לבאר של צלחת של 24 בארות מלאה במדיום הידרה, ודגרו במשך שבועיים בחושך בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, בדוק כל עובר אם הוא מנותק מהפיסה הקטנה של רקמת ההורים והתחדשות הרקמה הזו. אם קיים, הסר אותו מיד כדי שלא יטעה באבקוע חדש.לאחר בדיקת כל עובר, העבירו את המנה מתחת לאור אקווריום בטמפרטורת החדר. בדוק את הצלחות כל יום ואסוף את האבקועים. האבקועים החדשים יהיו בצבע לבן מכיוון שהם עדיין לא אכלו.התבונן בהם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לביטוי טרנסגנים. השתמש באמנות נאפולי כדי להאכיל אבקועים טרנסגניים כל יומיים-שלושה. כאשר אבקועים טרנסגניים ברקמת האפיתל האלקטרודרמלי או האנדודרמיס מייצרים ניצנים, הם מוערכים לביטוי טרנסגנים.מוצג כאן אבקוע עם ביטוי כימרי של Ds אדום, שני טרנסגנים בשליטת מקדם אקטין וטלאי של תאי אפיתל אקטודרמליים. ניצנים מתמשכים על ידי החיה יכולים בסופו של דבר לייצר קו עם ביטוי אחיד של הטרנסגן בשושלת האפיתל האלקטרודרמלי או האנדודרמלי. כפי שניתן לראות כאן, האבקוע המקורי מייצר כעת שני ניצנים חדשים.הניצן המסומן בכוכבית, אינו בעל רקמה טרנסגנית ושימש כבעל החיים המייסד לקו בקרה זהה גנטית לקו הטרנסגני למעט נוכחות הטרנסגן. בעל חיים זה הוא הניצן הראשון עם רקמה טרנסגנית המיוצרת מהאבקוע המקורי. באמצעות ניסויים אלה באמצעות טרנסגנים שאין להם השפעה על התפקוד הביולוגי, נוצרו קווי תאי אפיתל אחידים מכ-30% מההידרה הבוקעים עם רקמה טרנסגנית אפיתלית.קו אלקטרודרמלי אחיד כפי שניתן לראות כאן נוצר בתדירות נמוכה ב-33 עד 50% מקו אנדודרמלי. אז לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור קווי הידרו טרנסגניים, מה שיוסיף לרפרטואר המחקרים הפונקציונליים שתוכל לעשות עם המודל הזה.

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

למד לייצר קווים טרנסגניים יציבים בהידרה באמצעות מיקרו-הזרקת DNA פלסמידי לעוברים בשלבי התפתחות מוקדמים. שיטה זו מאפשרת מחקרי גנטיקה ותהליכי התפתחות ביולוגיים.

דור של הטרנסגניים הידרה על ידי Microinjection העובר

גלה סרטונים נוספים