דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר TROs של זן חיידקים מסוג בר הגדלים במדיום מלחים מינימלי בתוספת גלוקוז. זה מושג על ידי הפיכת אזור טרנספו לזן מארח מסוג בר כדי להשיג אוכלוסיית חיידקים עמידה לקנה מיצין עם טרנספוזיציה אקראית על תוספות. הטרנספורמנטים הבאים נבדקים על ידי ציפוי העתק, המזהה TROs הגדלים על מדיום עשיר, אך אינם מצליחים לגדול על מלחים מינימליים, מדיום בתוספת גלוקוז.

לאחר מכן, ה-DNA מהמוטציה מתעכל, נקשר והופך לאי קולי על מנת להשיג פלסמיד המכיל את הטרנספוזון המוקף מכל קצה על ידי מקטעים של הגן הקטוע. מתקבלות תוצאות המראות את הזהות המשוערת של הגן שנקטע על סמך ריצוף DNA וניתוח כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי. לטרנספוזון המשמש בטכניקה זו יש מקור שכפול, גן עמיד לקנאמיצין וקצוות פסיפס.

עבור טרנספוזיציות קשירת חלבון. חסר לו גן חלבון טרנספוזיציה ולכן עלינו להוסיף את גן הטרנספוזיציות הזה עם מקטע ה-DNA של הטרנספוזון, ואז הקומפלקס בין ה-DNA של הטרנספוזיציה לחלבון עובר אלקטרופוציה לתוך המארח. היתרונות העיקריים של אלקטרופורציה הם ביטול הצורך בהתמרה או צימוד.

היעדר טרנספוזיציה של גן מייצר בדרך כלל תוספות יציבות ונוכחות של מקור שכפול וגן עמידות ל-CIN מאפשרים זיהוי קל של הגן המוטנטי, המשוחזר כפלסמיד רקומביננטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה המיקרוביאלית, כגון זיהוי גנים הנדרשים לביוסינתזה של חומצות אמינו, חומצות גרעין וויטמינים. הרעיון לשיטה הזו עלה לי לראשונה כשחיפשתי גנים עמידים למתכות במיני אנטרובקטר YSU והחלטתי לשלב אותה במעבדה לפיזיולוגיה מיקרוביאלית שפיתחתי כדי לאלקטרופוטציה של תאים מוכשרים באמצעות תרבית לילה של מיני אנטרובקטר.

YSU מכינים דילול של 1 עד 20 במדיום LB טרי ודוגרים ב-30 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד ל-OD 600 בין 0.4 ל-0.6. כאשר התאים הגיעו לצפיפות המתאימה, צננו אותם על קרח למשך חמש דקות ולאחר מכן צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו-7,000 גרם למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט והשתמשו בנפח שווה של מים קרים כקרח ל-Resus.

השעו את צנטריפוגת התאים בארבע מעלות צלזיוס ו -7, 000 גרם למשך חמש דקות. לאחר חזרה על הכביסה, השליכו את הסופרנטנט ועם מים קרים כקרח השעו את התאים בנפח השווה לנפח כדור התא. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר מאזור הטרנספו ל -40 מיקרוליטר תאים.

לאחר מכן הניחו את תערובת אזור העברת התאים בווטרינר אלקטרופורציה קר כקרח והקישו את התערובת לתחתית ה-Q Vet כדי לחשמל את התאים ב-25 מיקרו phs, 200 אוהם ו-2.5 קילו-וולט. הוסף מיד 960 מיקרוליטר של מדיום SOC מעוקר מסנן מעורבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפני העברת התאים לצינור מיקרו פוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד למשך 45 עד 60 דקות.

לאחר מכן מורחים 100 מיקרוליטר של תאים על צלחת אגר LB לפני הדגירה של הצלחת למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס לרשת טרנספורמציה. הדביקו רשת למכסה של צלחת פטרי ריקה בגודל 100 על 15 מילימטר. צייר קו בתחתית צלחת אגר LB והשתמש בפיסת סרט קטנה כדי לעגן אותה למכסה המרושת כך שהרשת נראית דרך המקדחה בעזרת קיסם סטרילי.

בחר שנאי בודד ואתר אותו במרכז ריבוע ברשת, אתר שנאי אחר בריבוע סמוך והמשך עד שהלוח מלא. לאחר מכן דגרו אותו למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. זוהי לוחית המאסטר לכל צלחת שהייתה מרושתת.

הכינו ערימה של שלוש צלחות מקדחה טריות ממוספרות אחת עד שלוש. מספר אחד ל-LB יכול מספר שתיים ל-M תשע יכול. ומספר שלוש עבור LB יכול לייבש את הצלחות הפוכות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

לאחר ציור קו בחלק העליון של כל צלחת כפי שהודגם קודם לכן, השתמש באתנול של 70% כדי לנגב את כלי ציפוי ההעתק ולהניח עליו ריבוע וולטין סטרילי לפני הידוק ריבוע הוולטין כלפי מטה. לאחר מכן, יישר את הקו על לוחית המאסטר עם קו מצויר על המהדק והנח את הצלחת על גבי ריבוע הוולטין. הפעל לחץ עדין כדי להעביר את החיידקים מהצלחת לריבוע הוולטין.

לאחר מכן יישר את הקו המצויר בלוח מספר אחת עם הקו על המהדק והנח אותו על גבי ריבוע הוולטין. הפעל לחץ עדין כדי להעביר את החיידקים מריבוע הוולטין לצלחת. הסר את לוחית מספר אחת.

