Name: שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: למד שיטת מיקרו-הזרקה לזיגוטות של כוכב ים Patiria miniata לחקר ביולוגיה התפתחותית. הפרוטוקול כולל איסוף גמטות, הפריה והזרקת חומרים מפריעים כמו GFP לניתוח תפקוד גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע IOS 0844948 וIOS 1024811

<ol><li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens%2C+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell+Auspices+Eur.+Cell+Biol.+Organ%22%5BJournal%5D)">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li>
<li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li>
<li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li>
<li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns+GEP%22%5BJournal%5D)">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li>
<li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li>
<li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17(2012).</li>
<li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68(2013).</li>
<li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li>
<li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li>
<li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li>
<li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Int.+J.+Org.+Evol%22%5BJournal%5D)">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li>
<li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLambert%2C+P+%22Sea+Stars+of+British+Columbia%2C+Southeast+Alaska%2C+and+Puget+Sound%22">Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound</a>. , UBC Press. (2000).</li>
<li>Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+meiosis%3A+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li>
<li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+evolutionary+act%3A+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li>
<li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li>
<li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li>
<li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomere+isolation+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li>
<li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li>
<li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים שהוכרזו על ידי המחברים.

ישנם שני שלבים קריטיים שקשה עבור משתמשים מתחילים בטכניקה זו, אך הם חיוניים ליצירת הצלחת עוברי morphant. הוא הבחירה הראשונה ביציות בריאים שתבשלנה ולדשן כראוי. אחוז של התפתחות נורמלית בתרבות תלויה בעונה, על בריאותם של בעלי החיים, ואת מספר פעמים שביציות כבר נקצרו מאדם אחד. ביציות נוטות להיות באיכות טובה יותר מאפריל עד אוקטובר. חשוב לבחון בזהירות את הביציות לפני שתמשיך כדי לוודא שהרוב נראה כמו איור 2 א ולא איור 2. מותר לי מספר קטן של ביציות שאינם בשלו...

כוכב הים, Patiria miniata, (הידוע בכינויו כוכב העטלף) מסתמן כמערכת מודל מעניינת ותכליתית עבור מגוון רחב של 1 סלולארי 3, התפתחותיות 4,5, אבולוציוני 6 8, ומחקרים אקולוגיים 9- 11. פ למבוגרים miniata מופצים לאורך חוף האוקיינוס ​​השקט מסיטקה, אלסקה לאחה, 12 קליפורניה ונשמר בקלות באקווריום ימי. ביציות הן ימות השנה ברת השגה וכל נקבה יכולה לשפוך עשרות אלפי ביצים. ביציות הבשילו בקלות ומופרה חיצוני 13. העוברים וכתוצאה מכך הם שקופים ומאפשרים להתבוננות קלה; הם מפתחים באופן סינכרוני, ודורשים מים ים רק לפיתוח. הרכבה הגנום כולו וtranscriptomes מרובה זמינות גם עבור P. miniata <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">(Echinobase.org).</a> יתרונות כגון להפוך אותם אידיאליים עבור מגוון רחב של מחקרומטרות הוראה. בשנים האחרונות, פ &#39; miniata הפך מערכת מודל לרשת רגולציה גן התפתחותי מנתחת 14- 16. מטרת מחקרים מסוג זה היא לזהות את כל המחמאה של גני רגולטורים ולקבוע את הרשת של יחסי הגומלין שלהם. חלק ניכר מהעבודה כרוכה בביטוי גנים מדאיג דרך כניסתה של oligonucleotides antisense או בmRNAs מבחנה מסונתזת. בנוסף, ניתוחי רגולציה cis משמשים כדי לאפיין את הפונקציה של DNA הרגולציה 15. ניתוחים אלה דורשים הקדמה של חומרים כימיים ההפרעות ו / או כתב הבונה DNA לעוברי. יתר על כן, כדי לאפיין את ההשפעות במורד הזרם של הפרעות אלה, יש assay עוברים רבים לשינויים בביטוי הגנים של מטרות פוטנציאליות. טכניקות לmicroinjection של מאות רבות של zygotes הן מרכזיות לעבודה זו. Echinoderms, כולל P. miniata </em&gt;, דורש חודשים רבים כדי להגיע לבגרות מינית. בגלל זה, זה בדרך כלל לא מעשי לפתח ולשמר קווים מהונדסים של בעלי חיים אלה לניסויים. לכן, גידול של מבוגרים מהונדסים לא יכול ביעילות ליצור הותאם עוברים. במקום זאת, צריכה להתרחש ההפרעות דה נובו באמצעות microinjection. Microinjection מציע הזדמנות לשנות עוברים עם ריאגנטים שאינם תא חדיר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה להציג את DNA, mRNA, קליעים נותבים תא, וoligonucleotides antisense morpholino למאות ביצים מופרות בשעה אחת 2-3 יושבת דרך microinjection. זה מייצר חומר מספיק עבור מגוון רחב של ניסויים במורד הזרם כולל, אך לא מוגבל ל, qPCR, הכלאה באתר, RNA-Seq, ומערבי סופג.

