Name: ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: למדו ביטוי חלבון רקומביננטי ביולוגיה מבנית בתאי HEK 293F בתרבית השעיה. שיטה זו מאפשרת ייצור מרוכז של קומפלקסי חלבונים לחקר מבנה ופונקציה בקנה מידה גדול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר Xiaowen יאנג (שירות שיבוט Protex) להכנת מבני ביטוי המשמשים לעבודה זו, והאוניברסיטה של ​​שירותי ביוטכנולוגיה Core לסטר. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת לימודי BBSRC, נאמנות תכנית Wellcome ומענקי חוקר בכירים WT085408 &amp; WT100237 וBBSRC להעניק RM31G0224.

הערה: הפרוטוקול מתאים לכל קנה מידה של ביטוי, ולכן היקפים וכמויות של חומרים כימיים צריכים להיות מדורגים באופן יחסי. וקטור ביטוי יונקים מתאים יש להשתמש בפרוטוקול זה. כאן השתמשנו בוקטור ביטוי pcDNA 3.1 שונה כי בנוחות מאפשר הכללה או אי הכללת תג זיקה בהתאם לבחירה של אנזימי הגבלה בשימוש בשיבוט (איור 1). הפרוטוקול הבא מתאר transfection בקנה מידה גדול. .1 תרבות בקנה מידה גדולה / Transfection בבקבוקי רולר 1 ליטר לגדול ולשמור על תאים מותאמים השעיה HEK293F על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בדרך כלל תרבויות המתנע של בין 30 100 מ&quot;ל גדלים ב250 מ&quot;ל צלוחיות תרבית תאי חרוטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע ב0.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בנפח סופי של 300 מ&quot;ל בבקבוק אחד הרים L 1. הערה: בקבוקי רולר להכיל מינימום של 150 מ&quot;ל עד למקסימום של300 מ&quot;ל של תרבות השעיה. לtransfections קנה מידה הגדול יותר להשתמש בבקבוקים רבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 24 שעות באינקובטור שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס, 120 סל&quot;ד, ו 5% CO 2 עד תאים להגיע לצפיפות של 1.0 x 10 6 תאים / מ&quot;ל (תאים צריכים לחלק בערך כל שעה 24). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה כוללת של 300 מיקרוגרם של DNA-מעוקר מסנן (ראה שיטה נוספת) ל30 מ&quot;ל של PBS ומערבולת במרץ במשך 3 שניות. הערה: השתמש בסכום כולל של 1 מיקרוגרם של DNA למיליון תאי transfected. אם שניים או יותר פלסמידים יש שיתוף transfected-להפחית את הכמות של כל אחד, כך שהיחס של DNA לתאים נשאר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.2 מ&quot;ל של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר מסנן מעוקר PEI לפתרון PBS / DNA והמערבולת במרץ במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על RT עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את DNA / PEI לערבב לתאים - שאמור להיות בצפיפות של 1 x 10 6 מ&quot;ל תאים / (שלב 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שיתוף transfection, דגירה התאיםבחממת ייקר מסלולית ל48 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 120 סל&quot;ד, ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים תאיים קציר על ידי צנטריפוגה תאים ב3,000 XG למשך 5 דקות ולאחסן את גלולה ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין, להשתמש סטנדרטי (לא CO 2) רועד חממה, אם האטמוספרה מעל התרבות מוחלפת עם 5% CO 2 ואת מכסה הבקבוק אטום. האווירה צריכה להיות מוחלפת בכל קטע (בדרך כלל כל 2 ימים). </li></ol> .2 טיהור חלבון מורכב מתמצית תא כל פרוטוקול זה הוא מותאם לטיהור מתחמים גרעיניים באמצעות חלבונים מתויג דגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר תא גלולה ל~ 40 מ&quot;ל של חיץ תמוגה טרום צונן (100 אצטט מ&quot;מ אשלגן, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%, 0.3% טריטון X-100, מעכבי פרוטאז) לכל ליטר של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את גלולה ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים (כדי למנוע הקצפה, לא מערבולת). