Name: בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: למדו לבודד חלבון משסתומי לב עובריים בעכברים לניתוח ביטוי חלבונים. הפרוטוקול כולל ניתוח מיקרוסקופי של הלב והכנת דגימות לווסטרן בלוט. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות הלב ביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאנדריאה פורטברי ודווין טאונלי-טילסון על הקריאה הביקורתית של כתב היד ול-NIH (מענק # R01HL061656) על התמיכה במימון.

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. .1 בלו מסתם אאורטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטכניקת המתת חסד אושרה לשלב העוברי של עניין, להרדים עכבר בהריון עם גורים ביום הרצוי העוברי (E) של פיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 70% אתנול לעקר הבטן של הנשים בהריון. הרם את העור ושרירים של הבטן התחתונה ומן האיברים הפנימיים, ולנתח חלל הבטן התחתונה של פתוחה הנקבה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאחזר את קרן הרחם, להחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים וזנב לחתוך בזהירות למלקחיים. הרם את קרן הרחם, חיתוך כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום, ולהשלים את ההסרה על ידי חיתוך הצומת של קרן הרחם עם oviduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרן הרחם גזור בcol צלחת פטרי המכילד 0.1 חיץ M טריס (pH 7.6) ולשטוף לפי צורך. לאחר מכן, חותך את קרן הרחם פתוח אורך חכם לחשוף את שקים העובריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשוף את העובר, לחתוך לפתוח שק עוברי בצומת של השליה והעוברת ולחתוך את כלי הטבור לשחרר את העובר. מניחים את העובר גזור בצלחת פטרי שנייה עם חיץ M טריס קר 0.1. להחזיר את צלחת פטרי הראשונה עם עוברי undissected נותרים לקרח עד מוכן לעובר הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את קיר גישת חזה בתוך העובר, לערוף את העובר. אם גנוטיפ יש צורך, להסיר ולשמור חתיכת רקמה נוספת בצינור Eppendorf הניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העובר על הגב שלה, וחתך את קיר החזה בצורה אנכית בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואופקית מעל הסרעפת לדמיין את הלב. לאחר מכן, לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להחזיק גבוה לאורך כלי הגדול, להרים את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי להלן.n, לחתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי להישאר נימול, הריאות ניתן להסיר עם הלב, ויש להסיר לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ולהסיר את עורק הריאה מעל לרמה של השסתום; בשלבים העובריים שתוארו במסמך זה, עורק הריאה הוא מעט אטום, אשר מסייע באפליה שלה מאזור שסתום. לחתוך ממש מתחת לשסתום ריאתי, הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated ולאסוף כפי שמתואר בשלב 1.10 אם אזור זה גם הוא עניין. כאן ובשלב הבא, להשתמש בפעולת נימים לצייר חיץ טריס עודף מהאזור של עניין לפני האיסוף במאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את דיסטלי אב העורקים לשסתום אב העורקים, ממש מעל הרמה של השסתום; כמו עורק הריאה, אב העורקים נשארים אטומים מעט בשלבים העובריים אלה, בסיוע בהסרתה. לחתוך ממש מתחת לשסתום אב העורקים, שוב הימנעות שריר הלב של חדר trabeculated, ולהעביר אתשסתום באמצעות מלקחיים לצינור Eppendorf עם חיץ תמוגה 2 μl (שמתואר בטבלת חומרים) המכיל מעכבי פרוטאז וphosphatase על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6-1.10 עד שסתומים כבר נכרת מכל העוברים, איסוף כל שסתום בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים גנוטיפ זהה, כל השסתומים עשויים להיות שנאספו בצינור Eppendorf יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גנוטיפ הוא שיש לבצע כדי לקבוע אילו שסתומי לחבור יחדיו, להציב מייד דגימות במאגר תמוגה ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. אז יכולות להיות ונקוו דגימות לאחר genotyping (צעד 2.1.1). </li></ol> הפקת .2 חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר רקמות שנאספו על קרח ו צנטריפוגות ב XG 13,100 עבור 1 דקות כדי לאסוף את הרקמות במאגר תמוגה בחלק התחתון של הצינור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עוברים עברו מיפוי, להשתמש פיפטה לאסוף בעדינות ובמאגר תמוגה בריכה המכיל את אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפים דומים. כדי להבטיח ב חזקו, איגום 3-4 אזורים שסתום מעוברי E13.5 לדגימה מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל העוברים היו של אותו גנוטיפ וכל אזורי שסתום נאספו יחד בשלב 1.10, lyse המדגם כולו, כפי שמתואר בשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את עוצמת הקול של המדגם נקווה כתוצאה ולהוסיף למאגר תמוגה להיקף כולל של 40 μl; לאחר מכן, לשבש וhomogenize דגימות באמצעות חרוזים נירוסטה 5 מ&quot;מ בצינורות אפנדורף. פועל lyser ל2-4 דק &#39;ב 50 הרץ, לפי הוראות היצרן. צינורות ספין בקצרה, (~ 13,100 XG 1 דקות), והעברת דגימות לצינורות חדשים, והותירו אחריו את הפסולת בלתי מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות נפרדות לSDS-PAGE והעברה לניתוח כתם מערבי שלאחר מכן, בעקבות פרוטוקול כגון אסלאמי et al 9. סופג לחלבון בקרת טעינה הוא חיוני לכימות חלבון. </li></ol>

