Name: Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו איך לגרום לניוון רשתית ולהתחדשותה בדגי זברה בוגרים באמצעות MNU. השיטה משלבת מדידת תגובה אופטוקינטית, צביעת H&E וסימון אימונוהיסטוכימי לניתוח פונקציונלי והיסטולוגי מלא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למוניקה קילכנמן, פדריקה ביסיניאני ואגתה דודה על הסיוע הטכני המצוין.

כל הניסויים דבקו בהצהרה לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר של האגודה לחקר חזון אופתלמולוגיה (ארוו). .1 בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על דג הזברה wild-type (Danio rerio) של זן AB (אורגון) בגילים שבין 6-12 חודשים בתנאים סטנדרטיים במים עם טמפרטורה של 26.5 מעלות צלזיוס ו14/10 שעה מחזור אור / 15 כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של המוסדות המעורבים לניסויים בבעלי החיים לאחר שאושר על ידי לשכת הווטרינרית המחוזית. </li></ol> .2 MNU טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מים המכילים חומר יבש 150 מ&quot;ג / L של -nitrosourea -methyl- N N (MNU). זהירות! MNU הוא רעיל; עלול לגרום לסרטן, נזק גנטי תורשתי או לפגיעה בעובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דג הזברה במים המכילים MNU ל60 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את דג הזברה במהירות עםמים וטריים לשים את הדגים לאקווריום חדש בלי MNU. לשמור על דגים בתנאים סטנדרטיים כל עוד רצוי לניסויים. </li></ol> .3 מדידת חדות ראייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את מערכת optomotor, לבחור &#39;בדיקה&#39; מהתפריט ולהגדיר את האפשרויות ל&quot; מדרגות פשוטות &quot;,&quot; חדות (תדר) &quot;ו16&quot; אקראיים / נפרדים &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן בקבוק עירוי מלא ב500 מ&quot;ל מים על 1 מ &#39;מעל מערכת optomotor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דג הזברה אחד בחדר הבדיקה ולחבר אותו לבקבוק העירוי. מניחים את חדר הבדיקה במערכת optomotor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את המדידה ולבחון את תנועות עיניים בזמן אמת על מסך המחשב. וכך, תגובה חיובית (&quot;כן&quot;) מוגדרת כקפיצות האלה ברציפות בכיוון הנכון, ואילו תשובה שלילית (&quot;לא&quot;) מייצג תנועות עיניים אקראיות דומות לאלה שנצפו עם תחנהשבכות האר&quot;י. אם העיניים של תערוכת דג הזברה שלוש או יותר תגובות optokinetic שלאחר מכן (OKR), לחץ על &#39;כן&#39;; אם לא, לחץ על &#39;לא&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את חדות הראייה, שחושב על ידי התוכנה על ידי קביעת הסף של התדר המרחבי של גירוי optokinetic, תחת &quot;תוצאות&quot; בתפריט. </li></ol> .4 היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את דג הזברה על ידי מנת יתר של אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate (200-300 מ&quot;ג / ליטר) וenucleate העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את כל העיניים בparaformaldehyde 4% (PFA) שבנאגר מלוח פוספט (PBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 12 ולאחר מכן מייבשים את הדגימות בסדרת אלכוהול מדורגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הדגימות בפרפין, לחתוך 5 מיקרומטר סעיפים דרך ראש עצב הראייה (ONH) ולעגן אותן בשקופיות זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם חלקי פרפין deparaffized עם hemalum למשך 4 דקות וטובלים את השקופיות פעמיים במים מזוקקים ואחריו 0.2% ACI הידרוכלוריתאמוניה ד ו0.8%. כתם החלקים עם eosin במשך 3 דקות לאחר הפיתוח של הכתמת hemalum במים ברז לדקות לפחות 10. (H &amp; E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את השקופיות מיובשים בהרכבה בינונית ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ האור. </li></ol> .5 אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transferase deoxynucleotidyl מסוף תיוג סוף dUTP ניק (TUNEL) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפי deparaffinized עם 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​proteinase K בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. שטוף את החלקים שלוש פעמים עם טריס שנאגרו מלוח (TBS) במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הסעיפים בתערובת 50 μl תגובת TUNEL (10% פתרון תיוג ו90% פתרון אנזים) בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות עם ההרכבה בינונית המכיל DAPI ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגרעיני Antigen מכתים תא מתרבים (PCNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את חלקי deparaffinized במאגר אחזור אנטיגן (טריס-EDTA 0.05 + Tween% 20, pH 9.0) במשך 3 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. לחסום עם 100 μl פתרון החסימה (TBS + 10% + 1% אלבומין בסרום שור העז הנורמלי בסרום, pH7.6) בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם עם נוגדנים ראשוניים אנטי PCNA בדילול 1: 200 בתא humidified על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף שלוש פעמים עם כפות + Tween 20 ל5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את זיהוי עם הנוגדנים משני המתאימים בדילול 1: 500 בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות עם ההרכבה בינונית המכיל DAPI ולבחון את השקופיות מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
<li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-N-Nitrosourea+%28MNU%29%3A+A+positive+control+chemical+for+p53%2B%2F-+mouse+carcinogenicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li>
<li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea%3A+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li>
<li>Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).</li>
<li>Tappeiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+rod+regeneration+in+a+novel+zebrafish+retinal+degeneration+model+using+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU).</a> PLOS One. 12, (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Fleisch, C., Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Behavior+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visual Behavior in Zebrafish.</a> Zebrafish. 3, 191-201 (2006).</li>
<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10(2012).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעבר, הקבוצה שלנו העבירה את מודל MNU של ניוון קולטי אור ממכרסמים למערכת דג הזברה 9. האירועים שלאחר מכן תוארו ואחריו לתקופה של עד 30 ימים. בפרק זמן זה ניוון רשתית מלא מורפולוגיים והתחדשות התרחשו לאחר הטיפול הראשוני. ראשית, היסטולוגיה מגלה תא מוט מופחת לספור מיום 3 בעם מינימום ביום .8 במקביל, מכתים TUNEL מזהה אפופטוזיס של קולטני אור מוט 3 ימים לאחר טיפול MNU. התחדשות מתחילה בINL ביום 3, עם מקסימום ביום .5 בONL, יכולים להיות שנצפו תאים מתרבים עד תום תקופת התצפית עם מקסימום...

