Name: Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: למד לפתח שיטת סקר פנוטיפית לזיהוי מולקולות קטנות המעכבות את פעילות טוקסין הבוטולינום בנוירוני מוטור של עכברים. השיטה משתמשת בדימוי תוכן גבוה לזיהוי מעכבי SNAP 25.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון ניתן על ידי המשרד המשותף למדע וטכנולוגיה - הסוכנות להפחתת איומי הגנה כימית ביולוגית (JSTO-CBD) תחת פרויקט נותן חסות מספר CCAR# CB3675 והמכונים הלאומיים לבריאות (1 R21 AI101387-01 ו-5 U01AI082051-05).

תאי הגזע העובריים של עכבר צלחת 20,000 הבדיל (MES) / גם ב96 צלחות ליזין מצופה פולי-D היטב ולשמור בתקשורת בידול מסוף הנוירון מוטורי 5-7 ימים. מנהל 1. מתחם ושיכרון בונט / לבצע את כל העבודה הבאה במתחם BSL2 על מנת לעמוד בהנחיות ה- CDC / NIH. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 פתרונות מניות מ&quot;מ של כל מתחם ספרייה ב100% DMSO בפוליפרופילן 96 צלחות גם. השתמש במניית 10 מ&quot;מ להכין צלחת דילול ביניים שהיא פי 10 גדולים יותר מריכוז ההקרנה הרצויה. הכן 100 צלחת ביניים אום על ידי מחלק 10 מניות מ&quot;מ לתוך צלחת 96-היטב ולדלל אותו ל -100 UM באמצעות תקשורת ותרבות. להפריש 10 μl של התרכובות על 90 μl של תקשורת על התאים 11. תבדוק את התרכובות בשעה 10 בריכוז סופי אום ולהבטיח את האחוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל ההרבעהies שעושה שימוש בתאים חיים ורעלן פעיל ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. החלף את המדיה הישנה ב96-גם צלחות עם 80 μl של תקשורת בידול מסוף הטרי באמצעות פיפטה במדריך 12 ערוץ. לבצע שאיפה ולוותר צעדים על ידי שורות כדי למנוע חשיפה של התאים ללא תקשורת לאוויר הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pretreat תאים עם תרכובות שלפני היישום של רעלן על ידי תוספת של 10 μl של 10x תרכובות מצלחת המקור באמצעות פיפטה 12 ערוץ, ואחריו ערבוב על ידי שאיפה (פעמיים). לכל צלחת 96-היטב, לטפל בשני טורים של 6 בארות עם 10x DMSO המדולל בתקשורת כדי לשרת גבוהה כאות ובקרת אות נמוכה. הטור ללא טיפול בונט מציג את הרמה הגבוהה ביותר של האורך המלא SNAP-25 (שליטת אות גבוהה). פנק את הטור השני עם bont לבד (ללא כל תרכובות) כשליטת אות הנמוכה. השתמש שליטה נמוכה כדי לבחון את היעילות של המחשוף בונט של SNAP-25 וזיהוי שלה עם נוגדן BACS (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם תרכובות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO 2 בתרבית תאי החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עצבי טוקסין מ1 מ&quot;ג / מיליליטר במקור מסחרי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) למניות 10x סופיות עובדות על ידי דילול עם תקשורת בידול מסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום שיכרון על ידי הוספת 10 μl של 10x בונט / המניה לתוך בארות המיועדות לבקרת טיפול ואות נמוכה בעזרת פיפטה רבה (איור 2). פנק את הבארות יועדו כגבוהה שליטה עם תקשורת לבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל כלי הפלסטיק חד-פעמים ואחרות שבאים במגע עם בונט / במהלך המחקר על ידי טבילה בתמיסת היפוכלוריט 0.825% במים לפחות 20 דקות. לבצע את כל ההליכים בארונות בטיחות ביולוגיים ולטהר אזורי עבודה לפני ואחרי ניסויים עם 5% חומר ניקוי חיטוי חומרי ניקוי כגון פתרון MicroChem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הצלחות ברורה כדי לציין את הרעל וincubצלחות אכלו טופלו בnM 1 / L בונט / 4 שעה על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO 2 באינקובטור תרבית תאים. להציג שילוט מתאים כדי ליידע עמיתים שהרעל נמצא בשימוש במעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחנה בונט / מחשוף פרוטאוליטים על ידי קיבעון מתנול. הסר מדיה המכילה רעלן ותרכובות מכל טוב עם פיפטה רבה וזורקים בפתרון אקונומיקה 10%. להוסיף מתנול הקרח הקר (100 μl) ישירות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT) על מנת לאפשר קיבוע להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, להתמודד בבטחה עם ריאגנטים המושלכים (נחשב מנוטרל) עם פרוטוקולי 1 רמת בטיחות ביולוגית וזורקים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל מתנול ולהשתמש של PBS 100 μl לשטוף את התאים ורעננותם לפני immunostaining. בצע שני שוטף PBS נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה של הדבר, לעזוב את PBS בבארות, צלחות חותם עם סרט דבק microplate ולאחסן ב 4 ° C עד לניתוח. צלחות חנות ב 4 ° C FOr כמה ימים. </li></ol> 2. Immunostaining הליך immunostaining הוא, פעולה רב שלבי עבודה אינטנסיבית הכוללת מחזורים חוזרים ונשנים מגיב לוותר / לשאוב ושטיפת צלחת נרחבת שעלולות להוביל להקדמה האפשרית של השתנות intraplate וinterplate משמעותיות. גישה חצי אוטומטי מוחלת לחסוך את הזמן של אנשי מעבדה, להגדיל את תפוקת assay, ולמזער immunostaining שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתחנת עבודה אוטומטית מצויד בראש 96-היטב מסוגל להעביר נפחים של עד 250 μl ומשולב עם זרוע רובוטית תפסן לעבור מעבדתי למקומות שונים על הסיפון המודולרי (ראה חומרים וציוד) לפרוטוקול זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסיפון מודולרית נועד לארח סוגים שונים של מעבדתי ויכול לתמוך בעד 11 פריטים בכל זמן נתון. מטפל microplate האוטומטית מצויד במערה microplate מגזין כפול כדי להחזיק ולתפעל עד 50 צלחות בכל מחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת העבודה האוטומטית ממוקמת בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II המיועד לציוד אוטומציה מעבדה כדי לספק לעקרות ובטיחות. עבור immunostaining האוטומטי, הסיפון מסודר כפי שמוצג באיור 3 כדי לאפשר גישה מגיב בהתאם לצורך וללא התערבות אדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות טרום עומס המכילות תאים קבועים למגזין הצלחת ומעביר לסיפון כנדרש לפעילות טיפול נוזלי. השתמש מצויד עם 250 טיפים μl ראש 96 פיפטה כדי לשאוב PBS מהבארות עד 10 μl. Permeabilize קרומים תאיים כדי להקל על נוגדן מחייב למטרות תאיות עם חיץ permeabilization (0.1% Triton-X 100). לוותר חיץ permeabilization (100 μl) לתוך זה גם לפני החזרת הצלחות למגזין האחסון השני של מערה microplate לדגירת 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ permeabilization וPEשטיפת צלחת rform עם PBS (פעמיים) כפי שתוארה לעיל בשלב 1.