<ol><li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li>
<li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li>
<li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells%3A+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li>
<li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-ordinating+Notch%2C+BMP%2C+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development%3A+the+pulmonary+push+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li>
<li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היכולת לכמת רמות חלבון בעכבר עוברי מוקדם וחומוס אזורי שסתום לב מספקת כלי נוסף להבנת אירועי איתות התאיות הקריטיים להתפתחות שסתום. הפרוטוקול שלנו שתואר במסמך זה אינו שונה בהרבה מהנהלים בידוד חלבון סטנדרטיים. עם זאת, על ידי שינוי כמה שלבים עיקריים, שהשגנו בהצלחה חלבוני phosphorylated מגודל מדגם קטן מאוד. כדי להשיג תוצאה זו, השלבים הבאים הם בעלת חשיבות מיוחדת. כדי להבטיח שחלבון באיכות מתקבל, זה הוא חיוני כדי לשמור על דגימות מקוררים, אם על קרח או על ידי שימוש במאגרים קר כקרח, בנוכחותו ...

יכולת לזהות ולכמת רמות ביטוי חלבון היא טכניקה סטנדרטית לבהמה וניסויים מבוססי תאים. עם זאת, למרות ארוך שנתי עניין בפיתוח שסתום לב עוברי מוקדם, הערכת ביטוי חלבון ברקמה הספציפית הזה במהלך ההתפתחות כיום מוגבלת לאימונוהיסטוכימיה בשני האפרוח ו1,2 עכבר. חלק מהקושי של כימות ביטוי חלבון בשסתומי הפיתוח של רוב האורגניזמים מודל (למשל, אפרוח ועכבר) הוא בגודל הקטן של השסתומים, אשר מגביל את כמות החלבון שניתן להשיג. לפיכך, לניתוחים כמותיים, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על מיצוי RNA והגברה לPCR כמו שלאחר מכן או ניתוח microarray 2-5. עם זאת, רמות ביטוי RNA והחלבון אינן מלא גומלות 6, כל כך מתמקדות בביטוי RNA אינו יכולות לספק חשבון קפדני של שינויים הרבים המתרחשים בכל איתות שניתנהמסלול בזמנים שונים במהלך התפתחות. בהתבסס על מגבלה זו במתודולוגיה זמינה כרגע, המטרה של הליך זה הייתה לפתח פרוטוקול למהימן קבלת כמות מספקת של חלבון מאזורי שסתום לב העכבר עוברי מתפתחים לניתוח כמותי של שינויים המתרחשים במסלולי איתות שונים שחשובים ב ההבשלה של רקמה זו. שסתומים עובריים כבר הם גזורים בדרך כלל מעכברים לבידוד RNA וניתוח ביטוי גנים לאחר 2-5. עם זאת, מחקרים אלו היו מוגבלים לשימוש בביטוי גנים כקריאה מתוך איתות הפעלת מסלול, שאינו מאפשר זיהוי של לאתר שינויי חלבון לאחר translational שעשוי להשפיע על איתות במורד הזרם. תוך שימוש בטכניקות בידוד RNA כנקודת התחלה, התחלנו עם לנתח האזורים של עניין. בגלל האינטרס שלנו היה גילוי חלבוני phosphorylated שהיו מעיד על טפיחת איתותפעילות hway במהלך תקופה מסוימת של התפתחות שסתום אב העורקים (E13.5-14.5), ביצענו את כל הניתוחים במאגר טריס נטול פוספט ואספתי את השסתומים במאגר תמוגה מבוססת טריס עם מעכבי phosphatase ופרוטאז. במקרה הספציפי שלנו, רק אזורי שסתום אב העורקים נאספו, אבל