בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח
23 בספטמבר 2014
ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולהפיק חלבון ממסתמי לב עובריים. זה מושג על ידי בידוד עובר מעכבר בהריון. בשלב השני מנתחים את הלב מהעובר, ואז אוספים את מסתמי הלב בשלב האחרון.
הרקמה עוברת ליזה ודגימת החלבון המתקבלת מוכנה לניתוח שלאחר מכן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח BLO מערבי כדי להעריך את רמות ביטוי החלבון. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הדיסקציה בגלל הצורה הקומפקטית הקטנה של הלב המתפתח.
ביום ההתפתחות העוברי הרצוי, השתמש באתנול 70% כדי לעקר את הבטן של הנקבה ההרה. לאחר מכן הרם את העור והשריר של הבטן התחתונה למעלה והרחק מהאיברים הפנימיים, ונתח את חלל הבטן התחתונה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם. לאחר מכן, החזיקו את צוואר הרחם בעזרת מלקחיים וחתכו בזהירות את הקפיצה לקצות.
לאחר מכן הרם את קרן הרחם תוך חיתוך כל רקמת חיבור השומרת על הקרן במקומה, והשלם את ההסרה על ידי חיתוך צומת קרן הרחם עם ה-uct. מניחים את קרן הרחם המנותחת בצלחת פטרי המכילה בופר טריס קר של 0.1 מולארי ושוטפים לפי הצורך. ואז חותכים את קרן הרחם.
פתח לאורכו כדי לחשוף את השקים העובריים. כדי לחשוף עובר, חתכו שק עוברי בצומת השליה והעובר, וחתכו את כלי הטבור כדי לשחרר את העובר. מניחים את העובר המנותח בצלחת פטרי שנייה עם חיץ טריס מולארי קר של 0.1 מולארי, ומחזירים את צלחת הפטרי הראשונה עם העוברים הנותרים שנותחו לקרח עד לדיסקציה העוברית הבאה.
לאחר עריפת הראש, הניחו את העובר על גבו וחתכו את דופן החזה אנכית לאורך הצד של כלוב הצלעות ליד צליעה ואופקית מעל הסרעפת. כדי לדמיין את הלב, פתח את דופן החזה. לאחר מכן החזיקו את המלקחיים גבוה לאורך הכלים הגדולים, הרימו את הלב וחתכו את הכלים שמתחת.
לאחר מכן, חתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי הריאה נשארים לא חתוכים, הסר את הריאות עם הלב לפני שתמשיך בשלבים העובריים המתוארים כאן, עורק הריאה אטום מעט. לאחר זיהוי העורק יש לחתוך ולהסיר אותו מעל מפלס השסתום.
כעת, חתכו ממש מתחת למסתם הריאתי, הימנעו משריר הלב החדרי ECD, והסירו את מאגר התריס העודף הרחק מאזור העניין. לפני הנחת המסתם בצינור איינור המכיל שני מיקרוליטרים של מאגר ליזה כמו עורק הריאה, אבי העורקים ייראה מעט אטום. לאחר זיהויו, יש לחתוך ממש מתחת למסתם אבי העורקים.
שוב, הימנעות משריר הלב החדרי הטרבקולטיבי. הסר כל תמיסת טרי עודפת, ולאחר מכן העבר את השסתום לצינור ה-einor המכיל ליזה, חיץ ורקמת עורק ריאה. לאחר איסוף כל הרקמה, הניחו מיד את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להמשך הדרך.
השתמשו למיצוי החלבון, הפשירו את הרקמות שנאספו על קרח, ולאחר מכן גלולו את הדגימות למשך דקה אחת ב-13, 100 גרם בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את נפח הדגימה המתקבלת והשתמש במאגר ליזה כדי להביא את הנפח הכולל עד 40 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף חרוזי נירוסטה של חמישה מילימטר כדי לשבש ולהומוגניזציה של הדגימות בליר למשך שתיים עד ארבע דקות ב-50 הרץ, לפי הוראות היצרן.