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב לשטוף האחרון, להסיר את PBS חיץ ולוותר של חיץ חסימה המכיל 1% בסרום סוס ו -0.1% Tween 20 בPBS 100 μl לכל microplates לפני החזרתן למגזין הצלחת 1 שעתי דגירה על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני נוגדנים ראשוניים לimmunostaining: נוגדן BACS אנטי עכבר הארנב polyclonal, לגילוי אורך מלא אנטי-III נוגדן טובולין SNAP-25 וחד שבטי עכבר לצורך זיהוי של תאי עצב (ראה חומרים וציוד). לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר את חיץ החסימה ולוותר 50 μl של 4ug / מיליליטר של נוגדן BACS ו0.5 מיקרוגרם / מיליליטר של III-טובולין בחסימת מאגר לכל הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 שעות ב RT להסיר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 3 פעמים עם PBS של 100 μl מכיל 0.05% Tween (PBST). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש IgG אנטי עכבר שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 647 לדמיין IgG -III טובולין ונגד הארנב מתויג עם אלקסה Fluor 568 לדמיין את נוגדן BACS. הכן שני הנוגדנים כדילול / מיליליטר 2 מיקרוגרם בחסימת מאגר ולוותר 50 μl של התערובת לתוך כל טוב. הערה: הנוגדנים משני שנבחרו לimmunostaining מסומנות עם fluorophores שונה ומאפשרת גילוי של אור הניאון נפלט באורכי גל שונים באמצעות ערוצים שונים בתוך הגלאי של Imager התוכן הגבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1 ב RT. לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם PBST של 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה של הדבר, להוסיף צבע של PBS המכיל Hoechst (32 מיקרומטר) 100 μl להכתים את ה- DNA לזיהוי גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הצלחות עם סרט בלתי חדיר אור כדי להגן על fluorophores מphotobleaching. ניתן לאחסן צלחות ב 4 &#160; ° C במשך שבועות ללא אובדן משמעותי של אות. </li></ol> 3. הדמיה הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות תוכן גבוה ההדמיה SysTEM (ראה חומרים וציוד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפרט של הגדרות Imager תוכן גבוהות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סוג פלייט, פריסה, מספר תחומים, מטרה: גריינר u ברור, פורמט 96 גם, 16, 20X מים בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוצים נבחרים: EX עירור גרעין: 405 ננומטר כערוץ 4; ציטופלסמה EX: 644 ננומטר כערוץ 2; EX אנטיגן הספציפי ערוץ נוגדן: 561 ננומטר כערוץ 3 וכוח עירור הגדרה של כל לייזר, ניסוי התקנה כמו 2 חשיפות, חשיפה 1 עם עירור אחד ב644 ננומטר, חשיפה 2 עם שני עירורים ב 405 ננומטר ו561 ננומטר. בחר binning כBin2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בבארות שליטה גבוהות לאופטימיזציה חשיפה בעוצמה המרבית כערוץ SNAP-25 ובארות שליטה נמוכות לעצמה מינימאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את החשיפה, כך שהעצמה של כל ערוץ היא כמחצית מרמת הרוויה (2,000-2,500 יחידות יחסית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את מטוס Z האופטימלי בערוץ מסכת תא באמצעות סקריפט תיקון דלתא. ראה Figure 5 לתוצאות לאחר immunostaining והדמיה. נתוני יצוא לשרת שבי תוכנת ניתוח תמונה המתגוררת. </li></ol></li></ol> 4. ניתוח תמונה (איור 6) הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של אלגוריתמי תוכנת קולומבוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אלגוריתם מתאים למגזר האובייקטים העיקריים (גרעינים). במידת הצורך, להתאים את סף רקע ופרמטרים לעומת זאת. תוכנת קולומבוס מספקת 4 שיטות זיהוי גרעינים. בחר את השיטה שגרעיני קטע בצורה מדויקת על ידי בחינה ויזואלית בדיקת גרעינים מפולחים (בF שיטת 6 א igure M נבחר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אלגוריתם neurite (CSIRO neurite ניתוח 2) למגזר neurites אם נדרש, להתאים את הפרמטרים סף רקע ולעומת זאת להסרת רקע. ראה 6 ב איור לפרמטרים המשמשים לאיתור neurites. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אזורי neurite (מגזרי neurite) basאד על אובייקטים משני (neurites) באמצעות הרחבת פיקסל -3 של ערוץ טובולין β-III (Alexa קמח 640) כמסכה (איור 6 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב עוצמת ערוצי האות (SNAP-25, (Alexa קמח 568) לאזור neurites וערוץ β-III טובולין (איור 6 ד &amp; 6-ה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים רצויים ליצוא, כגון אורך neurite, עוצמות ממוצעת של SNAP-25, טובולין β-III, מספר גרעינים, מספר קטע neurite, וכו &#39;(6F איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צלחות ממלגזות צלחת באמצעות הרובוט והעומס לImager התוכן הגבוה לרכישת תמונה. </li></ol> 5. ניתוח נתונים: כדי להעריך את חוסנו של assay נועד, לחשב את הפרמטרים הבאים מהניסוי מבוסס הצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אות (S) לרקע (B): S B = עוצמת אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה) / אומר / שליטה אות נמוכה </li> &lt;li&gt; מקדמים שונה (CV) של אות ורקע (כדי למדוד את האחידות של האות הספציפית): קורות חיים = (סטיית תקן (/ ממוצע של מדגם SD)) * 100 (%), כדי לקבוע את השונות בטיפול נוזלי, ריאגנטים, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אות לרעש: S = (ממוצע עוצמת האות - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / SD שליטה נמוכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב הגורם &quot;Z עם שיכרון מחצית מצלחת 96-היטב ושכרות מדומה של החצי השני. Z &#39;= 1 - 3 * (SD שליטה אות גבוהה + SD שליטה אות נמוכה) / (ממוצע של שליטת אות גבוהה - ממוצע של שליטת אות נמוכה). לניתוח נוסף של נתוני ההקרנה, לנרמל חלק מפרמטרי הגלם העיקריים על בסיס צלחת כדי לאפשר השוואה בין לוחות ובין ימים השונים של ניסויים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוזים ממחשוף, המשקפים ירידה של האות הקשורים באורך מלא SNAP-25 זוהה על ידי נוגדן ספציפי (BACS):% מחשוף = 100% * (MEAעוצמת n שליטה אות גבוהה - עוצמת המדגם) / אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחוזים מהעיכוב של מחשוף:% עיכוב = 100% * (עוצמת המדגם - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / (ממוצע עוצמת שליטת אות גבוהה - כלומר עוצמת שליטת אות נמוכה). </li></ol>

