ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

המטרה הכוללת של הסרטון הבא היא להדגים טכניקה פשוטה ומשתלמת להפקת תשואה טובה של חלבון או קומפלקסים של חלבונים באמצעות מערכת ביטוי יונקים. זה מושג על ידי תרבית תאי HEC 2 93 F בתרחיף בחממת טלטול לחה עם אטמוספירה שנשמרת על 5% פחמן דו חמצני. כשלב שני, התאים עוברים טרנספטציה חולפת עם פלסמיד ביטוי מספר עותק גבוה אחד או יותר.

באמצעות חומר הטרנספקציה פוליאתילן EIN או PEI, התאים הורשו לגדול במשך 48 שעות לפני הקטיף. לאחר מכן טיהור החלבון מתבצע באמצעות שרף זיקה, ואחריו סינון ג'ל לטיהור קומפלקס החלבון המעניין על מנת לבצע מחקרים מבניים ופונקציונליים. בסופו של דבר, מערכת ביטוי יונקים זולה ופשוטה זו מאפשרת ביטוי וטיהור של חלבונים וקומפלקסים חלבונים שקשה לבטא בתאי חיידקים.

היתרון העיקרי של גישה זו הוא הנוחות והרבגוניות שלה לביטוי קומפלקסים של חלבונים. זה קל כמעט כמו ייצור חלבונים בחיידקים, במיוחד מכיוון שאתה יכול לערבב ולהתאים וקטורי ביטוי חלבון. ניתן להשתמש בשיטה בתחילה בקנה מידה קטן כדי לבדוק את הביטוי של קומפרסי חלבון, אך היא ניתנת להרחבה בקלות כדי לייצר תשואה טובה של קומפרסי חלבון למחקרים מבניים ופונקציונליים, המפתח להצלחה הוא שמירה על תאים במצב בריא, נקי מחיידקים או זיהום שמרים.

מכיוון שאנטיביוטיקה בתקשורת מפחיתה מאוד את תפוקת החלבון שלך. כדי להתחיל, הסר בקבוקון קריו המכיל מיליליטר אחד של תאי HEC 2 9 3 F בצפיפות של 20 מיליון תאים למיליליטר מהחנקן הנוזלי והפשיר במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. פרק את כל הגושים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כמה פעמים ופיפטה את כל התוכן לבקבוק תרבית תאים חרוטי של 250 מיליליטר המכיל 34 מיליליטר של מדיה חמה.

הנח את התרבית בחממת טלטול מסלולית לחה ב-37 מעלות צלזיוס, 120 סל"ד ו-5% פחמן דו חמצני לאחר 48 שעות. בדוק את כדאיות התא על ידי טריאן כחול. צביעת כדאיות תאים תקינה בשלב זה היא כ-70% כאשר התאים יגיעו לספירה של כמיליון תאים למיליליטר.

עסו אותם לספירה סופית של 0.35 מיליון תאים למיליליטר לתוך בקבוק תרבית תאים חרוטי של 250 מיליליטר המכיל 60 מיליליטר של מדיה חמה מראש, המשיכו לעסות את התאים כל 48 שעות או כאשר הם מגיעים לחשבון של כ-2 מיליון תאים למיליליטר. מוצגת כאן דגימה של תאי HEC 2 9 3 F של כתם כחול טריאן ב-2.3 מיליון תאים למיליליטר ממלאי מוכן לזריעה לתאי טרנספקציה צריכים להיות נוכחים רק כתאים בודדים או מתחלקים. אם התאים גדלים יתר על המידה, הם ייצרו גושים גדולים ויהיו בעלי כדאיות נמוכה מאוד כפי שמוצג בתמונה זו.

אם תאים יוצרים אשכולות, אלה עשויים להתפרק על ידי מערבולת נמרצת למשך 25 שניות. כדי להתחיל, התרביות בקנה מידה גדול זורעים את התאים בחצי מיליון תאים למיליליטר לנפח סופי של 300 מיליליטר בכל בקבוק רולר של ליטר אחד. דגירה למשך 24 שעות בשייקר מסלולי לח ב-37 מעלות צלזיוס, 135 סל"ד ו-5% פחמן דו חמצני עד שהתאים מגיעים לצפיפות של מיליון תאים למיליליטר.

לאחר מכן, פיפטה בסך הכל 300 מיקרוגרם של DNA מעוקר מסנן לתוך 30 מיליליטר של מי מלח או PBS חוצצים פוספט ומערבולת במרץ למשך שלוש שניות. לאחר מכן הוסף 1.2 מיליליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר. מסננים PEI מעוקר לתמיסת PB SDNA ומערבולת במרץ למשך שלוש שניות נוספות.

דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפני הוספת התערובת לתאים שלאחר מיטת התינוק. טרנספקציה דוגרת על התאים באינקובטור טלטול מסלולי לח למשך 48 שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס, 135 סל"ד ו-5% פחמן דו חמצני לאחר 48 שעות. קצור חלבונים תוך תאיים על ידי צנטריפוגה של תאים ב -3000 פעמים G למשך חמש דקות.