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות מחדש להשעות תאים באמצעות homogenizer זכוכית. Sonicate ל3 מחזורים (15 שניות על, 15 שניות כבויות). צנטריפוגה ב30,000 XG ל25 דקות ב 4 מעלות ולשמור supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן 1.25 מ&quot;ל של אנטי הדגל ארוז שרף agarose לליטר של תרבות על ידי שטיפת שלוש פעמים עם חיץ איזון שרף (אצטט אשלגן 100 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל תמצית התא מצעד 2.3 עם שרף הזיקה ב50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגה אחת או יותר ובעדינות לסובב את המדגם עבור 30-120 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3,000 XG 1 דקות ב 4 ° C, supernatant קלפים שנזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השרף עם 45 מ&quot;ל של חיץ מראש צונן 1 (100 אצטט מ&quot;מ אשלגן, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%, 0.3% טריטון X-100). צנטריפוגה ב3,000 XG 1 דקות וזורקי supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.7 באמצעות חיץ מלח גבוה (300 אצטט מ&quot;מ אשלגן, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גליצרול 5%), ואחריו חיץ נמוך מלח (אצטט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס 7 pH.5, 5% גליצרול) וTEV מחשוף חוצץ (אצטט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 0.5 מ&quot;מ TCEP). הערה: ודא כל שטיפה הוא כלומר קצר, מספיק באופן מלא מחדש להשעות את השרף ועוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימת 10 μl של שרף ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ 2x טעינת חלבון לניתוח (שליטת חלבון קשורה). אין להשתמש בסוכני הפחתה על מנת להימנע משחרור הנוגדן מהשרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות Re השרף לתוך 8-10 מ&quot;ל של חיץ מחשוף TEV טרום צונן והעברה לצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ~ 40 מיקרוגרם של פרוטאז TEV (מהמלאי ב1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל ליטר של תרבות המקורית ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף אווירת צינור עם גז N 2 100% על מנת למנוע חמצון חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסובב O / N ב4 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב3,000 XG עבור 10 דקות. מעבירים את supernatant לתוך מסנן צנטריפוגלי במיוחד עם ניתוק משקל מולקולרי מתאים ולהתרכזעד 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימת 10 μl של החלבון המרוכז ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ טעינת חלבון 2x לניתוח. (TEV eluate שליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימת 10 μl של השרף ולדלל לתוך הנפח של 1 חיץ טעינת חלבון 2x לניתוח. אל תשתמש צמצום סוכנים על מנת להימנע משחרור כמויות הגדולות של נוגדנים מהשרף. (שליטת שרף Post-TEV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה כרומטוגרפיה הדרת גודל עם חיץ סינון ג&#39;ל (אצטט אשלגן 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 0.5 מ&quot;מ TCEP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את החלבון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם לתוך הטור ולאסוף את השברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ מצעדים 2.9, 2.15 ו2.16 ושברי סינון ג&#39;ל מצעד 2.19 על SDS-PAGE וכתם Coomassie לניתוח. הערה: מומלץ לרוץ SDS-PAGE של דגימות מצעדים 2.9, 2.15 ו2.16 לפני ג&#39;ל סינון כדי לאשר ביטוי של חלבון המטרה.</li>
</ol>