חזון הוא התחושה חיונית ביותר לאדם ויש לו ירידת הערך שלה השפעה חברתית וכלכלית גבוהה. בעולם המפותח, מחלות ניווניות ברשתית הן הסיבה המובילה לאיבוד ראייה ועיוורון בקרב אנשים מבוגרים 1. הסיבה למרבית המחלות רשתית ניווניות מובנת רק בחלקו ופתרונות טיפוליים כדי להחזיר את החזון אבוד הם מאוד מוגבלים. רטיניטיס פיגמנטוזה הוא דוגמא אופיינית למחלה ניוונית של רשתית עם אובדן קולטי אור העיקרי 2-3. N -methyl- -nitrosourea N (MNU) גורם לניוון רשתית ולכן בשימוש נרחב במכרסמים מודל מחלות עם מוות של תאי קולטי אור עיקריים 4. זה סוכן אלקילציה ומוביל לגידולים שפירים וממאירים, אשר מופיעים בדרך כלל מספר חודשים לאחר החשיפה 5-7. בנוסף, הוא גורם למוות של תאי קולטי אור ספציפיים בתוך תקופת תצפית לטווח קצר. וכך, אובדן structu שכבת הרשתיתמחדש ודילול רשתית משמעותי נצפה באופן תלוי ריכוז. תאי גליה רשתית הופעלו, אך לא חלה שינויים באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נמצאו. אפופטוזיס הקשורות במתח reticulum (ER) endoplasmic נראה המסלול העיקרי של פעולת MNU ברשתית 8. יש לנו לאחרונה הצגתי MNU כמודל כימי כדי לגרום לניוון קולטי אור בדג הזברה 9. , בין שאר, דג הזברה (Danio rerio) הפכה להיות חשובה במחקר חזותי בגלל הדמיון של מערכת הראייה שלה לזה של בעלי חוליות אחרות 10. הרשתית החיצונית מכילה קולטני האור, שניתן לקבץ לארבעה סוגים שונים קונוס עם רגישויות שיא באולטרה הסגול, קצר, בינוני, ואורך גל של הספקטרום הנראה לעין ארוכה וסוג קולטי אור מוט אחד. בשכבת הגרעין הפנימית (INL), גופי התא של הפרעה דו קוטבית, וinterneurons אופקיים, amacrine נמצאים, כמו well כסומה התא של תאי גליה מולר. בשכבת plexiform החיצוני (OPL) הקשרים סינפטיים בין קולטני אור והרשתית הפנימית נוצרים, ואילו שכבת התא הקרובה ביותר לעדשה היא שכבת תא גנגליון (GC), שרכיבים יוצר אקסונים ארוכים המרכיבים את עצב הראייה ומערכת הראייה . קשרים סינפטיים בין תאי הגנגליון והתאים בשכבת הגרעין הפנימי נוצרים בשכבה הפנימית plexiform (IPL) 11. הרשתית נמצאת מחוץ לרשתית נוירו ומקיפה מגזרים חיצוניים קולטי האור עם microvilli הפסגה ארוך 12. יתר על כן, דג הזברה הוא משובי ומסוגלים להצמיח מחדש מוח פצוע, רשתית, חוט השדרה, לב ורקמות אחרות 13 מאוד. כאשר נזק לרשתית מתרחשת, תאים בINL, אשר נחשבו לתאי מולר, מופעלים ויש להם הפוטנציאל להתמיין לסוגי תאים ברשתית שונים. בנוסף, הם גם ליצור אבות מוט, אשר ממוקמים בONL. כך אחרurce שמספק את הרשתית של דג הזברה מבוגרת עם תאים חדשים הוא האזור השולי הריסים. יש צורך במקור זה כדי להשיג צפיפות קבועה של קולטני אור מוט בעין דג הזברה גדלה ברציפות 14. מודל MNU יכול לשמש כגישת ניוון / התחדשות פשוטה לשחזור לרקמת רשתית. בשל דמיון מסוים של תהליכים ביולוגיים בדג זברה ובבני אדם זה יכול לפתוח את הדלתות כדי לזהות מסלולים מעורבים מוות של תאים ולהקרין תרופות נוירו פוטנציאליות. בהתבסס על מחקר קודם מהקבוצה שלנו, אנחנו עכשיו להמחיש את השיטות של מודל דג הזברה-Induced MNU זו של דה ברשתית והתחדשות כתוצאה מכך לרבות שינויים פונקציונליים עם פי מעבדה קטעי וידאו 9.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוקס, שוויץ</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>אמוניה</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>294993</td><td>0.80%</td></tr> <tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI הרכבה בינונית</td><td>Vector Labs, ברלינגיים, קליפורניה, ארה"ב</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr> <tr><td>אתילנדיאמין-טטראצטי (EDTA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>E10521</td><td>טריקאין</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, שוויץ</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב Alexa 594</td><td>Life Technologies, צוג, שוויץ&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>עז סרום רגיל</td><td>Dako, Glostrup, דנמרק</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>320331</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>במקום ערכת זיהוי מוות תאים</td><td>Roche Applied Sciences, רוטקרויץ, שוויץ</td><td>11684795910</td><td>ערכת TUNEL</td></tr><tr><td>תמיסת ההמאלום של מאייר</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Methylnitrosourea (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>N4766</td><td></td></tr><tr><td>Toxic OptoMotry</td><td>CerebralMechanics, לת'ברידג', AB, קנדה</td><td>n.a.Paraformaldehyde</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, שוויץ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, שוויץ</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-PCNA&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, ארה"ב</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus זכוכית שקופיות</td><td>Gehard Menzel GmbH, בראונשווייג, גרמניה</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris תמיסת מלח חוצצת (TBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, בוכס, שוויץ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>סיגמה-אולדריץ', בוכס, שוויץ</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>דג זברה (Danio rerio) AB (אורגון) זן</td><td>אוניברסיטת פריבורג, המחלקה לביולוגיה</td><td>n.a.</td> <td>מתקן דגים משלו</td></tr></tbody></table>