<table><tbody><tr><td>1-מתילאדנין</td><td>אקרוס אורגניקס (פישר סיינטיפיק)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 מיקרון ניטקס ניילון</td><td>פילטר חלקים קטנים (במקור ספר)</td> <td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 מיקרון ניטקס ניילון</td><td>חלקים קטנים (במקור ספר)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי פוליסטירן, 60 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימיים</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>למשיכת מחטי מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>דגם P-97 מושך מחט</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamine Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>אם מזריקים מדווח ביטוי GFP, כדאי להחליף את טקסס אדום דקסטרן כעוקב הזרקה</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>זמין גם בחנויות חיות מחמד רבות</td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה לmicroinjection של minata patiria zygotes

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms כבר זמן רב מערכת מודל מועדף למחקרים של רבייה והתפתחות, ולאחרונה לחקר ויסות הגנים והאבולוציה של תהליכים התפתחותיים. כוכב הים, Patiria miniata, הוא צובר שכיחות כמערכת מודל למחקרים מסוג שבוצעו באופן כמעט בלעדי בעבר בקיפודי הים, purpuratus Strongylocentrotus וvariegatus Lytechinus. יתרון של מערכות מודל אלה הוא הקלות של יצירת עוברים שונה שבגן מסוים הוא למעלה או downregulated, תיוג קבוצה של תאים, או החדרת גן כתב. שיטת microinjection בודדת מסוגלת לייצר מגוון רחב של עוברים שונה כגון. כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תאי רבייה מפ miniata, הפקת zygotes, והחדרת חומרים כימיים מדאיגים באמצעות microinjection. עוברי morphant בריאים מבודדים לאחר מכן למחקרים כמותיים ואיכותיים של geפונקצית ne. הזמינות של נתוני הגנום וtranscriptome לאורגניזם זה הגדילה את סוגי מחקרים שמבוצעים ואת הקלות של ביצועם.

המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את חומרים כימיים לעוברי. אנו מדגימים את היעילות של הפרוטוקול על ידי הזרקה לבנות כתב DNA שמניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עובר מוזרק להביע GFP בתיקונים משובטים (איור 4A-B) כDNA משלב במהלך המחשוף מוקדם. ריאגנטים רבים הנמצאים רצויים להציג לעוברי הם רעילים בכמויות גבוהות וקבוצות לא טובות של עוברים. מניפסטים רעילות על ידי עיכוב התפתחות, שעצר את הפיתוח במחשוף מוקדם או בשלב הביצית המופרה, או על ידי הטלת פיתוח חריג (א...

שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשנות עוברי פיטר מיאטה עם ריאגנטים מפריעים על ידי החדרתם באמצעות מיקרו-הזרקה. זה מושג על ידי איסוף והבשלה ראשונים של גמטות מבעלי חיים בוגרים. השלב השני של ההליך הוא הפריית הביציות הבוגרות.השלב השלישי הוא להסיר את הזיגוטות ולהניח אותן בשורות על צלחת הזרקה. השלב האחרון הוא להזריק לזיגוטות את הריאגנטים המפריעים הרצויים שהוכנסו בסופו של דבר ריאגנטים זרים כגון GFP Reporter ניתן לראות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית של העוברים המוזרקים. הדגמה ויזואלית של טכניקה זו חשובה מאוד מכיוון שקשה ללמוד כיצד להזריק מיקרו, ובמיוחד כיצד לכוון את המחט במרחב תלת מימדי, וכיצד להכניס את גודל הבולוס הנכון לביצה.אז מי שתדגים את הטכניקה הזו היום תהיה סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי, אליס טלה. התחל עם אוסף של בעלי חיים. סקס מתבצע על ידי כריתת גמטות.כמו פי מיאטה, כוכבי ים אינם דו-צורתיים מבחינה מינית. כדי להסיר את בלוטות המין השתמש בלהב כדי לחתוך פתח קטן, לא יותר מסנטימטר אחד גדול לאורך צד הזרוע. ניתן להשתמש במלקחיים קהים כדי למשוך קצוות לאחור.הימנע מהסרת רקמת המעי החומה, האפורה והרופפת. השחלות כתומות עד בהירות. חום. אוספים אותם בכלי זכוכית קטן עם כמה מיליליטר מים.התגרות ברקמה הרכה הזו תשחרר את הציטים שבתוכה. בדוק את איכות הציטים כדי לקבוע אם הם יבשילו כראוי. לאחר מכן סנן את הביציות כדי להסיר רקמת שחלה וביציות קטנות לא בשלות, הוסף חמישה מיליליטר של 200 מיקרומולר, מתיל אחד ל-100 מיליליטר ביציות במי ים, ואפשר לביציות להתבגר בתמיסה במשך 45 עד 90 דקות ב-15 מעלות צלזיוס.איכות חומצה סליצילית היא קריטית לקביעה אם תרבית תתבגר, תפרה ותתפתח כראוי. השתמש רק בקבוצות ביצים שרובן גדולות, חומות, שקופות וצהובות, או חומות בהירות וצבעוניות. השליכו קבוצות של עוברים שרובם קטנים.אשכים חומים או ירקרקים הם לבנים או בז', ויעכירו את המים כאשר הם מופרעים. אוספים את האשכים בצינור של 1.5 מיליליטר עם כמה שפחות מי ים ומאחסנים אותם על קרח. התחל בטחינת אשכול בגודל אפונה של רקמת אשך במיליליטר מי ים.העבירו שתיים או שלוש טיפות ממי הים החלביים שנוצרו ל -100 מיליליטר ביציות בוגרות בצלחת תרבות. יחס זה אמור למנוע זרע פולי. אל תעביר אף אחד מחלקי הרקמה.סובב את התערובת ל-GAMT. לאחר מספר דקות, בדוק את ה-GAMTs תחת מיקרוסקופ דיסקציה ביציות מופרות. יש מעטפת הפריה, שנראית כמו בועה שקופה סביב הביצה.לאחר אישור ההפריה, החליפו את המים על ידי איסוף הזיגוטות בכוס סינון של 100 מיקרון, ולאחר מכן שטיפתם מהפילטר לכלי נקי עם מי ים מתוקים. כעת העבירו את הזיגוטות ל -15 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות. בהכנה, החמצת מי הים ל-pH של כארבע על ידי הוספת חומצה הידרוכלורית רגילה אחת בטיפה.עקוב אחר ה-pH וערבב לחלוטין כל טיפה לפני ההוספה. הבא. כמו כן נדרשת פיפטה עם הפתח.רק קצת יותר גדול מקוטר של זיגוטה אחת עם שקע בזווית של 45 מעלות. כעת המשיכו עם דה ג'לי של הזיגוטות, כך שהם יידבקו יפה לצלחת הפלסטיק. קוד הג'לי נרחב יותר מזה של קיפוד ים, אך ניתן להסירו באמצעות מי ים חומציים.ראשית, סננו את הזיגוטות מהמים שלהן בעזרת רשת של 100 מיקרון. לאחר מכן העבירו אותם לכוס של 200 מיליליטר עם מינימום מי ים. לאחר מכן הוסיפו לכוס 150 מיליליטר ממי הים המחומצים, ותנו להם לשבת שלוש דקות.בדקה הרביעית והחמישית, הפשיטו את ציפוי הג'לי על ידי שפיכת הזיגוטות דרך רשת של 200 מיקרון עם מי הים המחומצים. עשו זאת חמש עד 10 פעמים. לאחר שחלפו חמש דקות.אסוף את זיגוטות השטר על רשת של 100 מיקרון. לאחר מכן שוטפים אותם לכלי זכוכית קטן עם מי ים רגילים. לאחר הכניסה למנה, רכבו מיד על הזיגוטות לפני שהם מייצרים עוד ג'לי.