<ol><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li>
<li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ethylenimine%29+and+its+role+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li>
<li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li>
<li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li>
<li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li>
<li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li>
<li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977(2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li>
<li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK%E2%80%90293+Cells%3A+Application+to+Large%E2%80%90Scale+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פיתחנו שיטה יעילה פשוטה ועלות (PEI עולה הרבה פחות מאשר ריאגנטים transfection lipophilic זמינים מסחרי) לביטוי וטיהור כמויות גדולות של חלבונים רקומביננטי ומתחמים רב למקטע מתאי יונקים. ניתן להגיע transfection האופטימלי ויעילות ביטוי אם DNA הטהור ביותר פלסמיד (260/280 בין 1.8 ו2.0) משמש בשילוב עם PEI כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. תאים חייבים להיות מתורבת בתקשורת סרום ואנטיביוטיקה ללא, לכן, טכניקה סטרילית נדרש אך ורק לpassaging ותאי transfecting על מנת למנוע זיהומים יקרים וגוזל זמן. כדאיות תא צריכים להיות 90% או גבוהים יותר ותרבויות לא צריכים להיות מבוגרות כדי צפיפויות גדולות יותר מ2.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל מייד לפני transfection, כשעושה זאת תפחית תשואת חלבון. לtransfection מוצלח, תרבויות צריכים להכיל רק תאים בודדים או החלוקה. אשכולות יכולים להיות שבורים על ידי מרץvortexing היחידות הארגוניות 20 עד 30 שניות (איור 5). היחס של כל פלסמיד המשמש בשיתוף transfection יכול להיות מגוון על ידי המשתמש בהתאם להרכב של ההוויה המורכבת למדה. יעילות ביטוי יכולה להיות מותאמת לחלבון של עניין, כדי שניתן יהיה הוקם זמן ביטוי מתאים. טיהור יש לבצע שמירה הקרה מדגם חלבון בכל העת כדי להפחית את הסיכון של השפלה פרוטאוליטים לא רצויה. הבחירה של תגים ומאגרי טיהור היא קריטית, שכן הם עלולים להפריע לאלמנטים מבניים או אתרים פעילים של חלבונים מסוימים, ופעמים רבות תוצאה מסיסות ו / או אובדן של פעילות האנזימטית מופחתים. transfections בקנה מידה הקטן הם שימושי במיוחד לבדיקת מבנים שונים לטיהור של קומפלקסי חלבונים גדולים. היום, מגוון רחב של שיטות חלופיות זמין לביטוי של חלבונים רקומביננטי אוקריוטים (טבלה 2). לדוגמא, Baculoviביטוי rus בתאי חרקים נעשה שימוש נרחב בשל יעילותה הגבוהה התמרה וחוסרה של cytotoxicity בהשוואה למינים נגיפיים אחרים 6. עם זאת, התהליך של קבלת הווירוס הוא זמן רב וחוסר היציבות שלה אינו מאפשר לנגיף להיות מאוחסן במשך תקופות ארוכות. מצד השני, מערכות שמרי ביטוי להציע את האפשרות של גידול תאי צפיפויות גבוהה מאוד בתרבויות פרמנטור, וכתוצאה מכך התשואות גבוהות של חלבון 7. אבל הם עדיין חסרים את המגוון המלא של שינויים שלאחר translational נדרשים לחלבונים אוקריוטים לקפל בצורה נכונה וליצור אינטראקציה עם שותפי החלבון שלהם. HDAC3, למשל, בא לידי הביטוי, אך לא לקפל בE. coli. עם זאת, כאשר באו לידי ביטוי ב293F תאים, היינו יכול לטהר את האנזים פעיל בקומפלקס עם העמיתים למדכאים שלה (SMRT) ומולקולה של tetraphosphate אינוסיטול (IP4) 8, שלא נמצא בתאים פרוקריוטים. שיטה זו גם אפשרה לנו לטהר ולפתור את הגביש structure של HDAC1 אינטראקציה עם MTA1 במתחם NuRD, אשר מופעל באופן דומה על ידי 9 IP4. באופן אידיאלי, היינו תמיד רוצים להביע את החלבונים אוקריוטים בסביבה הטבעית, הפיזיולוגית שלהם. מערכות ביטוי של יונקים העסקת תאי 293-EBNA1 HEK בbioreactors 10-12 תוארו ותנבנה רמות גבוהות מאוד של חלבון, אבל אלה יכולים להיות מורכבים לשימוש. השיטה שלנו היא חלופה פשוטה ונגישה לביטוי במערכות חיידקים, שמרים וbioreactor. שיטת הביטוי היא מהירה ואינה דורשת שימוש בציוד יקר, במיוחד אם אווירת בקבוק רולר או בקבוק מוחלפת עם 5% CO 2 וחממות רועדות סטנדרטיים משמשות. יש לנו בשימוש בפרוטוקולים אלה לשיתוף transfect פלסמידים מרובים ולטהר מתחמים עם עד חמישה חלבונים עם תשואות של&gt; 1 מ&quot;ג / L של התרבות. מעניין לציין, כי המערכת מסייעת בזיהוי של קומפלקסים מחונכים יציבים. לדוגמא, לשעברpression של המתחם בינארי של HDAC1 וSin3A נתן תשואות מוגבלות של חלבון, אך תוספת של SDS3 הביאה 5 פי סכומים גבוהים יותר, ולכן מנחה את הביולוג המבני בבחירה של מבנים מתאימים ומתחמים יציבים לגיבוש.

