בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח
23 בספטמבר 2014
ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולהפיק חלבון ממסתמי לב עובריים. זה מושג על ידי בידוד עובר מעכבר בהריון. בשלב השני מנתחים את הלב מהעובר, ואז אוספים את מסתמי הלב בשלב האחרון.
הרקמה עוברת ליזה ודגימת החלבון המתקבלת מוכנה לניתוח שלאחר מכן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח BLO מערבי כדי להעריך את רמות ביטוי החלבון. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הדיסקציה בגלל הצורה הקומפקטית הקטנה של הלב המתפתח.
ביום ההתפתחות העוברי הרצוי, השתמש באתנול 70% כדי לעקר את הבטן של הנקבה ההרה. לאחר מכן הרם את העור והשריר של הבטן התחתונה למעלה והרחק מהאיברים הפנימיים, ונתח את חלל הבטן התחתונה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם. לאחר מכן, החזיקו את צוואר הרחם בעזרת מלקחיים וחתכו בזהירות את הקפיצה לקצות.
לאחר מכן הרם את קרן הרחם תוך חיתוך כל רקמת חיבור השומרת על הקרן במקומה, והשלם את ההסרה על ידי חיתוך צומת קרן הרחם עם ה-uct. מניחים את קרן הרחם המנותחת בצלחת פטרי המכילה בופר טריס קר של 0.1 מולארי ושוטפים לפי הצורך. ואז חותכים את קרן הרחם.
פתח לאורכו כדי לחשוף את השקים העובריים. כדי לחשוף עובר, חתכו שק עוברי בצומת השליה והעובר, וחתכו את כלי הטבור כדי לשחרר את העובר. מניחים את העובר המנותח בצלחת פטרי שנייה עם חיץ טריס מולארי קר של 0.1 מולארי, ומחזירים את צלחת הפטרי הראשונה עם העוברים הנותרים שנותחו לקרח עד לדיסקציה העוברית הבאה.
לאחר עריפת הראש, הניחו את העובר על גבו וחתכו את דופן החזה אנכית לאורך הצד של כלוב הצלעות ליד צליעה ואופקית מעל הסרעפת. כדי לדמיין את הלב, פתח את דופן החזה. לאחר מכן החזיקו את המלקחיים גבוה לאורך הכלים הגדולים, הרימו את הלב וחתכו את הכלים שמתחת.
לאחר מכן, חתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי הריאה נשארים לא חתוכים, הסר את הריאות עם הלב לפני שתמשיך בשלבים העובריים המתוארים כאן, עורק הריאה אטום מעט. לאחר זיהוי העורק יש לחתוך ולהסיר אותו מעל מפלס השסתום.
כעת, חתכו ממש מתחת למסתם הריאתי, הימנעו משריר הלב החדרי ECD, והסירו את מאגר התריס העודף הרחק מאזור העניין. לפני הנחת המסתם בצינור איינור המכיל שני מיקרוליטרים של מאגר ליזה כמו עורק הריאה, אבי העורקים ייראה מעט אטום. לאחר זיהויו, יש לחתוך ממש מתחת למסתם אבי העורקים.
שוב, הימנעות משריר הלב החדרי הטרבקולטיבי. הסר כל תמיסת טרי עודפת, ולאחר מכן העבר את השסתום לצינור ה-einor המכיל ליזה, חיץ ורקמת עורק ריאה. לאחר איסוף כל הרקמה, הניחו מיד את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להמשך הדרך.
השתמשו למיצוי החלבון, הפשירו את הרקמות שנאספו על קרח, ולאחר מכן גלולו את הדגימות למשך דקה אחת ב-13, 100 גרם בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את נפח הדגימה המתקבלת והשתמש במאגר ליזה כדי להביא את הנפח הכולל עד 40 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף חרוזי נירוסטה של חמישה מילימטר כדי לשבש ולהומוגניזציה של הדגימות בליר למשך שתיים עד ארבע דקות ב-50 הרץ, לפי הוראות היצרן.