השליכו את ריבוע הקטיפה לכוס מים והניחו ריבוע קטיפה סטרילי נקי על כלי ציפוי העתק. כמו קודם, יישר את הקו בצלחת מספר אחת עם הקו על המהדק והנח אותו על גבי ריבוע הקטיפה החדש. הפעל לחץ עדין כדי להעביר את החיידקים מצלחת מספר אחת לריבוע הקטיפה.

הסר את צלחת מספר אחת, יישר את הקו המצויר על צלחת מספר שתיים עם קו על המהדק והנח אותו על גבי ריבוע הקטיפה. הפעל לחץ עדין כדי להעביר את החיידקים מריבוע הקטיפה לצלחת מספר שתיים, הסר את צלחת מספר שתיים לאחר חזרה על התהליך עבור צלחת מספר שלוש, דגר את הצלחות למשך הלילה ב -30 מעלות צלזיוס. מושבות שגדלות על שתי צלחות ה-LB אך לא מצליחות לגדול על צלחות M תשע נחשבות לאוצרות.

בחר TROs מלוח מספר אחת ופס על צלחת פחית LB טרייה. לאחר הדגירה למשך הלילה, בחרו שלוש מושבות מצלחת הפסים ופסו אותן על צלחת פחית LB טרייה למחרת. אתר מושבות מהצלחת המפוספסת החדשה על לוחית רשת פחית LB והשתמש בצלחת זו כדי לחזור על ציפוי העתק כפי שהודגם זה עתה.

לבצע הצלת גנים. השתמש במושבה מוטנטית מבודדת כדי לגדל שלושה מיליליטר פאונד. ניתן לתרבית לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן השתמש בערכת טיהור DNA גנומית זמינה מסחרית כדי לטהר DNA ממיליליטר אחד של התרבית ב-0.025 יחידות של BFUC אנדונוקלאז הגבלה אחת ל-14 מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר של DNA גנומי בתגובה של 20 מיקרוליטר על קרח. לאחר מכן דגרו את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות לפני העברתה ל-80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כדי לנטרל את האנזים, נתח שלושה מיקרוליטרים של ה- DNA המעוכל חלקית על ג'ל AROS של 0.8%.

לאחר מכן, הוסיפו 800 יחידות של T ארבע DNA ליגאז ל-15 מיקרוליטר של DNA גנומי מעוכל חלקית בתגובה של 500 מיקרוליטר ודגרו את התגובה בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה למחרת. זרז את ה- DNA הקשור על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של שלוש מולארי נתרן אצטט pH 5.5 ומיליליטר אחד של 95% אתנול מודגר במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מיקרו פוגה את ה- DNA בארבע מעלות צלזיוס ו -13, 500 Gs למשך 10 דקות.

שפכו את מקומות הסופרנט, שבעה אתנול 70% כדי לשטוף את הכדור. יבש אותו ברכז ואקום צנטריפוגלי והשתמש ב -10 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. כדי להשעות מחדש את ה-DNA השתמש בארבעה מיקרוליטרים של DNA מושעה כדי להפוך על ידי אלקטרופורציה של זן e coli, ECD 100 DPIR או ECD 100 DPIR אחד 16 לחסן חמישה מיליליטר של LB יכול מדיום עם מושבה אחת.

גדל אותו ב-37 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד בן לילה. למחרת לאחר טיהור ה- DNA מכל התרבית, השתמש בג'ו אחד כדי לעכל 14 מיקרוליטר של הפלסמיד. נתח 10 מיקרוליטר של הפלסמיד הלא מעוכל והמעוכל על ג'ל אגרו 0.8%.

לאחר ריצוף הפלסמיד חפש את הרצף חמישה ראשוניים GA, G-A-C-A-G שלושה ראשוניים, שהם שבעת זוגות הבסיסים האחרונים של הטרנספוזיציה ואחריהם יבוא הרצף של הגן שנקטע. השתמש בפיצוץ כדי לקבוע את התפקוד האפשרי של הגן שנקטע. אלקטרופורציה מוצלחת הניבה כמה אלפי שנאים שלכל אחד מהם לפחות טרנספוזיציה אחת בתוספת באיור זה.

הריבועים השחורים מראים שתי מושבות שגדלו על לוח הפחית LB, אך לא על הלוח הבינוני המינימלי M 9. TROs אלה הכילו ככל הנראה הפרעות בגנים המעורבים בסינתזה של חומצת אמינו, חומצת גרעין או ויטמין, שכולם נמצאים ב-lb, אך לא ב-M 9, מדיום מינימלי. ב-86 המושבות האחרות לא הייתה הפרעה בגן הדרוש לגדילה ב-M 9.

מדיום מינימלי כפי שניתן לראות כאן, DNA גנומי מעוכל חלקית מ-TRO מבודד עובר מלמעלה מ-10 קילו-בסיסים עד מתחת ל-0.5 קילו-בסיסים. הפלסמיד שניצל מורכב מטרנספוזון שני קילו-בסיסים בתוספת DNA מארח מאגף. איור זה מציג תוצאת פיצוץ עבור פלסמיד שבודד מטרו.

הרצף הקטוע דומה לגן קלוי אנטרובקטר למוטאז אכול, המעורב בביוסינתזה של L טירוזין, L פנילאלנין ו-L טריפטופן עקב שלבי גדילה מרובים בלילה. ניתן להשלים טכניקה זו תוך 10 או 11 ימים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן העתק PLA, חשוב לזכור לא למרוח את הצלחות, וניתן למנוע זאת על ידי שימוש בצלחות יבשות ועל ידי אי הזזת הצלחות לאחר הנחתן על ריבוע הוולטין.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניסויי שיבוט או השלמה כדי לאמת את תפקוד הגן המזוהה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור TROs באמצעות מוטגנזה של טרנספוזון, וכיצד לזהות באופן טנטטיבי את הגנים המוטנטיים.