יכול בקלות להיות מושגת אזור שסתום ריאתי באותו הזמן. אזורי שסתום היו אז הומוגני ושילוב עם מאגר מדגם המשמש כיום ללמוד ביטוי חלבון בשסתומי לב מבוגר 7. על ידי שימוש בכמויות קטנות מדגם (למשל, 2 μl) ואיגום אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפ זהה, שהיינו מסוגל לזהות חלבונים עוברים פוספורילציה וnonphosphorylated ביום עוברי 13.5 8. מאחר שניתן להקפיא את אזורי שסתום ומאוחסנים במאגר תמוגה, ניתן genotyped עוברים במידת צורך לפני איגום. טכניקה זו מרחיבה את הסט של כלים הזמינים להערכת סיגנליזטורי תאמסלולים גרם במהלך פיתוח ומספק מחמאה כמותי לאימונוהיסטוכימיה, במיוחד עבור שסתומי לב מתפתחים. טכניקה זו צריכה להיות בעל ערך לא רק לקרדיולוגים התפתחותיים, אלא גם לכל הביולוגים התפתחותיים שעובדים עם עוברים בראשית התפתחות מעוניינים באזורים המכילים רקמה מוגבלת.

<table><tbody><tr>עכבר <td></td><td></td><td>בהריון מתוזמן</td><td>לניתוח בשלב העניין העוברי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M Tris, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים, #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>מחט ניתוח המחזיקים</td><td>טד פלה בע"מ</td><td>13560</td><td></td></tr><tr><td>מחטי ניתוח</td><td>טד פלה בע"מ</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטה, 20 &mu; l, עם טיפים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> ליזה <td>50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 1% Triton</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>הוסף טבליה אחת ל-10 מ"ל מאגר ליזה</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

ניתוח כתמים מערביים הוא טכניקה נפוצה לאיתור וכימות רמות חלבון. עם זאת, עבור דגימות רקמה קטנות, ייתכן ששיטת ניתוח זו לא תהיה רגישה מספיק כדי לזהות חלבון מעניין. כדי להתגבר על קשיים אלה, בדקנו פרוטוקולים להשגת חלבון ממסתמי לב אנושיים בוגרים ושינינו פרוטוקולים אלה עבור עמיתיהם העובריים המתפתחים. בקצרה, אזורי המסתם האאורטלי העוברי של העכבר, כולל המסתם האאורטלי ודופן אבי העורקים שמסביב, נאספים בנפח המינימלי האפשרי של מאגר ליזה מבוסס טריס עם מעכבי פרוטאז. במידת הצורך על סמך אסטרטגיית הרבייה, העוברים עוברים גנוטיפ לפני איגום ארבעה אזורי מסתם אבי העורקים העוברי להומוגניזציה. לאחר הומוגניזציה, נעשה שימוש במאגר דגימה מבוסס SDS כדי לפרק את הדגימה להפעלה על ג'ל SDS-PAGE וניתוח כתמים מערביים לאחר מכן. למרות שריכוז החלבון נותר נמוך מכדי לכמת באמצעות מבחני כימות חלבון ספקטרופוטומטריים ונותרה דגימה לניתוחים הבאים, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות בהצלחה ולכמת למחצה חלבונים זרחניים באמצעות כתם מערבי מדגימות מאוגדות של ארבעה אזורי שסתום אבי העורקים של העכבר ביום 13.5 עוברי, שכל אחד מהם מניב כ-1 מיקרוגרם חלבון. טכניקה זו תועיל לחקר הפעלת מסלול איתות התאים ורמות ביטוי החלבון במהלך התפתחות מוקדמת של מסתם עכבר עוברי.