השתמש בשאיפה מפיפטה בפה כדי לטפל בזיגוטות. העבירו אותם מכלי הזכוכית לצלחת הזרקת פלסטיק מוכנה. הזיגוטות צפות מעט.מקם את הפיפטות כך שהזיגוטות נלחצות בעדינות על פני השטח בזמן שהן נפלטות. קצה זוויתי עוזר בתהליך זה. אם הזיגוטות לא נדבקות לכלי הפלסטיק, העבירו אותן בחזרה למי ים חומציים למשך מספר דקות ונסו שוב.זיגוטות לא תקועות לא יהיו ניתנות להזרקה בכמה זיגוטות הרצויות. החדירות שלהם אינה משתנה עם הזמן. הכן את כל פתרונות ההזרקה לא משנה שההרכב יהיה 200 מילימולר אשלגן כלורי.מורפו אוליגונוקלאוטיד צריך להיות ב-400 עד 800 מיקרו-מולאר ו-DNA בכ-2.5 ננוגרם לתמיסת הזרקת הטי מיקרוליטר עם אוליגונוקלאוטידים של מורף אנו ל-65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ממש לפני השימוש בהם, להוסיף 0.1% רוד דומין DExT עוקב גדיל לתמיסת ההזרקה להדמיה מאוחרת יותר. ניתן לשלוף מחט הזרקה מנימי זכוכית בקוטר פנימי של מילימטר אחד בקוטר חיצוני של שלושת רבעי מילימטר טעונים במיקרוליטר אחד עד שניים של תמיסת הזרקה באמצעות פיפטה מיקרו מעמיס. ואז חבר אותו למניפולטור.שלוט בפליטה עם פיקו שפריצר המוגדר לפולסים של 100 אלפיות השנייה ב-40 פאונד לאינץ' מרובע. השתמש בדוושת רגל כדי להפעיל את זווית הפליטה של הפיפטה בכ-60 מעלות לפני השטח של הכלי. שברו את הקצה על ידי העברתו בעדינות לתוך הפלסטיק הבולט בקו מנוקד על הצלחת.לאחר מכן יישרו אותו לביצה. המחט צריכה לחדור בקלות לזיגוטה. הוצא את הבולוס על סמך הזריקה הראשונה.התאם את משך הפליטה כדי לספק בולוס כך שיהיה כ-20 עד 30% מקוטר הזיגוטות הממוצע. המשך להתאים את משך הזמן עד לקבלת הבולוס הרצוי. לאחר מכן השאר את התזמון מוגדר.אם המחט נסתמת, שברו את המחט שוב. לאחר מכן חזור לדופק של 100 אלפיות השנייה והתאם מחדש את הבולוס. אם יש צורך במשך הזרקה גדול מ-200 אלפיות השנייה כדי לקבל את הבולוס המתאים, שברו את המחט שוב.ואם משך ההזרקה צריך להיות 20 אלפיות שנייה או פחות, החלף את המחט. אם זיגוטה נתקעת על המחט, הסר את המחט מהמים כדי להסיר אותה. נסה להשלים את הזריקות לפני המחשוף הראשון.אחרת, רק חלק מהעובר יושפע מהריאגנטים המפריעים. ברגע שהמחשוף מתחיל, ניתן להזריק חילול קודש בודד, מה שעשוי להיות אידיאלי עבור קווי ניסוי מסוימים בטכניקה המתוארת. מבנה מדווח DNA המבטא GFP הוזרק לכוכבי ים עובריים.העוברים שהוזרקו הראו טלאים משובטים של ביטוי קונסטרוקטיבי שכן מגיב סיכום צפוי היה רעיל לעוברים בהזרקת יתר. כאן, עובר שהוזרק יתר נעצר בשלב התא האחד. בפעמים אחרות החומר המוזרק הביא לחלוקה לא תקינה כמו חלוקה מוקדמת א-סימטרית.רעילות יכולה להתבטא גם בהתפתחות חריגה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה ממש טובה כיצד לתרבית ולהזריק מיקרו זיגוטות חיצוניות מיני. תיצור עוברים כדי לבצע מגוון ניסויים במורד הזרם.

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

טכניקות מיקרו-ג'ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג'יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

בסרטון הזה, Nijole Jasinskiene ממחישה את המתודולוגיה מועסק כדי ליצור מהונדס Aedes aegypti היתושים, אשר הם וקטורים עבור קדחת דנגה. טכניקות נכונה עבור הכנת מחטים microinjection, dessicating עוברים, וביצוע microinjection הם הפגינו.

Microinjection עוברים א aegypti לקבל יתושים טראנסגנטי

למד שיטת מיקרו-הזרקה לזיגוטות של כוכב ים Patiria miniata לחקר ביולוגיה התפתחותית. הפרוטוקול כולל איסוף גמטות, הפריה והזרקת חומרים מפריעים כמו GFP לניתוח תפקוד גנים.

שיטה לMicroinjection של Minata Patiria Zygotes

גלה סרטונים נוספים