ההתקדמות המהירה של ביולוגיה מולקולרית של תא והצורך התמידי בתרופות השתפרו ברפואה יצרו צורך בביולוגים מבניים להסתכל על מבנים חלבוניים יותר ויותר מורכבים. אלה לעתים קרובות יכולים לדרוש שינויים מסוימים שלאחר translational, מלווים מולקולריים ושיתוף גורמים לתמוך מתקפלים המשוכלל שלהם ופעילות האנזימטית. בעוד הרוב המכריע של מבנים קיימים בחלבון נתוני הבנק התקבלו תוך שימוש במערכות ביטוי בקטריאלי, פרוקריוטים אינכם מצליחין לבצע מספר רב של שינויים אלה וחוסר שיתוף גורמים אוקריוטים חיוניים רבים. זה יכול להיות נושא למחקר של מתחמים רב למקטע גדולים שמופעלים על ידי מולקולות איתות קטנות, כמו גם לגרעין, פני תא וחלבונים מופרשים הדורשים מנגנונים קיפול משוכללים. מספר א &#39; זני coli כבר מהונדסים כדי להתגבר על חלק מהמגבלות אלה 1. בשנים האחרונות, עם זאת, השימוש במ &#39;מערכות ביטוי ammalian כבר גדלו, כי הם אמינים לייצר חלבונים האיקריוטים כי הם בעייתיים מבחינה אחרת להביע במערכות אחרות 2. כיום ניתן להשיג שורות תאי יונקים ביטוי יציבים וחולפות באמצעות מגוון רחב של טכניקות שנעות בין התמרה ויראלית לtransfection בתיווך כימי, גן העברה פיזית כגון electroporation והזרקה ישירה 3. בעוד שכל השיטות האלה יש קבוצה של יתרונות וחסרונות משלהם, רק מעטים מהם מתאימים ללימודים מבניים להיות גם רב יקר ו / או גם הפעם. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה מאוד, מהירה, זולה עדיין יעילה ביותר לביטוי קומפלקסי חלבונים לביולוגיה מבנית בתאי יונקים השעיה גדלה. הגישה משתמשת בשיתוף transfection החולף של קו הכליה העוברית אנושי (HEK) תא (לדוגמא, תאי Freestyle HEK 293F). תאים אלה כבר נגזרו מce HEK 293שורת ll, מותאמת לגדול בתרבויות השעיה, הגיעה צפיפות גבוהה באמצעות סרום ללא מדיה (כגון FreeStyle 293 ביטוי בינוני). תאים אז זמני transfected משתמשים בגרסת קנים של polyethylenimine (PEI), מגיב פולימרים זולים שכבר דווח לתפקד לטווח גדול של תאי יונקים 4 על ידי יצירת דנ&quot;א / מתחמי PEI שלהיכנס לתא המארח על ידי אנדוציטוזה 5. שיטה זו מתאימה לשניהם בקנה מידה קטן (30 מ&quot;ל) ובקנה מידה גדול (עד 300 מ&quot;ל) ניסויים ויכולה לייצר רמות גבוהות של קומפלקסי חלבונים מטוהרים. זה שימושי במיוחד ללימוד חלבונים הדורשים מנגנונים מורכבים מתקפלים, שיתוף גורמים או לאחר translational שינויים מסוימים שלא יכול להתבצע על ידי חיידקים, שמרים ותאי חרקים. בפרוטוקול זה אנו מציגים את הביטוי והטיהור של הפיגום המרכזי שלושת חלבון ממתחם דיכוי תעתיק Sin3A. זה מורכב מהיסטוןDeacetylase 1 (HDAC1), מדכאי לקויים השתקת 3 (SDS3) והמתג עצמאי 3 (Sin3A). המורכב המטוהר משמש לניסויי התגבשות תפוקה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>תאי פריסטייל HEK 293F&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק ארלנמאייר עם כובע מאוורר</td> בקבוקי <td>רולר 431144</td><td></td><td></td>קורנינג</tr><tr><td>עם פקקים מאווררים</td><td>קורנינג</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין, 25 kDa, מסועף</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>הכינו מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל ב-H2O, התאימו את ה-pH ל-7.0 עם HCl מדולל ואחסנו ב-20 - 4&ordm; C</td></tr><tr>וקטור <td></td><td></td><td></td><td>ביטוי יונקים</td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח (DPBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל מסננים אולטרה צנטריפוגליים (חתך 10 kDa)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה hek 293f: רומן וגישה נגישה