לאחר ההומוגניזציה, סובבו צינורות לזמן קצר והעבירו את הדגימות לצינורות חדשים, והשאירו מאחור את הפסולת הבלתי מסיסה לניתוח ניסיוני נוסף. באמצעות טכניקת הכנה זו, ניתן לזהות smad זרחני 1 5 8 באזורי מסתם אבי העורקים בודד מעוברי E 13.5. לדוגמה, החלבון המבודד אפילו מאזור שסתום בודד מספיק כדי לזהות פס p smad חלש כאשר עוצמת האות גדלה באופן פרופורציונלי למספר אזורי השסתומים המאוגדים.
חשוב לציין, יחס ה-p smad beta actin נשאר קבוע בבירור על פני גדלי הדגימה השונים בשל הרמות הנמוכות של חלבון זמין, לא ניתן להפשיט את אותו כתם ולבדוק מחדש עבור smad כולל. עם זאת, כתם נפרד המציג סה"כ סמאד-וואן ובטא אקטין מציג את אותו דפוס ביטוי. אזורי מסתמים אלה נטולי כמעט לחלוטין זיהום שריר הלב החדר באמצעות טכניקת הכנה זו בשילוב עם דגימות מהחדר הימני, סמן שריר הלב החדר, NP אינו ניתן לזיהוי באזורי מסתם אבי העורקים, בעוד שסמן זה מזוהה בקלות בחדר.
יתר על כן, סמן שריר הלב החדר מיוזין שרשרת קלה 2 V ניתן לזיהוי בקלות גם בדגימת החדר, אך בקושי ניתן לזהות אותו באזורי המסתם האאורטלי המדגישים את דיוק הדיסקציה לאחר דיסקציה זו. ניתן לבצע MEs אחרים כמו QPCR או RN AIC על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים במורד הזרם מושפעים במהלך שלבי ההתפתחות השונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד והפקה של חלבון ממסממי לב עובריים בעכברים. השיטה נותנת מענה לאתגרים בניתוח ביטוי חלבונים הנובעים מזמינות מוגבלת של רקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מחקר קרדיווסקולרי
רקע
- ניתוח ביטוי חלבונים ברקמות עובריות מוגבל לעיתים קרובות על ידי גודל הדגימה.
- הבנת רמות החלבונים במסתמי הלב היא קריטית למחקרי התפתחות.
- ניתוח Western blot הוא טכניקה נפוצה להערכת ביטוי חלבונים.
- דיסקציה של רקמות קטנות, כגון לבבות עובריים, עלולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להפקת חלבונים ממסתיבי לב של עוברי עכבר.
- הקלה על ביצוע אנליזת western blot לבדיקת רמות ביטוי של חלבונים.
- שיפור השחזוריות והדיוק בניתוח חלבונים מדגימות מוגבלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד עוברי עכברים בהריון.
- הוצאת הלב מהעובר.
- איסוף מסתמי לב לצורך מיצוי חלבונים.
- ליזיס של רקמה להכנת דגימות חלבון לניתוח.
תוצאות עיקריות
- מיצוי מוצלח של חלבון ממסתמי לב עובריים.
- הכנת דגימות המתאימות לניתוח western blot.
- הדגמה של טכניקות דיסקציה ללמידה יעילה.
- הערכת רמות ביטוי של חלבונים ברקמות לב בהתפתחות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של ביטוי חלבונים במסתמי לב עובריים.
- עזרים חזותיים חיוניים לשליטה בטכניקות נתיחה.