לאחר ההומוגניזציה, סובבו צינורות לזמן קצר והעבירו את הדגימות לצינורות חדשים, והשאירו מאחור את הפסולת הבלתי מסיסה לניתוח ניסיוני נוסף. באמצעות טכניקת הכנה זו, ניתן לזהות smad זרחני 1 5 8 באזורי מסתם אבי העורקים בודד מעוברי E 13.5. לדוגמה, החלבון המבודד אפילו מאזור שסתום בודד מספיק כדי לזהות פס p smad חלש כאשר עוצמת האות גדלה באופן פרופורציונלי למספר אזורי השסתומים המאוגדים.
חשוב לציין, יחס ה-p smad beta actin נשאר קבוע בבירור על פני גדלי הדגימה השונים בשל הרמות הנמוכות של חלבון זמין, לא ניתן להפשיט את אותו כתם ולבדוק מחדש עבור smad כולל. עם זאת, כתם נפרד המציג סה"כ סמאד-וואן ובטא אקטין מציג את אותו דפוס ביטוי. אזורי מסתמים אלה נטולי כמעט לחלוטין זיהום שריר הלב החדר באמצעות טכניקת הכנה זו בשילוב עם דגימות מהחדר הימני, סמן שריר הלב החדר, NP אינו ניתן לזיהוי באזורי מסתם אבי העורקים, בעוד שסמן זה מזוהה בקלות בחדר.
יתר על כן, סמן שריר הלב החדר מיוזין שרשרת קלה 2 V ניתן לזיהוי בקלות גם בדגימת החדר, אך בקושי ניתן לזהות אותו באזורי המסתם האאורטלי המדגישים את דיוק הדיסקציה לאחר דיסקציה זו. ניתן לבצע MEs אחרים כמו QPCR או RN AIC על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים במורד הזרם מושפעים במהלך שלבי ההתפתחות השונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד והפקה של חלבון ממסממי לב עובריים בעכברים. השיטה נותנת מענה לאתגרים בניתוח ביטוי חלבונים הנובעים מזמינות מוגבלת של רקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מחקר קרדיווסקולרי
רקע
- ניתוח ביטוי חלבונים ברקמות עובריות מוגבל לעיתים קרובות על ידי גודל הדגימה.
- הבנת רמות החלבון במסתמי הלב היא קריטית למחקרי התפתחות.
- ניתוח Western blot הוא טכניקה נפוצה להערכת ביטוי חלבונים.
- נתיחה של רקמות קטנות, כגון לבבות עובריים, עלולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להפקת חלבונים ממסממי לב של עוברי עכבר.
- סיוע בניתוח western blot לבדיקת רמות ביטוי של חלבונים.
- שיפור השחזוריות והדיוק בניתוח חלבונים מדגימות מוגבלות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד עובריים מעכברות בהריון.
- דיסקציה של הלב מהעובר.
- איסוף מסתמי לב להוצאת חלבונים.
- ליזיס של הרקמה להכנת דגימות חלבון לאנליזה.
תוצאות עיקריות
- מיצוי מוצלח של חלבון ממסממי לב עובריים.
- הכנת דגימות המתאימות לניתוח western blot.
- הדגמה של טכניקות דיסקציה ללמידה יעילה.
- הערכת רמות ביטוי של חלבונים ברקמות לב בהתפתחות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של ביטוי חלבונים במסתמי לב עובריים.