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

ביטוי וטיהור של כמויות גדולות של קומפלקסים של חלבונים רקומביננטיים הוא דרישה חיונית למחקרי ביולוגיה מבנית. במשך למעלה משני עשורים, מערכות ביטוי פרוקריוטיות כגון E. coli שלטו בספרות המדעית על פני קווי תאים אוקריוטיים יקרים ופחות יעילים. למרות היתרון הברור מבחינת היבול והעלויות של ביטוי חלבונים רקומביננטיים בחיידקים, היעדר גורמים משלימים ספציפיים, צ'פרונים ושינויים לאחר התרגום עלול לגרום לאובדן תפקוד, קיפול שגוי ויכול לשבש אינטראקציות חלבון-חלבון של קומפלקסים אוקריוטיים מרובי יחידות מסוימות, קולטנים על פני השטח וחלבונים מופרשים. השימוש במערכות ביטוי תאי יונקים יכול לטפל בחסרונות אלה מכיוון שהן מספקות סביבת ביטוי אוקריוטית. עם זאת, תפוקות חלבון נמוכות ועלויות גבוהות של שיטות כאלה הגבילו עד לאחרונה את השימוש בהן לביולוגיה מבנית. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה לביטוי וטיהור כמויות מיליגרם של חלבון על ידי ביצוע טרנספקציות חולפות של תאי HEK (כליה עוברית אנושית) 293F שגדלו בתרחיף.