- שיטה זו עשויה לקדם את המחקר בהתפתחות הלב ובתחומים קשורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד חלבונים מרקמה עוברית מוגבלת מאפשר זיהוי של הפעלה של מסלולי איתות במודלים של התפתחות מוקדמת. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות על ידי אספקת נתונים חצי-כמותיים על חלבונים זפוספורים מאזורי מסתמים מאוחדים שעברו מיקרו-דיסקציה. השיטה נותנת מענה למחסור משמעותי במחקר פרה-קליני, שבו מחסור בדגימות מעכב את הפחתת הסיכונים המכניסטיים של מטרות קרדיו-וסקולריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בהתפתחות שסתומי הלב באמצעות זיהוי של חלבוני איתות מאושרפוספרילים כגון pSmad1/5/8.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור להפקת חלבון מארבעה אזורים של שסתום אביאלי בעכבר בשלב E13.5, כאשר כל אזור מניב כ-1 µg חלבון.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי מתן אפשרות להערכה חצי-כמותית של הפעלת מסלולים במערכות עובריות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של דגימות ביולוגיות מאושרות לניתוח Western blot בהמשך, המאפשרת הערכה אמינה של תרכובות בסריקה פנוטיפית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ליזיס והומוגניזציה באמצעות באפר מבוסס Tris עם מעכבי פרוטאז ובאפר דגימה עם SDS לדה-נטורציה.
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה על פני נקודות זמן התפתחותיות שונות על ידי איגור רקמות כדי להתגבר על מגבלות של תפוקת חלבון נמוכה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת נתוני ביטוי חלבון משלב הגילוי לאישוש פרה-קליני באמצעות יחסי pSmad/β-actin עקביים במגוון גדלי דגימות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מצמצמת עמימות במעורבות המטרה על ידי אישור החרגת שריר הלב החדרתי, באמצעות היעדר סממני MYL2V ו-ANP באזורי המסתמים.
- ביטחון ניבוי: מאפשרת קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי קישור תבניות ביטוי חלבון לשלבי פיתוח באמצעות בקרות פנימיות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), באמצעות אספקת תוצאות מכניסטיות ממערכות עובריות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות זיהוי של חלבוני סיגנל מפוספורים ברקמת המסנן.
- סריקה: מספק דגימות מוכנות לבדיקה עם מיצוי חלבון סטנדרטי, המאפשר תוצאות Western Blot הדירות לסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות כמותיות של המשתנה התלוי באמצעות עוצמת אות כימילומינצנטי פרופורציונלית לגודל מאגר החלבון, ובכך תומך בניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: שומר על רציפות מהגילוי השערי למודלים פרה-קליניים על ידי שימור דפוסי ביטוי ספציפיים למסלול, הניתנים לזיהוי בבדיקות נפרדות עבור total Smad ו-β-actin.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת להרחבה לבידוד חלבונים במגוון מחקרים קרדיווסקולריים עובריים, ובכך מפחית פיתוח חזר של פרוטוקולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לגילוי חלבונים זרחניים בריכוז נמוך מרקמות שעברו מיקרו-דיסקציה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות נפחי ליזיס מוגדרים, הומוגניזציה מבוססת חרו지를 והכנת דגימות עקבית עבור western blot.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכנית בהערכה מוקדמת של מטרות קרדיווסקולריות.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעוד עדיפויות מותאם סיכון על ידי אספקת נתוני הפעלה חצי-כמותיים של מסלולים מאזורי שסתומים עובריים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-דיסקציה של מבני לב עובריים כדי לבודד את אזורי השסתומים ללא זיהום של מיוקרדיום ונטריקולרי.
- תלוי בציוד להומוגניזציה (lyser עם כדוריות פלדת אל חלודה) וצנטריפוגציה ב-13,100 × g לצורך הבהרה של הדגימה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של נפחי באפר ליזיס (נפח סופי של 40 µL) ושימוש במעכבי פרוטאז כדי להבטיח עקביות של הדגימות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על רקמות עובריות אחרות או שלבי התפתחות מעבר לאזורי השסתום האאורטלי ביום E13.5.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון חוסר יכולת לכמת את החלבון הכולל באמצעות ספקטרופוטומטריה בשל תפוקה נמוכה, מה שמחייב הסתמכות על אנליזה חצי-כמותית של western blot.