<ol><li>Lamanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+most+poisonous+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The most poisonous poison.</a> Science. 130, 763-772 (1959).</li>
<li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> J. Infect. Dis. , (2013).</li>
<li>Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+ground%3A+assays+for+therapeutics+against+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Gaining ground: assays for therapeutics against botulinum neurotoxin.</a> Trends in microbiology. 18, 164-172 (2010).</li>
<li>Yersin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+synaptic+vesicle+fusion+proteins+explored+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interactions between synaptic vesicle fusion proteins explored by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8736-8741 (2003).</li>
<li>Dong, M., Tepp, W. H., Johnson, E. A., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+sensors+to+detect+botulinum+neurotoxin+activity+in+vitro+and+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 14701-14706 (2004).</li>
<li>Stahl, A. M., Adler, M., and, C. B. M., Gilfillan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+botulism+therapeutic+product+development+in+the+Department+of+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+Research%22%5BJournal%5D)">Accelerating botulism therapeutic product development in the Department of Defense.</a> Drug Development Research. 70, 303-326 (2009).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+to+measure+botulinum+neurotoxin+serotype+A+activity+using+cleavage-sensitive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays to measure botulinum neurotoxin serotype A activity using cleavage-sensitive antibodies.</a> Journal of biomolecular screening. 15, 42-51 (2010).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemotype+that+inhibits+three+unrelated+pathogenic+targets%3A+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+light+chain%2C+P.+falciparum+malaria%2C+and+the+Ebola+filovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">A chemotype that inhibits three unrelated pathogenic targets: the botulinum neurotoxin serotype A light chain, P. falciparum malaria, and the Ebola filovirus.</a> Journal of medicinal chemistry. 54, 1157-1169 (2011).</li>
<li>Opsenica, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+2%2C5-bis%284-amidinophenyl%29thiophene+derivatives+providing+submicromolar-range+inhibition+of+the+botulinum+neurotoxin+serotype+A+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The synthesis of 2,5-bis(4-amidinophenyl)thiophene derivatives providing submicromolar-range inhibition of the botulinum neurotoxin serotype A metalloprotease.</a> European journal of medicinal chemistry. 53, 374-379 (2012).</li>
<li>Nuss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacophore+Refinement+Guides+the+Rational+Design+of+Nanomolar-Range+Inhibitors+of+the+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">Pharmacophore Refinement Guides the Rational Design of Nanomolar-Range Inhibitors of the Botulinum Neurotoxin Serotype A Metalloprotease.</a> ACS medicinal chemistry letters. 1, 301-305 (2010).</li>
<li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem cell research. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+targeting%2C+internalization%2C+and+biological+activity+of+a+recombinant+atoxic+derivative+of+botulinum+neurotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Neuronal targeting, internalization, and biological activity of a recombinant atoxic derivative of botulinum neurotoxin A.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 673-677 (2011).</li>
<li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel%2C+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochemical and biophysical research communications. 405, 85-90 (2011).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+modulation+of+the+botulinum+neurotoxin+protein-conducting+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bimodal modulation of the botulinum neurotoxin protein-conducting channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 1330-1335 (2009).</li>
</ol>