כאן אנו מראים L 2 (8 x 250 תרבויות מ"ל) שיתוף transfection החולף וטיהור של HDAC1, SDS3, מורכב משולש Sin3A. HDAC1 וSDS3 אינטראקציה עם Sin3A דרך תחום HDAC-האינטראקציה (HID) של Sin3A. תשואות טיהור טיפוסיות עד 1 מ"ג של מתחם לליטר של התרבות. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> איור 1 סכמטי של וקטור pcDNA 3.1 ביטוי שונה. פלסמיד היה מתעכל עם EcoRV וEcoRI לכלול זיקת תג ואתר מחשוף TEV בתחנה הסופית אמינו של Sin3A. לשבט גרסאות לא מתויגות של HDAC1 וSDS3, הווקטור היה מתעכל עם KpnI וEcoRI. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> איור 2 SDS-PAG E מראה את הצעד הראשון של הטיהור. הנתיב "החלבון קשור" מציג את המורכבות קשורות לשרף הזיקה. בעקבות עיכול TEV, הווה התג על Sin3A-HID הוא ביקע את ומורכב הוא eluted מהשרף כפי שמוצג בנתיבים השניה והשלישי של ג'ל. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> איור 3 chromatogram של כרומטוגרפיה מטוהרת חלבונים מורכבים באמצעות הדרת גודל. שים לב שמורכב הטהור eluted בחלל הנפח כי זה יוצר דימר בפתרון. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> איור 4 SDS-PAGE מראה את השברים של סינון ג'ל שמוצג באיור 3. r.within-page = "תמיד"&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig5highres.jpg" width="500"> תאי איור 5 Trypan המוכתם כחולים HEK 293F ב2.3x10 6 תאים / מ"ל מוכן להיות transfected. תאים צריכים להיות רק בהווה כתאים בודדים או החלוקה, ואילו אשכולות גדולים עשויים להיות שבורים על ידי vortexing הנמרץ במשך כ 25 שניות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בעיה </td><td> סיבות אפשריות </td><td> פעולה </td></tr><tr><td rowspan="4"> תשואת חלבון נמוכה. </td><td> מספר נמוך של תאי transfected. </td><td> הפוך צפיפות תאים בטוחה היא כ 1.0 x 10 6 לפני הוספת תערובת תגובת transfection לתרבות. </td></tr><tr><td> תאים שאולי היו subcultured יותר מדי פעמים. </td><td> להשתמש בתאי המניה טריים לאחר כ 90 לעבורגילים. </td></tr><tr><td> DNA יכול להיות מושפל או יש כמות גבוהה של זיהומים. </td><td> יש ודא בשימוש פלסמיד דנ"א יחס 260/280 בין 1.8 ו2.0. ריצת DNA על ג'ל agarose מומלץ להעריך את איכותה. </td></tr><tr><td> חלבון (ים) שהביע אינו יציב או מסיס מספיק. </td><td> בחן את המבנים שונים בקנה מידה קטנה לפני הגמלון-transfections. הפוך תגים בטוחים לא מפריעים למבנה של החלבון (ים) של עניין. </td></tr><tr><td> תאים נראים מעונן ויש לי צבע ו / או ריח מוזר. </td><td> תאים נגועים בחיידקים או שמרים. </td><td> טכניקה סטרילית טובה חייבת להיות בשימוש בכל העת. לאוורור זרימת הברדסים למינרית וUV-חיטוי חדר תרבית תאים במקרה של זיהום מסייע המכיל את הבעיה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> יש לי תאים כדאיות נמוכה. </td><td> pH שגוי בתקשורת. </td><td> ודא תרבויות בטוחים גדלים ב5-8% CO 2בכל העת. </td></tr><tr><td> תאים היו בתרבית עד צפיפות מעל 3.0x10 6 תאים / מ"ל. </td><td> לא צריכים להיות מבוגרים תאים עד צפיפויות מעל 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל מייד לפני transfection ולא x מעל 3.0 10 6 / תאים למ"ל. </td></tr><tr><td rowspan="2"> טיהור זיקה לא עבדה </td><td> חלבון (ים) לא בא לידי ביטוי. </td><td> ראה לעיל. </td></tr><tr><td> תנאי טיהור עשויים להיות שגויים. </td><td> התאם תנאי חיץ (למשל, מלח גבוה, נמוך מלח, pH.) </td></tr></tbody></table> טבלת 1 פתרון בעיות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מערכת </td><td> יתרונות </td><td> חסרונות </td></tr><tr><td> חיידק </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירמערכת ביטוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשואות גבוהה של חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים לייצור במחיר סביר של חלבונים שכותרתו isotopically </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסר מלווים חשובים שעשויות להידרש לקיפול חלבונים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסר שינויים שלאחר translational רבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייתכן חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת. </li></ul></td></tr><tr><td> פ pastoris </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לבצע את רוב שינויי translational הודעה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זול </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסר כמה שינויים שלאחר translational </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייתכן חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת. </li></ul></td></tr><tr><td> ביטוי baculovirus בתאי חרקים </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational &lt;/ Li&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Baculovirus הוא פחות רעיל לתאים מאשר זנים נגיפיים אחרים </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הווירוס לתמרה היא זמן רב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הווירוס הוא לא יציב ולא יכול להיות מאוחסן במשך פרקי זמן ארוכים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי חרקים עשויים חוסר שיתוף גורמים החשובים לתפקוד חלבון ו / או הרכבה מורכבת. </li></ul></td></tr><tr><td> ריאקטורים עם מערכות יונקים </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לספק את כל שיתוף הגורמים נחוצים לתפקוד חלבון והרכבה מורכבת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול תאי תרבות בצפיפויות גבוהות מאוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבטא את כל החלבונים של היונקים הדורשים מנגנונים קיפול מורכבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשואות חלבון גבוהות מאוד </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דורש צוות מיוחד כדי להשתמש bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד יקר הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב ביטוי אופטימיזציהים עשוי להיות זמן רב. </li></ul></td></tr><tr><td> תאי השעיה HEK 293F </td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבצע את כל השינויים שלאחר translational </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לספק את כל שיתוף הגורמים נחוצים לתפקוד חלבון והרכבה מורכבת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול לבטא את כל החלבונים של היונקים הדורשים מכונות קיפול מורכבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול transfection מהיר ואינטואיטיבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זול יחסית בהשוואה לbioreactors ו / או חומרים כימיים transfection זמינים מסחרי אחרים. </li></ul></td><td><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות מחיר סביר, לא זול כמו ביטוי בחיידקים </li></ul></td></tr></tbody></table> יתרונות טבלה 2 וחסרונות של מערכות ביטוי עיקריות.