שימוש בטכניקת הכנה זו, שהיינו מסוגל לזהות סמאד 1,5,8 פוספורילציה (pSmad) באזורי שסתום אב העורקים אחת מE13.5 עוברים. כפי שניתן לראות באיור 1 א, החלבון מבודד מאף אזור שסתום חד מספיק כדי לזהות להקת pSmad קלושה. עוצמת אות מגדילה באופן יחסי למספר אזורי שסתום שייאגרו. חשוב לציין, pSmad / היחס β-אקטין נשאר כמעט קבוע על פני הגדלים השונים מדגם (איור 1 ג). בשל הרמות נמוכות של חלבון זמין, באותו הכתם לא יכול להיות חשוף וreprobed לסמאד סך הכל. עם זא...

ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולהפיק חלבון ממסתמי לב עובריים. זה מושג על ידי בידוד עובר מעכבר בהריון. בשלב השני מנתחים את הלב מהעובר, ואז אוספים את מסתמי הלב בשלב האחרון.הרקמה עוברת ליזה ודגימת החלבון המתקבלת מוכנה לניתוח שלאחר מכן. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח BLO מערבי כדי להעריך את רמות ביטוי החלבון. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הדיסקציה בגלל הצורה הקומפקטית הקטנה של הלב המתפתח.ביום ההתפתחות העוברי הרצוי, השתמש באתנול 70% כדי לעקר את הבטן של הנקבה ההרה. לאחר מכן הרם את העור והשריר של הבטן התחתונה למעלה והרחק מהאיברים הפנימיים, ונתח את חלל הבטן התחתונה כדי לאפשר גישה לקרן הרחם. לאחר מכן, החזיקו את צוואר הרחם בעזרת מלקחיים וחתכו בזהירות את הקפיצה לקצות.לאחר מכן הרם את קרן הרחם תוך חיתוך כל רקמת חיבור השומרת על הקרן במקומה, והשלם את ההסרה על ידי חיתוך צומת קרן הרחם עם ה-uct. מניחים את קרן הרחם המנותחת בצלחת פטרי המכילה בופר טריס קר של 0.1 מולארי ושוטפים לפי הצורך. ואז חותכים את קרן הרחם.פתח לאורכו כדי לחשוף את השקים העובריים. כדי לחשוף עובר, חתכו שק עוברי בצומת השליה והעובר, וחתכו את כלי הטבור כדי לשחרר את העובר. מניחים את העובר המנותח בצלחת פטרי שנייה עם חיץ טריס מולארי קר של 0.1 מולארי, ומחזירים את צלחת הפטרי הראשונה עם העוברים הנותרים שנותחו לקרח עד לדיסקציה העוברית הבאה.לאחר עריפת הראש, הניחו את העובר על גבו וחתכו את דופן החזה אנכית לאורך הצד של כלוב הצלעות ליד צליעה ואופקית מעל הסרעפת. כדי לדמיין את הלב, פתח את דופן החזה. לאחר מכן החזיקו את המלקחיים גבוה לאורך הכלים הגדולים, הרימו את הלב וחתכו את הכלים שמתחת.לאחר מכן, חתוך מעל המלקחיים כדי לשחרר את הלב. אם כלי הריאה נשארים לא חתוכים, הסר את הריאות עם הלב לפני שתמשיך בשלבים העובריים המתוארים כאן, עורק הריאה אטום מעט. לאחר זיהוי העורק יש לחתוך ולהסיר אותו מעל מפלס השסתום.כעת, חתכו ממש מתחת למסתם הריאתי, הימנעו משריר הלב החדרי ECD, והסירו את מאגר התריס העודף הרחק מאזור העניין. לפני הנחת המסתם בצינור איינור המכיל שני מיקרוליטרים של מאגר ליזה כמו עורק הריאה, אבי העורקים ייראה מעט אטום. לאחר זיהויו, יש לחתוך ממש מתחת למסתם אבי העורקים.שוב, הימנעות משריר הלב החדרי הטרבקולטיבי. הסר כל תמיסת טרי עודפת, ולאחר מכן העבר את השסתום לצינור ה-einor המכיל ליזה, חיץ ורקמת עורק ריאה. לאחר איסוף כל הרקמה, הניחו מיד את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להמשך הדרך.השתמשו למיצוי החלבון, הפשירו את הרקמות שנאספו על קרח, ולאחר מכן גלולו את הדגימות למשך דקה אחת ב-13, 100 גרם בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את נפח הדגימה המתקבלת והשתמש במאגר ליזה כדי להביא את הנפח הכולל עד 40 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף חרוזי נירוסטה של חמישה מילימטר כדי לשבש ולהומוגניזציה של הדגימות בליר למשך שתיים עד ארבע דקות ב-50 הרץ, לפי הוראות היצרן.לאחר ההומוגניזציה, סובבו צינורות לזמן קצר והעבירו את הדגימות לצינורות חדשים, והשאירו מאחור את הפסולת הבלתי מסיסה לניתוח ניסיוני נוסף. באמצעות טכניקת הכנה זו, ניתן לזהות smad זרחני 1 5 8 באזורי מסתם אבי העורקים בודד מעוברי E 13.5. לדוגמה, החלבון המבודד אפילו מאזור שסתום בודד מספיק כדי לזהות פס p smad חלש כאשר עוצמת האות גדלה באופן פרופורציונלי למספר אזורי השסתומים המאוגדים.חשוב לציין, יחס ה-p smad beta actin נשאר קבוע בבירור על פני גדלי הדגימה השונים בשל הרמות הנמוכות של חלבון זמין, לא ניתן להפשיט את אותו כתם ולבדוק מחדש עבור smad כולל. עם זאת, כתם נפרד המציג סה"כ סמאד-וואן ובטא אקטין מציג את אותו דפוס ביטוי. אזורי מסתמים אלה נטולי כמעט לחלוטין זיהום שריר הלב החדר באמצעות טכניקת הכנה זו בשילוב עם דגימות מהחדר הימני, סמן שריר הלב החדר, NP אינו ניתן לזיהוי באזורי מסתם אבי העורקים, בעוד שסמן זה מזוהה בקלות בחדר.יתר על כן, סמן שריר הלב החדר מיוזין שרשרת קלה 2 V ניתן לזיהוי בקלות גם בדגימת החדר, אך בקושי ניתן לזהות אותו באזורי המסתם האאורטלי המדגישים את דיוק הדיסקציה לאחר דיסקציה זו. ניתן לבצע MEs אחרים כמו QPCR או RN AIC על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים במורד הזרם מושפעים במהלך שלבי ההתפתחות השונים.