קרישנה פ. קוטה הוא עובד של Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, המייצרת מכשירים ותוכנות המשמשות בכתב יד זה. התוכן של פרסום זה אינו משקף בהכרח את ההשקפות או המדיניות של משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב, משרד ההגנה של ארה"ב, משרד הצבא האמריקני או המוסדות והחברות הקשורים למחברים.

העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההחלמה עצבית משיכרון bont עלול להוביל לפיתוח טיפול פוטנציאלי להגנה הן על השירותים וציבוריים המזוינים נגד איום ביולוגי. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול assay HCI מפורט לסינון מעכבים של רעלים קטלניים כמו בונט /. הי...

טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם 1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת 2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis 4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin 5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה 6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים 7, 8-10. עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת. לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 11- 13. חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן 11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים. Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים 10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.

<table><tbody><tr><td>בוטולינום נוירוטוקסין A&nbsp;</td><td>מטאביולוגיות</td><td>NA</td><td>ללא מספר קטלוגי</td></tr><tr><td>לוחות מיקרוטיטר</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>פולי-D-ליזין 96 בארות צלחות</td></tr><tr><td>BACs נוגדן</td><td>Lampire ביולוגי</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National&nbsp;</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT מיני תחנת עבודה אוטומטית</td><td>פרקין אלמר</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>אופרה</td><td>פרקין אלמר</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII נוגדן טובולין</td><td>R& D Systems</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Antimouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>אנטי ארנב IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>קולומבוס תוכנת ניתוח תמונה</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Clorox bleach</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית</td><td></td><td></td><td></td> פלטות</tr></tbody></table>

assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

חלבון הקשור לסינפטוזומלי-25 (SNAP-25) הוא מרכיב של קומפלקס קולטן חלבון החיבור NSF (SNARE) המסיס החיוני לשחרור נוירוטרנסמיטר סינפטי. בוטולינום נוירוטוקסין סרוטיפ A (BoNT/A) הוא מטאלופרוטיאז אבץ החוסם אקסוציטוזיס של נוירוטרנסמיטר על ידי פיצול רכיב SNAP-25 של קומפלקס SNARE. נכון לעכשיו אין תרופות מורשות לטיפול בהרעלת BoNT/A לאחר הפנמת הרעלן על ידי נוירונים מוטוריים. הפיתוח של אמצעים טיפוליים יעילים נגד שיכרון BoNT/A הוגבל, בין היתר בשל היעדר בדיקות חזקות בתפוקה גבוהה לסינון ספריות מולקולות קטנות. כאן אנו מתארים בדיקת הדמיה בעלת תוכן גבוה (HCI) עם תועלת לזיהוי מעכבי BoNT/A. מאמצי האופטימיזציה הראשוניים התמקדו בשיפור יכולת השחזור של תוצאות בין לוחות על פני ניסויים מרובים ובלתי תלויים. אוטומציה של צביעה חיסונית, רכישת תמונה וניתוח תמונה נמצאו כמגבירים את עקביות הבדיקה וממזערים את השונות תוך מתן אפשרות להערכה רב-פרמטרית של תרכובות ניסיוניות במערכת נוירונים מוטוריים של עכבר.

נתונים מפקדים גבוהים ונמוכים יצרו שתי אוכלוסיות נפרדות עם ההבדל של שני חציונים עולה על 3 סטיות תקן (איור 7 א). המטרה של תהליך המיון היא למצוא תרכובות באוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית ביקורת חיובית, בהנחה של התפלגות נורמלית באוכלוסיית המדגם (איור 7 ב, (i)). נקודות נתונים, כי הם 3 סטיות תקן מעבר לממוצע נחשבות שונות סטטיסטית מהרעש וסווגו כ" להיט "פעיל (איור 7 ב (ב), תיבות אדומות). תרכובות המסווגים כ" להיטים "תהיה כפופ...

בוטולינום נוירוטוקסין הוא אחד הרעלנים החזקים ביותר מבין גורמי האיום הביולוגי מקטגוריה A, אך טיפול לאחר חשיפה אינו זמין. גישת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה היא מתודולוגיה רבת עוצמה לזיהוי מעכבים חדשים מכיוון שהיא מאפשרת סריקה רב-פרמטרית באמצעות נוירונים מוטוריים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, המטרה העיקרית של רעלן זה.