אם כדור התא אינו מיועד לשימוש מיידי, ניתן לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה מותאם לטיהור קומפלקסים של חלבונים מהגרעין שבו לאחד החלבונים יש תג דגל. כדי להתחיל בהחייאת טיהור, השעו את לוח התאים לכ-40 מיליליטר של ליזה מקוררת מראש, חיץ לליטר תרבית, באמצעות שילוב של פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים, וסוניקט הומוגנייזר זכוכית למשך שלושה מחזורים של 15 שניות בהפסקה של 15 שניות.

לאחר מכן צנטריפוגה את ה-108,000 פעמים G למשך 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושמרו על הנטנט שוכב. לאחר מכן, יש לאזן 1.2 מיליליטר של שרף ארוס ארוז נגד דגל לליטר תרבית על ידי שטיפה שלוש פעמים עם מאגר שיווי משקל שרף לדגור את הסופינאט, המייצג את תמצית התא כולו עם שרף הזיקה בצינור צנטריפוגה אחד או יותר של 50 מיליליטר המסתובבים בעדינות במשך 30 עד 120 דקות של ארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגת הדגירה ב-3000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הספינאט, העבירו את השרף לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ושטפו עם סך של 45 מיליליטר של מאגר מקורר מראש, צנטריפוגה אחת לפני ואז השליכו את הכביסה והצנטריפוגה החוזרת באמצעות מאגר מלח גבוה, ואחריו מאגר מלח נמוך ומאגר מחשוף TED.

ודא שכל שטיפה מספיקה כדי להשעות את השרף במלואו אך לא עוד. לאחר מכן, אספו דגימה של 10 מיקרוליטר של שרף ודללו לנפח אחד של פי שניים מאגר העמסת חלבון לניתוח כדי לייצג את דגימת החלבון הקשורה. אל תשתמש בחומרי הפחתה מכיוון שהם ישחררו את הנוגדן מהשרף.

לאחר מכן השעו מחדש את השרף ל-10 מיליליטר של מאגר מחשוף TEV מקורר מראש בכ-40 מיקרוגרם של פרוטאז TEV לליטר תרבית מקורית וערבבו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. ניתן לייעל את רמות הפרוטאז של TEV בהתאם לכמות החלבון המבטא. החלף את אטמוספירת הצינור ב-100% גז חנקן כדי למנוע חמצון חלבון לפני שתסובב בעדינות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.

צנטריפוגה את הדגימה ב-3000 פעמים G למשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את הסופינט למסנן אולטרה צנטריפוגלי עם חתך משקל מולקולרי מתאים והתרכזו עד 500 מיקרוליטר. אסוף דגימה של 10 מיקרוליטר מהחלבון המרוכז ודלל לנפח אחד של פי שניים מאגר העמסת חלבון לניתוח. דגימה זו מייצגת את דגימת ה-TEV eluate.

לאחר מכן אוספים דגימה של 10 מיקרוליטר מהשרף ומדללים לנפח אחד של פי שניים מאגר העמסת חלבון. דגימה זו מייצגת את דגימת שרף ה-TEV שלאחר השלב הבא הוא להעביר את החלבון דרך עמודת אי הכללת גודל ויש להשתמש במטריצת סינון ג'ל מתאימה בהתאם לגודל הקומפלקס המבוקש.

במקרה זה, השתמשנו בעמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל 10 על 300 מילימטר S 200 A משווה את עמודת הכרומטוגרפיה של אי הכללת הגודל עם מאגר סינון ג'ל. מסננים את החלבון דרך מסנן של 0.22 מיקרון וטוענים את הדגימה לעמודה. המשך לאסוף את השברים כשהם יורדים מהעמודה.

כשלב אחרון, בצע SDS poly acrylamide gel electropheresis או SDS page על הדגימות שנאספו, כמו גם את שברי סינון הג'ל, היסטון DS SLA אחד או HD מדכא אחד של השתקה פגומה שלוש או SDS שלוש וסינכרון שלוש, תחום אינטראקציה HDAC או סינכרון שלוש, HID יוצרים קומפלקס סיבוב יציב. ניתן לצפות בטיהור הזיקה של המתחם המסתובב דרך דף SDS. מוצג כאן הקומפלקס המטוהר המיוצר על ידי מיטת תינוק, החוצה שני ליטר תאים.

נתיב החלבון הקשור מראה את הקומפלקס הקשור לשרף הזיקה. לאחר עיכול TEV, התג הקיים על חטא 3 HID נחתך והקומפלקס נרמז ממנו. השרף המוצג כאן הוא כרומטוגרמה של קומפלקס החלבון מטוהר באמצעות עמודת כרומטוגרפיה בגודל 10 על 300 מילימטר S 200

שימו לב שהקומפלקס הטהור חומק קרוב לנפח הריק מכיוון שהוא יוצר דימר בתמיסה. לבסוף, ניתוח עמוד SDS חושף את החלבון המטוהר בשברי סינון הג'ל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל, לתחזק ולתחזק תאי אפליקציה HEC שגדלו בתרחיף קוטרן, כמו גם כיצד להזדהות, לטהר ולרכז את החלבון שלך.

תאים בריאים מורכבים יהיו חיוניים להצלחת הניסויים, לכן וודאו שהם גדלים ומתוחזקים בתנאים ובמעבר שלהם באופן קבוע. אל תירתעו מתרבית רקמות. קל לביולוגים מבניים לבטא ולטהר כמויות גדולות של חלבונים וקומפלקסים של חלבונים מתאי יונקים.