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

המטרה הכוללת של הסרטון הבא היא להדגים טכניקה פשוטה ומשתלמת להפקת תשואה טובה של חלבון או קומפלקסים של חלבונים באמצעות מערכת ביטוי יונקים. זה מושג על ידי תרבית תאי HEC 2 93 F בתרחיף בחממת טלטול לחה עם אטמוספירה שנשמרת על 5% פחמן דו חמצני. כשלב שני, התאים עוברים טרנספטציה חולפת עם פלסמיד ביטוי מספר עותק גבוה אחד או יותר.באמצעות חומר הטרנספקציה פוליאתילן EIN או PEI, התאים הורשו לגדול במשך 48 שעות לפני הקטיף. לאחר מכן טיהור החלבון מתבצע באמצעות שרף זיקה, ואחריו סינון ג'ל לטיהור קומפלקס החלבון המעניין על מנת לבצע מחקרים מבניים ופונקציונליים. בסופו של דבר, מערכת ביטוי יונקים זולה ופשוטה זו מאפשרת ביטוי וטיהור של חלבונים וקומפלקסים חלבונים שקשה לבטא בתאי חיידקים.היתרון העיקרי של גישה זו הוא הנוחות והרבגוניות שלה לביטוי קומפלקסים של חלבונים. זה קל כמעט כמו ייצור חלבונים בחיידקים, במיוחד מכיוון שאתה יכול לערבב ולהתאים וקטורי ביטוי חלבון. ניתן להשתמש בשיטה בתחילה בקנה מידה קטן כדי לבדוק את הביטוי של קומפרסי חלבון, אך היא ניתנת להרחבה בקלות כדי לייצר תשואה טובה של קומפרסי חלבון למחקרים מבניים ופונקציונליים, המפתח להצלחה הוא שמירה על תאים במצב בריא, נקי מחיידקים או זיהום שמרים.מכיוון שאנטיביוטיקה בתקשורת מפחיתה מאוד את תפוקת החלבון שלך. כדי להתחיל, הסר בקבוקון קריו המכיל מיליליטר אחד של תאי HEC 2 9 3 F בצפיפות של 20 מיליון תאים למיליליטר מהחנקן הנוזלי והפשיר במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. פרק את כל הגושים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כמה פעמים ופיפטה את כל התוכן לבקבוק תרבית תאים חרוטי של 250 מיליליטר המכיל 34 מיליליטר של מדיה חמה.הנח את התרבית בחממת טלטול מסלולית לחה ב-37 מעלות צלזיוס, 120 סל"ד ו-5% פחמן דו חמצני לאחר 48 שעות. בדוק את כדאיות התא על ידי טריאן כחול. צביעת כדאיות תאים תקינה בשלב זה היא כ-70% כאשר התאים יגיעו לספירה של כמיליון תאים למיליליטר.עסו אותם לספירה סופית של 0.35 מיליון תאים למיליליטר לתוך בקבוק תרבית תאים חרוטי של 250 מיליליטר המכיל 60 מיליליטר של מדיה חמה מראש, המשיכו לעסות את התאים כל 48 שעות או כאשר הם מגיעים לחשבון של כ-2 מיליון תאים למיליליטר. מוצגת כאן דגימה של תאי HEC 2 9 3 F של כתם כחול טריאן ב-2.3 מיליון תאים למיליליטר ממלאי מוכן לזריעה לתאי טרנספקציה צריכים להיות נוכחים רק כתאים בודדים או מתחלקים. אם התאים גדלים יתר על המידה, הם ייצרו גושים גדולים ויהיו בעלי כדאיות נמוכה מאוד כפי שמוצג בתמונה זו.אם תאים יוצרים אשכולות, אלה עשויים להתפרק על ידי מערבולת נמרצת למשך 25 שניות. כדי להתחיל, התרביות בקנה מידה גדול זורעים את התאים בחצי מיליון תאים למיליליטר לנפח סופי של 300 מיליליטר בכל בקבוק רולר של ליטר אחד. דגירה למשך 24 שעות בשייקר מסלולי לח ב-37 מעלות צלזיוס, 135 סל"ד ו-5% פחמן דו חמצני עד שהתאים מגיעים לצפיפות של מיליון תאים למיליליטר.לאחר מכן, פיפטה בסך הכל 300 מיקרוגרם של DNA מעוקר מסנן לתוך 30 מיליליטר של מי מלח או PBS חוצצים פוספט ומערבולת במרץ למשך שלוש שניות. לאחר מכן הוסף 1.2 מיליליטר של 0.5 מיליגרם למיליליטר. מסננים PEI מעוקר לתמיסת PB SDNA ומערבולת במרץ למשך שלוש שניות נוספות.דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפני הוספת התערובת לתאים שלאחר מיטת התינוק. טרנספקציה דוגרת על התאים באינקובטור טלטול מסלולי לח למשך 48 שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס, 135 סל"ד ו-5% פחמן דו חמצני לאחר 48 שעות. קצור חלבונים תוך תאיים על ידי צנטריפוגה של תאים ב -3000 פעמים G למשך חמש דקות.אם כדור התא אינו מיועד לשימוש מיידי, ניתן לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה מותאם לטיהור קומפלקסים של חלבונים מהגרעין שבו לאחד החלבונים יש תג דגל. כדי להתחיל בהחייאת טיהור, השעו את לוח התאים לכ-40 מיליליטר של ליזה מקוררת מראש, חיץ לליטר תרבית, באמצעות שילוב של פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים, וסוניקט הומוגנייזר זכוכית למשך שלושה מחזורים של 15 שניות בהפסקה של 15 שניות.לאחר מכן צנטריפוגה את ה-108,000 פעמים G למשך 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושמרו על הנטנט שוכב. לאחר מכן, יש לאזן 1.2 מיליליטר של שרף ארוס ארוז נגד דגל לליטר תרבית על ידי שטיפה שלוש פעמים עם מאגר שיווי משקל שרף לדגור את הסופינאט, המייצג את תמצית התא כולו עם שרף הזיקה בצינור צנטריפוגה אחד או יותר של 50 מיליליטר המסתובבים בעדינות במשך 30 עד 120 דקות של ארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגת הדגירה ב-3000 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הספינאט, העבירו את השרף לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר ושטפו עם סך של 45 מיליליטר של מאגר מקורר מראש, צנטריפוגה אחת לפני ואז השליכו את הכביסה והצנטריפוגה החוזרת באמצעות מאגר מלח גבוה, ואחריו מאגר מלח נמוך ומאגר מחשוף TED.