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח מבחן סינון פנוטיפי ש-IES botulinum תיווך מחשוף של המצע שלו SNAP 25 במטרה לזהות מולקולות קטנות המעכבות את תפקוד הרעלן במהלך איתות עצבי רגיל. פוטנציאל הפעולה גורם ל- SNAP 25 לקשור את השלפוחית הסינפטית לקרום הפלזמה של מסוף הנוירונים המוטוריים וכתוצאה מכך לשחרור נוירוטרנסמיטר . עם זאת, כאשר קיים נוירוטוקסין בוטולינום, הוא נקלט על ידי אנדוציטוזיס ומשתחרר בבוטון הסינפטי שם הוא חותך את SNAP 25 וכך מפריע לשחרור נוירוטרנסמיטר הגורם לשיתוק.בדיקה זו מזהה מולקולות שיכולות לעכב את פעילות רעלן הבוטולינום ובכך למנוע מחשוף SNAP 25 בנוכחות רעלן בוטולינום וכך לשחזר את שחרור המוליך העצבי בצומת העצבי-שרירי. בדיקת הדמיה בעלת תוכן גבוה המבוצעת עם נוירונים מוטוריים של עכבר משמשת להדגמת שימור SNAP 25 וכתוצאה מכך זיהוי של מולקולות קטנות שיכולות לעכב את פעילות הפרוטאז המתכתי של נוירוטוקסין בוטולינום. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו או שיטות קיימות כמו בדיקה ביוכימית נטולת תאים, הוא שניתן ללכוד מספר נקודות קצה פנוטיפיות בו זמנית מבאר אחת המכילה נוירונים מוטוריים המטופלים בתרכובות סינון ורעלן.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח שנתקלים בהן במהלך סינון ספרייה, כגון כימות פעילות מבוססת תאים וציטוטוקסיות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהרעלת בוטולינום מכיוון שהיא יכולה לזהות מעכבים הפועלים ישירות על ידי חסימת פעילות הפרוטאז המתכתי שלה או בעקיפין באמצעות מניעת עיבוד ספיגת רעלנים, או אולי מנגנונים אחרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהאופטימיזציה של תנאי צביעה חיסונית הדרושים לזיהוי SNAP 25 יכולה להיות מאתגרת.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לשכלל את שלב הצביעה החיסונית מכיוון שהמנוע סביב עצמו עדין למדי. שלבי העמידה והכביסה הם המפתח לפיתוח תמונות באיכות גבוהה הנדרשות לניתוח במורד הזרם. כל המחקרים המשתמשים בתאים חיים ורעלן פעיל מבוצעים בתנאי רמת בטיחות ביולוגית שתיים, מטהרים את אזורי העבודה לפני ואחרי ניסויים אלה עם חומר ניקוי חיטוי 5%, כגון תמיסת מיקרו כימיה.לאחר הבדלת תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים מוטוריים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה ידנית בת 12 ערוצים כדי להחליף את המדיה הישנה. ב-96 לוחות באר עם 80 מיקרוליטר של אמצעי התמיינות טרמינליים טריים מבצעים את שלבי השאיפה והחלוקה שורה אחר שורה כדי למזער את חשיפת התאים לאוויר הסביבה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 12 ערוצים, הוסף 10 מיקרוליטר של 10 x מתרכובות הבדיקה מלוח המקור, ואז שאב פעמיים כדי לערבב x.טפל בשתי עמודות של שש בארות עם 10 X-D-M-S-O מדולל במדיה כדי לשמש כבקרות אות גבוה ואות נמוך. דגרו על התאים עם התרכובות למשך 30 דקות בשבע מעלות צלזיוס ו-6% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, יש לדלל את הבוטולינום נוירוטוקסין A ב-PBS עם מדיית התמיינות טרמינלית כדי להניב מלאי עבודה סופי של 10 X באמצעות פיפטה רב-ערוצית, להוסיף 10 מיקרוליטר של 10 x בוטולינום נוירוטוקסין מלאי לבארות המיועדות לטיפול וגם לבארות בקרת האות הנמוכות.טפל בבארות המוגדרות כבקרה גבוהה באמצעות מדיה בלבד, טהר את כל בלאי הפלסטיק וחומרים חד פעמיים אחרים שבאים במגע עם נוירוטוקסין בוטולינום. A על ידי טבילה בתמיסת היפוכלוריט של 0.825% במים למשך 20 דקות לפחות. סמן את הצלחות בבירור כדי לציין שימוש ברעלנים ודגר את הצלחות במשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-6% פחמן דו חמצני לאחר הדגירה.השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להסיר את המדיה המכילה את הרעלן והתרכובות מכל באר ולהשליך אותה בתמיסת אקונומיקה של 10%. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מתנול קר כקרח ישירות לכל באר כדי לעצור את הנוירוטוקסין של הבוטולינום. מחשוף פרוטאוליטי.לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר קיבוע. לאחר הקיבוע, טפל בריאגנטים המנוטרלים שהושלכו עם פרוטוקולי בטיחות ביולוגית ברמה אחת והשליך בהתאם. לאחר השלכת המתנול, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר PBS כדי להחזיר להם לחות לפני צביעה חיסונית.הצביעה החיסונית הנעשית בארון בטיחות ביולוגית מסוג 2 מתבצעת באמצעות תחנת עבודה אוטומטית המסודרת כדי לאפשר גישה לראגנטים לפי הצורך וללא התערבות אנושית. טען את הלוחות המכילים את התאים הקבועים לתוך מחסנית ה-PLATE והעבר אותה לסיפון לפי הצורך לפעולות טיפול בנוזלים. באמצעות ראש פיפטה 96 המצויד בקצוות של 250 מיקרוליטר, תחנת העבודה שואבת PBS מהבארות עד ל-10 מיקרוליטר.