- עזרים חזותיים חיוניים לשליטה בטכניקות ההפרדה.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר בהתפתחות הלב ובתחומים קשורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד חלבונים מרקמה עוברית מוגבלת מאפשר זיהוי של הפעלת מסלולי איתות במודלים של התפתחות מוקדמת. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) באמצעות אספקת נתונים חצי-כמותיים על חלבונים מאושרפטים מאזורי מסתמים שגולקו במיקרו-דיסקציה. השיטה נותנת מענה לצוואר בקבוק מרכזי במחקר פרה-קליני, שבו מחסור בדגימות מעכב את הפחתת הסיכונים המכניסטית של מטרות קרדיווסקולריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות בהתפתחות מסתמי הלב באמצעות זיהוי של חלבוני סיגנל מאופספרים כגון pSmad1/5/8.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה הניתנת לשחזור עבור מיצוי חלבון מארבעה אזורים של מסתמי אאורטה בעכברים בשלב E13.5, כאשר כל אזור מניב כ-1 µg חלבון.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי מתן אפשרות להערכה חצי-כמותית של הפעלת מסלולים במערכות עובריות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של דגימות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך ניתוח downstream ב-western blot, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות בסריקה פנוטיפית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ליזיס והומוגניזציה באמצעות בופר מבוסס Tris עם מעכבי פרוטאז ובופר דגימה עם SDS לצורך דנטורציה.
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה לאורך נקודות זמן התפתחותיות על ידי איסוף רקמות כדי להתגבר על מגבלות של תנובה נמוכה של חלבונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת נתוני ביטוי חלבונים משלב הגילוי לאישוש פרה-קליני באמצעות יחסי pSmad/β-actin עקביים על פני גדלי מדגמים שונים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מפחיתה עמימות במעורבות המטרה על ידי אישור של החראת שריר לב הבטןקים, באמצעות היעדר סממני MYL2V ו-ANP באזורי המסתמים.
- ביטחון חיזוי: מאפשרת קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון על ידי קישור דפוסי ביטוי חלבונים לשלבי פיתוח באמצעות בקרות פנימיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, מהבדיקה של היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת קריאות מכניסטיות ממערכות עובריות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות זיהוי של חלבוני איתות מאופסרס ברקמת מסתמים.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה עם מיצוי חלבון סטנדרטי, המאפשר תוצרי western blot הניתנים לשחזור לסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות עוצמת אות כימולומינסנטי הפרופורציונלית לגודל מאגר החלבון, התומכת בניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות מגילוי עוברי למודלים פרה-קליניים על ידי שימור דפוסי ביטוי ספציפיים למסלול, הניתנים לזיהוי בבדיקות נפרדות עבור סך Smad ו-β-actin.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת להרחבה לבידוד חלבונים במחקרי לב וכלי דם עובריים, ובכך מפחיתה פיתוח פרוטוקולים כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור מטרה על ידי מתן אפשרות לגילוי חלבונים זירחוניים בריכוז נמוך מרקמות שחולצו במיקרו-דיסקציה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה באמצעות נפחי ליזיס מוגדרים, הומוגניזציה מבוססת חרוזיים והכנה עקבית של דגימות ל-western blot.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהערכה מוקדמת של מטרות קרדיו-וסקולריות.
- השפעה על פורטפוליו: מסייע לתיעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים חצי-כמותיים של הפעלת מסלולים מאזורי מסתמים עובריים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-דיסקציה של מבני לב עובריים כדי לבודד את אזורי השסתומים ללא זיהום של מיוקרדיום ונטריקולרי.
- תלוי בציוד להומוגניזציה (lyser עם כדוריות פלדה אל-חלודה) וסנטריפוגציה ב-13,100 × g לצורך הבהרה של הדגימה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים של נפחי באפר ליזיס (נפח סופי של 40 µL) ושימוש במעכבי פרוטאז כדי להבטיח עקביות של הדגימות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על רקמות עובריות אחרות או שלבי התפתחות מעבר לאזורי השסתום האורטי ביום E13.5.
- כולל מגבלות מעשיות כגון חוסר יכולת לכמת חלבון כולל באמצעות ספקטרופוטומטריה עקב תפוקה נמוכה, מה שמחייב הסתמכות על אנליזת western blot חצי-כמותית.