ודא שכל שטיפה מספיקה כדי להשעות את השרף במלואו אך לא עוד. לאחר מכן, אספו דגימה של 10 מיקרוליטר של שרף ודללו לנפח אחד של פי שניים מאגר העמסת חלבון לניתוח כדי לייצג את דגימת החלבון הקשורה. אל תשתמש בחומרי הפחתה מכיוון שהם ישחררו את הנוגדן מהשרף.לאחר מכן השעו מחדש את השרף ל-10 מיליליטר של מאגר מחשוף TEV מקורר מראש בכ-40 מיקרוגרם של פרוטאז TEV לליטר תרבית מקורית וערבבו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. ניתן לייעל את רמות הפרוטאז של TEV בהתאם לכמות החלבון המבטא. החלף את אטמוספירת הצינור ב-100% גז חנקן כדי למנוע חמצון חלבון לפני שתסובב בעדינות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.צנטריפוגה את הדגימה ב-3000 פעמים G למשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את הסופינט למסנן אולטרה צנטריפוגלי עם חתך משקל מולקולרי מתאים והתרכזו עד 500 מיקרוליטר. אסוף דגימה של 10 מיקרוליטר מהחלבון המרוכז ודלל לנפח אחד של פי שניים מאגר העמסת חלבון לניתוח. דגימה זו מייצגת את דגימת ה-TEV eluate.לאחר מכן אוספים דגימה של 10 מיקרוליטר מהשרף ומדללים לנפח אחד של פי שניים מאגר העמסת חלבון. דגימה זו מייצגת את דגימת שרף ה-TEV שלאחר השלב הבא הוא להעביר את החלבון דרך עמודת אי הכללת גודל ויש להשתמש במטריצת סינון ג'ל מתאימה בהתאם לגודל הקומפלקס המבוקש.במקרה זה, השתמשנו בעמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל 10 על 300 מילימטר S 200 A משווה את עמודת הכרומטוגרפיה של אי הכללת הגודל עם מאגר סינון ג'ל. מסננים את החלבון דרך מסנן של 0.22 מיקרון וטוענים את הדגימה לעמודה. המשך לאסוף את השברים כשהם יורדים מהעמודה.כשלב אחרון, בצע SDS poly acrylamide gel electropheresis או SDS page על הדגימות שנאספו, כמו גם את שברי סינון הג'ל, היסטון DS SLA אחד או HD מדכא אחד של השתקה פגומה שלוש או SDS שלוש וסינכרון שלוש, תחום אינטראקציה HDAC או סינכרון שלוש, HID יוצרים קומפלקס סיבוב יציב. ניתן לצפות בטיהור הזיקה של המתחם המסתובב דרך דף SDS. מוצג כאן הקומפלקס המטוהר המיוצר על ידי מיטת תינוק, החוצה שני ליטר תאים.נתיב החלבון הקשור מראה את הקומפלקס הקשור לשרף הזיקה. לאחר עיכול TEV, התג הקיים על חטא 3 HID נחתך והקומפלקס נרמז ממנו. השרף המוצג כאן הוא כרומטוגרמה של קומפלקס החלבון מטוהר באמצעות עמודת כרומטוגרפיה בגודל 10 על 300 מילימטר S 200.שימו לב שהקומפלקס הטהור חומק קרוב לנפח הריק מכיוון שהוא יוצר דימר בתמיסה. לבסוף, ניתוח עמוד SDS חושף את החלבון המטוהר בשברי סינון הג'ל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל, לתחזק ולתחזק תאי אפליקציה HEC שגדלו בתרחיף קוטרן, כמו גם כיצד להזדהות, לטהר ולרכז את החלבון שלך.תאים בריאים מורכבים יהיו חיוניים להצלחת הניסויים, לכן וודאו שהם גדלים ומתוחזקים בתנאים ובמעבר שלהם באופן קבוע. אל תירתעו מתרבית רקמות. קל לביולוגים מבניים לבטא ולטהר כמויות גדולות של חלבונים וקומפלקסים של חלבונים מתאי יונקים.

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

Kindlins הוא יסוד להידבקות תא דרך integrins אך מחקרים שלהם כבר הקשו על ידי הקושי שנתקל בביטוים recombinantly במארחי חיידקים. אנו מתארים כאן שיטות לייצור היעילה שלהם בתאי חרקים שנדבקו ב-baculovirus.

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

אנו מציגים גישות עבור biophysical ומבניים אפיון glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים אינטרפרומטריה biolayer, calorimetry איזותרמי טיטור ו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן.

אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

פרוטוקול זה מתאר את ייצור ריבנוקלאז SLFN14 הרקומביננטי האנושי ואת ניתוחו הסטוכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה.<br...

ייצור מהיר של SLFN14 ריבונוקלאז רקומביננטי וניתוח סטויכיומטרי באמצעות פוטומטריית מסה

למדו ביטוי חלבון רקומביננטי ביולוגיה מבנית בתאי HEK 293F בתרבית השעיה. שיטה זו מאפשרת ייצור מרוכז של קומפלקסי חלבונים לחקר מבנה ופונקציה בקנה מידה גדול.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

גלה סרטונים נוספים