methylnitrosourea (mnu) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

מחלות רשתית ניווניות, רטיניטיס פיגמנטוזה למשל, עם וכתוצאה מכך חשבון נזק קולטי אור עבור רוב אובדן הראייה בעולם התעשייתי. מודלים של בעלי החיים הם בעלי חשיבות מכרעת ללימודי מחלות כגון. בהקשר זה רעלן קולטי האור ספציפי -nitrosourea N -methyl- N (MNU) כבר בשימוש נרחב במכרסמים כדי לגרום פרמקולוגית ניוון רשתית. בעבר, הקמנו מודל מושרה MNU רשתית ניוון בדג הזברה, עוד מערכת מודל פופולרית במחקר חזותי. הבדל מרתק ליונקים הוא נוירוגנזה המתמשכת ברשתית דג הזברה מבוגרת והתחדשותו לאחר פגיעה. כדי לכמת תצפית זו יש לנו עובדי מדידות חדות ראייה בדג הזברה המבוגר. וכך, רפלקס optokinetic שימש למעקב שינויים תפקודיים בדגים שאינם מורדמים. זה היה בתוספת היסטולוגיה, כמו גם staini immunohistochemicalng לאפופטוזיס (TUNEL) וההתפשטות (PCNA) כדי לתאם שינויים מורפולוגיים פיתוח. לסיכום, אפופטוזיס של קולטני אור מתרחש שלושה ימים לאחר טיפול MNU, אשר מלווה ירידה ניכרת של תאים בשכבה החיצונית הגרעינית (ONL). לאחר מכן, התפשטות של תאים בשכבת הגרעין הפנימי (INL) וONL הוא ציין. בזאת, אנו מגלים שלא רק היסטולוגית אך מלאים גם התחדשות תפקודית מתרחשת על פני מסלול של 30 ימים זמן. עכשיו אנחנו ממחישים את השיטות לכמת ומעקב דה דג הזברה רשתית והתחדשות באמצעות MNU בוידאו בפורמט.

חדות ראייה: ניסיוני ההגדרה [תדר המרחבי: 0.042 חוגים / תואר (ג / ד); ניגודיות: 100%; מהירות סחיפה: 20 מעלות / שני (ד / src); בחזרה בהיקות אור: 152 cd / m 2] של מחקר זה אפשרה הערכת OKR של דג הזברה מבוגרת. משך הממוצע של מדידת VA היה על 5 - 10 דקות לכל דג הזברה, אשר נסבל ההליך היטב. חדות ראייה לפני חשיפת MNU היו .577 ± 0.014 מחזורים / תואר (ד / ג). איור 1 מציג את קורס חדות הראייה לאחר הייש...

במסמך זה אנו מדגימים כימות של דה ברשתית והתחדשות והשפעתה על תפקוד ראייה באמצעות -nitrosourea N -methyl- N בדג הזברה המבוגר. מספרי קולטי אור אובדן של חדות ראייה והירידה היו במעקב על ידי התפשטות בשכבת הגרעין הפנימית. התחדשות מורפולוגית ופונקציונלית מלאה התרחשה 30 ימים לאחר הטיפול הראשוני.