protein-isolation-from-developing-embryonic-mouse-heart-valve

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף...

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאים אינטרסטיציאליים של מסתם אבי העורקים מליבו של עכבר בוגר באמצעות הליך קולגנאז דו-שלבי והתרבית הבאה שלהם בנפח נמוך של מצעי גדילה.

בידוד תאי אינטרסטיציאל של שסתום עכבר: שיטה אנזימטית לבידוד ותרבית VICs ממסתם אבי העורקים של העכבר

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים.  כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

במודלים של בעלי מבחנה של אנגיוגנזה כלילית ניתן לעשות שימוש לגילוי המנגנון הסלולר והמולקולרי של אנגיוגנזה כלילית. באופן מתורבת תרבויות של הסינוס venosus ורקמות אנדוקרדיום להראות צמיחה חזקה בתגובה ל-ולהציג דפוס דומה של הביטוי הפיכה-TFII כמו ב vivo.

מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

למדו לבודד חלבון משסתומי לב עובריים בעכברים לניתוח ביטוי חלבונים. הפרוטוקול כולל ניתוח מיקרוסקופי של הלב והכנת דגימות לווסטרן בלוט. שיטה זו מאפשרת חקר התפתחות הלב ביולוגיה התפתחותית.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

גלה סרטונים נוספים