תחנת העבודה מפזרת 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 1% סרום סוס ו-0.1% בין 20 ב-PBS לכל לוחות המיקרו. לאחר מכן החזירו את הצלחות למגזין הצלחות למשך שעה של דגירה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את המאגר החוסם והוציא 50 מיקרוליטר של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן BS ו-0.5 מיקרוגרם למיליליטר של בטא שלושה טובולין במאגר חוסם לכל הצלחות.דגרו את הצלחות למשך שעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסירו את הנוגדנים העיקריים ושטפו שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר PBST. הכן שני מיקרוגרם למיליליטר, דילולים של נוגדנים משניים המסומנים בארבע פלואורו שונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מחלקים 50 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר ודוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה יש לשאוב את הנוגדנים המשניים ולשטוף שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר PBST.לאחר מכן, ב-100 מיקרוליטר של PBS המכילים 32 ווים מיקרו-מולאריים צובעים כדי לצבוע את ה-DNA לזיהוי גרעינים. לבסוף אטמו את הלוחות בסרט אטום לאור כדי להגן על ארבע הפלואורו מפני הלבנת פוטו. ניתן לאחסן את הלוחות בארבע מעלות צלזיוס למשך שבועות ללא אובדן משמעותי של האות.במערכת רכישת התמונות, ציין את סוג הלוחית כמטחנה u. נקה את הפריסה כ-96. ובכן, עצב את מספר השדות כ-16 ואת המטרה כ-20 x מים.לאחר מכן בחר את הערוצים לעירור גרעין של 405 ננומטר. בחר ערוץ ארבע לעירור ציטופלזמה של 640 ננומטר. בחר ערוץ שני עבור עירור ערוץ נוגדנים ספציפי לאנטיגן של 561 ננומטר בחר ערוץ שלוש.לאחר מכן, הגדר את כוח העירור של כל לייזר. הניסוי יכלול שתי חשיפות מוגדרות חשיפה, עירור אחד לאחד ב-640 ננומטר וחשיפה מוגדרת שתיים עד שתיים עירורים ב-405 ננומטר ו-561 ננומטר. בחר Benning כסל שני.השתמש בבארות הבקרה הגבוהה לאופטימיזציה של חשיפה בעוצמה מקסימלית כערוץ SNAP 25 והשתמש בבארות הבקרה הנמוכה לעוצמה מינימלית. כוונן את החשיפה כך שהעוצמה של כל ערוץ תהיה כמחצית מרמת הרוויה או כ-2000 עד 2,500 יחידות יחסיות. לאחר מכן, זהה את מישור Z האופטימלי בערוץ מסיכת התא באמצעות סקריפט תיקון הדלתא.בתוכנת ניתוח התמונה, בחר את אלגוריתם הנויריטים כדי לפלח את הנויריטים. זהה אזורי נויריט על סמך האובייקטים המשניים, הנויריטים, באמצעות הרחבה של מינוס שלושה פיקסלים של תעלת הבטא שלושת טובולין כמסכה. חשב את עוצמת ערוצי האות עבור אזור הנויריט ותעלת בטא שלוש טובולין.בחר את הפרמטרים הרצויים לייצוא כגון אורך נויריט, עוצמות ממוצעות של SNAP 25 בטא שלוש, מספר גרעיני טובולין ומספר מקטע נויריט. עם השלמת ההגדרה. העבירו את הלוחות מערימת הצלחות באמצעות הרובוט, טענו אותם לתוך הדמיית התוכן הגבוה והתחילו ברכישת התמונה.מוצג כאן ניתוח תרשים קופסה של אחוז המחשוף המחושב מבארות בקרה. הוורוד מייצג את בקרת האות הגבוהה שהיא הבארות עם מדיה בלבד וללא רעלן. מעט מאוד מחשוף נצפה בבארות אלה.הכחול מייצג את בקרת האות הנמוך, כלומר הבארות עם רעלן בלבד וללא תרכובת דגימה. בארות אלה רשמו סדק משמעותי. התפלגויות היסטוגרמה אלה של ערכי הבקרה מדגימות את המרחק בין שתי אוכלוסיות הביקורת.מטרת תהליך הסינון היא למצוא תרכובות בתוך אוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית הביקורת החיובית. ההתפלגות של 192 דגימות שטופלו בתרכובת, שהכילו גם בוטולינום נוירוטוקסין A מוצגת כאן בירוק. רוב הבארות הללו הראו מחשוף משמעותי.עם זאת, היו כמה חריגים מובהקים סטטיסטית שלא הראו מחשוף משמעותי בהשוואה לביקורת. ערכי הבקרה מוצגים שוב על ידי הפסים הוורודים והכחולים בהתפלגות היסטוגרמה זו. הפסים הירוקים הראו את החפיפה של ערכי המדגם עם ערכי הבקרה.ערכי מדגם הנחשבים להיטים נבחרו מתוך החריגים שיש להם ערכי מחשוף באחוזים נמוכים משלוש סטיות תקן מהחציון של אוכלוסיית המדגם. לארבעת הלהיטים הללו יש ערכים דומים לבקרת האות הגבוהה ומייצגים את אותה תרכובת, שהיא נוירוטוקסין בוטולינום ידוע, מעכב לסיננון החוסם את מחשוף SNAP 25. מעכב זה הפגין הגנה חזקה של SNAP 25 מפני נוירוטוקסין בוטולינום A כמו גם עם הרעלן ומעכב זה התנהג באופן דומה לבארות ללא רעלן ובאופן שונה לבארות עם רעלן, אך ללא המעכב לאחר ששולט בו.טכניקה זו יכולה להיעשות תוך ארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול מספר בקרות על מנת לחשב את הביצועים הסטטיסטיים של החיבור ולאפשר החלטת כישלון מעבר עבור כל לוחית סינון בודדת בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות פרוטאוליטיות ביוכימיות כדי לענות על שאלות נוספות כגון הערכה של פגיעות סקר כמעכבים ישירים או עקיפים של Bot.לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להפוך בדיקת סינון פנוטיפית לאוטומטית המשתמשת בכימות של SNAP 25 באמצעות צביעה חיסונית כנקודת הקצה העיקרית שלה. אל תשכח שעבודה עם נוירוטוקסינים של בוטולינום עלולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן אישי ויישום נהלי טיהור וסילוק מתאימים לבוטין. תמיד יש ליטול נוירוטוקסין בזמן ביצוע הליך זה.