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לניוון רשתית וכתוצאה מכך להתחדשות בדג הזברה הבוגר באמצעות n מתיל וניטרו ueaa. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של דג זברה מסוג בר במים המכילים N מתיל N אוריאה חנקתית, או MNU. פונקציית הראייה הבאה מכומתת על ידי מדידת התגובה האופטוקינטית או OKR וחישוב חדות הראייה בנקודות זמן שונות.לאחר הטיפול, דג הזברה מורדם והעיניים מורדמות לבדיקות היסטולוגיות באמצעות צביעת h ו-e כדי לצפות בשינויים מורפולוגיים ברקמת הרשתית. לבסוף, שינויים תאיים נראים ברשתית עם צביעה ספציפית למוות והתפשטות תאים. בסופו של דבר, מדידת חדות הראייה וכימות של שינויים מורפולוגיים ותאים משמשים להמחשת רשתית D והתחדשות.היתרון העיקרי של מודל פרמקולוגי זה הוא שהוא פשוט כמו גם מהיר לשימוש וגורם לניוון והתחדשות אזוריים אמינים בדגי זברה בוגרים כדי לבצע טיפול NM methyl n nitroso urea או MNU התחל בהכנת מים המכילים 150 מיליגרם לליטר MNU יבש. המשך בזהירות תוך כדי עבודה עם nm מתיל ואוריאה חנקתית מכיוון שהוא רעיל ועלול לגרום לסרטן, נזק גנטי תורשתי או נזק. ילד שטרם נולד שומר על זן מסוג AB, דג זברה בן שישה עד 12 חודשים בתנאים סטנדרטיים.מעבירים את דג הזברה למי ה-MNU ומדגרים אותם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש במים מתוקים כדי לשטוף במהירות את הדגים לפני העברתם למיכל דגים חדש ללא MNU. שמרו על הדגים בתנאים סטנדרטיים כל עוד תרצו לניסויים.התכוננו לבצע מדידות חדות ראייה על ידי הפעלת מערכת המנוע. לאחר מכן, מהתפריט, בחר בדיקה והגדר את האפשרויות לגרם מדרגות פשוט. התקן בקבוק עירוי מלא ב -500 מיליליטר מים כמטר מעל מערכת המנוע.הנח דג זברה אחד בתא הבדיקה וחבר אותו לבקבוק העירוי. לאחר מכן הנח את תא הבדיקה במערכת הרכב. לאחר מכן, התחל את המדידה והתבונן בתנועת העיניים בזמן אמת על מסך המחשב.תגובה חיובית או כן, מוגדרת כשניות עוקבות בכיוון הנכון, בעוד שתגובה שלילית או לא מייצגת תנועות עיניים אקראיות הדומות לאלו שנצפו בסורגים נייחים. אם עיני דג הזברה מציגות שלוש או יותר תגובות אופטוקינטיות עוקבות או OKRs, לחץ על כן. אם לא, לחץ על לא.תחת התוצאות בתפריט, חלץ את חדות הראייה, שחושבה על ידי התוכנה על ידי קביעת סף התדר המרחבי של הגירוי הקינטי האופטי לביצוע ניתוח היסטולוגי. לאחר המתת חסד של דג הזברה על פי פרוטוקול הטקסט ובגרעין, העיניים משתמשות בעוצמה של 4% של פורמלדהיד ב-PBS כדי לקבע את העיניים השלמות בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפני שימוש בסדרת אלכוהול מדורגת כדי לייבש את הדגימות, להטמיע את הדגימות בפרפין, ואז לחתוך חמישה מקטעים מיקרומטריים דרך ראש עצב הראייה או ONH ולהרכיב אותם על שקופיות זכוכית. לאחר מכן, השתמש ב-Alam כדי לצבוע את החלקים נטולי הפחמן למשך חמש דקות לפני טבילת השקופיות במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן 0.2% חומצה הידרוכלורית ו-0.8% אמוניה.העבר את המגלשות למי ברז למשך 10 דקות לפחות. העבירו את החלקים לאאוזין למשך שלוש דקות לאחר שטיפה וייבוש השקופיות בסדרת אתנול. השתמש במדיום הרכבה כדי להטמיע אותם ובמיקרוסקופ אור כדי להתבונן בדגימות לטרמינל, העברת נוקלאוטיד חמצן, תיוג DUPT Nick n או מנהרה.הוסף 20 מיקרוגרם למיליליטר פרונאז K כדי לחלק את הקטעים, ודגר אותם בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר שימוש בתמיסת מלח חוצצת טריס כדי לשטוף את החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד, הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת תגובת המנהרה לחלקים ודגר אותם בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר שהדגימות נשטפו והשתמשו שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת, השתמשו במדיום הרכבה המכיל דאפי כדי להרכיב את השקופיות שלפניהם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבצע אנטיגן גרעיני של תאים מתרבים או צביעת PCNA.מניחים את הדגימות בשליפת אנטיגן, חוצצים ומרתיחים במשך שלוש דקות לפני שטיפה ב-TB S3 פעמים למשך חמש דקות בכל שעה באמצעות מאגר חוסם, דגרו את הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז עם דילול של 1 ל-200 של NA נגד PC. נוגדנים ראשוניים, דגרו את הדגימות בתא לח למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לאחר שטיפת הדגימות עם TBS בתוספת טווין 23 פעמים במשך חמש דקות כל אחת. השתמש בדילול של 1 עד 500 של נוגדנים משניים כדי לדגור את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר שהשקופיות הותקנו עם מדיום הרכבה המכיל dpi, התבונן בהן תחת המיקרוסקופ הקרינה. איור זה מציג את מסלול חדות הראייה של דג זברה בוגר לאחר יישום של 150 מיקרוגרם לליטר MNU. החל מהיום הראשון, המדידות חשפו ירידה ניכרת בחדות הראייה שהגיעה לערכי מינימום ביום השלישי לפני עלייה בערכים.המשיך ביום השמיני והגיע להחלמה מלאה ביום ה-30 כפי שניתן לראות באמצעות ניתוח היסטולוגי של ניוון הרשתית של עין דג הזברה, שעקב אחריו במשך 30 יום לאחר הטיפול ב-MNU שכלל הפרעה של ה-INL עם היווצרות חורים של ה-ONL החל מהיום השלישי, ועם אובדן מקסימלי של רוד ONL שנצפה ביום השמיני באמצעות צביעת תעלה חיובית בשכבות שונות של הרשתית התחושתית. נצפה כי ניוון הרשתית לאחר טיפול ב-MNU נגרם על ידי אפופטוזיס כאשר רוב התאים החיוביים למנהרה נמצאו ב-ONL ביום השלישי. עם זאת, תאים גוססים נראו גם ב-INL באותה נקודת זמן.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לניוון רשתית בדגי זברה בוגרים על ידי שימוש בטיפול m ו-you, כמו גם כיצד לכמת שינויים תפקודיים ומורפולוגיים באמצעות מדידת OKR והליכים אימונוהיסטוכימיים.