a-high-content-imaging-assay-for-identification-botulinum-neurotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול לזהות trichothecenes (mycotoxins של דאגה לבריאות האדם) בשיטת ההקרנה החדשה שפותחה על בסיס שיטת immunochemical תחרותי זיהוי סופי אלקטרוכימיים מודגם.

ELIME (אנזימים מקושרים חיסונית מגנטי אלקטרוכימי) שיטת איתור Mycotoxin

שרשרת הקלה של הבוטולינום נוירוטוקסין מסוג A (BoNT/A LC) היא מטאלופרוטיאז שנכנס לנוירונים מוטוריים, מבקע את המצע שלו SNAP-25 ומשבש את ההולכה העצבית, ובכך גורם לשיתוק רפוי. באמצעות בדיקה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה, ניתן לסנן ספריות גדולות של מולקולות קטנות להשפעתן על הפעילות האנזימטית של BoNT/A LC.

פלטפורמה מבוססת FRET תואמת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של מודולטורים של שרשרת אור בוטולינום נוירוטוקסין

מבחני זיהוי עצבי וטולינום BoTest מטריקס (ונט) במהירות לטהר ולכמת ונט מתוך מגוון רחב של מטריצות מדגם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור והכימות של ונט ממטריצות הן מוצקות ונוזליות ולהפגין assay עם בוטוקס, עגבניות, וחלב.

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

מתואר פרוטוקול מותאם אישית להבדיל תאי ES של עכברים לאוכלוסיות מוגדרות של נוירונים טהורים ביותר המציגים סינפסות מתפקדות והתנהגות רשת מתעוררת. ניתוח אלקטרופיזיולוגי מדגים את אובדן ההעברה הסינפטית בעקבות חשיפה לסרוטיפים של נוירוטוקסין בוטולינום /A-/G ורעלן עצבי טטנוס.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

מאמר זה מתאר שיטה microarray חלבון עבור פרופיל החיסונית ההורמונאלית, התגובות פאנל 7-ה-plex של מאוד מטוהרים Clostridium difficile אנטיגנים של sera אנושי. ניתן להאריך את הפרוטוקול מצפני תגובות נוגדנים ספציפיים בהכנות של ורידי polyclonal.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

אנו מתארים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה, בדיקת ביואוטוגרפיה ישירה וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית כדי לזהות מוצרים טבעיים מיקרוביאליים המציגים אנטגוניזם נגד פתוגנים פטרייתיים באמצעות הפתוגן Sclerotinia sclerotiorum והדברה ביולוגית Bacillus isolates כמערכת מודל.

זיהוי מונחה ביואסי של מוצרים טבעיים להדברה ביולוגית על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה - ביואוטוגרפיה ישירה

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

מאמר זה מתאר שיטות לביצוע ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטי תפקודי עם הדגימה 1.2 מ"מ המוח התיכון האדם מבנים קורטיקליים באמצעות סורק 3T. שימוש בטכניקות הללו כדי לפתור מפות טופוגרפיות של גירוי חזותי של אדם מעולה colliculus (SC) ניתנת כדוגמה.

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

מחקרים תפקודיים של מערכת השמיעה אצל יונקים באופן מסורתי שנערכו תוך שימוש בטכניקות מרחבית ממוקדות כגון קלטות אלקטרו. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה של ​​הדמיה דפוסים בקנה מידה גדולה של פעילות המודינמית עוררה בחתול השמיעתי קליפת המוח באמצעות תהודה מגנטית תפקודית.

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

למד לפתח שיטת סקר פנוטיפית לזיהוי מולקולות קטנות המעכבות את פעילות טוקסין הבוטולינום בנוירוני מוטור של עכברים. השיטה משתמשת בדימוי תוכן גבוה לזיהוי מעכבי SNAP 25.

Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

גלה סרטונים נוספים