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקולי נזק קלים מרובים כבר תאר לקולטני אור וכתוצאה מכך לנזק לגרום תגובת התחדשות רשתית בדג זברה מבוגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה משופרת, שניתן להשתמש בבעלי החיים פיגמנט ושפוגע ברוב המכריע של מוט וקולטני אור חרוט על פני כל הרשתית.

פרדיגמה נזק קלה לשימוש ברומן רשתית מחקרי התחדשות בדג הזברה למבוגר

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

הכליות מבוגרות דג הזברה היא מערכת מצוינת ללימודי התחדשות ומחלת כליות. היבט חיוני של מחקר כזה הוא ההערכה של מבנה נפרון ותפקוד. פרוטוקול זה מתאר כמה שיטות שניתן ליישם על מנת להעריך הרכב אבובית נפרון ולהעריך את ספיגה של כליות.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

כדי לעזור להעריך את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי דג הזברה, הקמנו מודל פגיעה בכבד שבו הפטוציטים המבטאים ניטרורודוקטאז מבוטלים גנטית בטיפול במטרונידזול.  בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לתמרן במיומנות, לנטר ולנתח אבלציה של הפטוציטים והתחדשות כבד מונעת מרה.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

חשיפת teratogens עלולה לגרום למומים מולדים. דג זברה היא שימושי לקביעת פוטנציאל טרטוגניות של כימיקלים. אנו להדגים את התועלת של דג זברה על ידי חשיפה עוברת לרמות שונות של ניטריט וגם בזמנים שונים של חשיפה. אנו מראים כי ניטריט יכול להיות רעיל ולגרום ליקויים התפתחותיים חמורים.

דג הזברה כמודל להעריך את הפוטנציאל טרטוגניות של ניטריט

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

להערכת טיפולים בתאי גזע חדש חשוב הלא פולשני המסלול התאים מוזרקים in vivo. סרט הווידאו הזה יראה לכם כיצד לתייג אדם בתאי גזע mesenchymal ו עובריים עם סוכני תחמוצת ברזל מבוסס בניגוד in vivo עבור הבאים MR הדמיה in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

נזק כלייתי אקוטי (AKI) בבני אדם היא בעיה קלינית נפוצה נגרמת על ידי נזק לתאי האפיתל המרכיבים nephrons כליות, AKI קשור עם שיעורי תמותה גבוהים של 5-70% 1. לאחר חורבן תא אפיתל, nephrons יש יכולת מוגבלת להתחדש, אם כי המנגנונים והמגבלות המנחים את התופעה הזאת להישאר ממעטים להבין. במאמר זה וידאו, אנחנו מתארים את הטכניקה שלנו אבלציה לייזר ממוקד של תאים נפרון כליה כליות העובר דג הזברה, או כלית ראשית. השיטה החדשה שלנו יכול לשמש כדי להשלים nephrotoxicity-Induced דגמים של AKI ולהשיג הבנה ברזולוציה גבוהה של...

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

למדו איך לגרום לניוון רשתית ולהתחדשותה בדגי זברה בוגרים באמצעות MNU. השיטה משלבת מדידת תגובה אופטוקינטית, צביעת H&E וסימון אימונוהיסטוכימי לניתוח פונקציונלי והיסטולוגי מלא.

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

גלה סרטונים נוספים