שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולאמת מוטציות עמידות לתרופות. זה מושג על ידי יצירת ספריית מוטציות אקראית של האונקוגן הממוקד. השלב השני הוא ביצוע הקרנה חוץ גופית להופעתם של שיבוטים עמידים.

השלב השלישי של ההליך הוא לרצף את השיבוטים העמידים לזיהוי מוטציות עמידות. השלב האחרון הוא לאמת את המוטציות העמידות על ידי שחזור המוטציות באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר, ולאחר מכן מבחני in vitro ו-in vivo. בסופו של דבר ניתן לזהות מוטציות עמידות לתרופות רלוונטיות מבחינה קלינית כנגד זוג מטרה נתון של תרופות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ENU או שיטות מבוססות PCR הוא שהיא לא משוחדת ובניגוד ל-METAGENE ssis מבוסס PCR, זו אינה מוגבלת לגודל האונקוגן או לתכולת ה-GC של גן כלשהו. בדרך כלל, אלה החדשים בטכניקה זו יתקשו בגלל חוסר ידע בביולוגיה מולקולרית ותאית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

מכיוון שקשה ללמוד שלבי ניאוגנזה וסינון. הסיבה לכך היא שלאנשים רבים חסר ניסיון בייצור ויראלי, בתרבית תאים ובמדיה תאית למחצה. הליך זה מתחיל בטרנספורמציה של XL תאי אי קולי אדומים אחד עם פלסמיד הנושא JAK שני V 617 f איזופורם אונקוגני של JAK שני XL תאי אי קולי אדומים פגומים במנגנוני תיקון DNA, ובכך מאפשרים להם לשלב מוטציות אקראיות במהלך השכפול.

מערבבים 50 עד 100 ננוגרם של DNA פלסמיד עם 100 מיקרוליטר של תאים מוכשרים בצינור פוליפרופילן מקורר מראש. אל תשתמש ביותר מ-100 ננוגרם של DNA מכיוון שזה מקטין את יעילות הטרנספורמציה. דגירה על קרח למשך 30 דקות, תוך ערבוב עדין כל חמש דקות לכיסוי טוב של הספרייה.

השתמש בארבעה עד שישה צינורות של תאים מוכשרים. טבלו את צינורות הפוליפרופילן באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך הלם חום של 45 שניות, ואז דגרו על קרח למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום SOC לכל צינור.

דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במהירות של 225 עד 250 סל"ד למשך 90 דקות. תאי צלחת על ארבע צלחות מקדחה של 10 סנטימטר LB המכילות 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות.

לאחר שהמושבות נראות לעין, אסוף אותן על ידי גירוד הצלחות בעזרת מגרד צלחות סטרילי. אסוף את התאים מכל צלחת. לאחר מכן, ה-DNA של הפלסמיד מבודד באמצעות ערכת מיצוי פלסמיד מסחרית וההטרוגניות של המוטציות בספרייה מוערכת על ידי ריצוף יום אחד לפני לוחית הטרנספקציה, ארבע פעמים 10 לתאי HEK 2 93 T השישיים, על צלחות של 100 מילימטר ב-DM EM המכילות 10% FCS, פניצילין, סטרפטומיצין ושני מילי-מולרי L-גלוטמין.

למחרת, הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה לכל מנה של 100 מילימטר. מערבבים חמישה מיקרוגרם מספריית הפלסמיד, חמישה מיקרוגרם של פלסמיד אריזה רטרו-ויראלי ו -40 מיקרוליטר של גן FU לנפח כולל של 400 מיקרוליטר באמצעות מדיה DM E EM ללא סרום. דגרו את תערובת ה- DNA והשומנים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, החלף את המדיום של תאי HEK 2 93 T במדיום טרי והוסף את קומפלקס השומנים של ה-DNA טיפתית על גבי התאים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. לאחר שש שעות, החלף את אמצעי הטרנספקציה במדיה טרייה ודגר את הצלחות למשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס לכל ייצור וירוס.

לאחר 48 שעות של דגירה, אסוף סופרנטנטים נגיפיים המסוננים דרך מסנן אקרו דיסק של 0.45 מיקרומטר כדי להתחיל בהליך הסינון והזיהוי של JAK עמידים לתרופות שני מוטנטים V 607 F מתמרים BAF שלושה תאים עם הסופרנטנטים הרטרו-ויראליים. מערבבים 100 מיליון BAF שלושה תאים עם 100 מיליליטר של סופרנטנט וירוס לנפח כולל של 300 מיליליטר באמצעות מדיית RPMI המכילה 10% סרום ופולי מוח. מחלקים את תערובת התאים והווירוסים הזו למספר שש צלחות באר וממלאים כל באר בארבעה עד חמישה מיליליטר.

צנטריפוגה של הלוחות ב-1, 250 GS למשך 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות למחרת, איגדו את התאים המומרים עבור כל ריכוז תרופה. מערבבים 10 מיליליטר תאים עם רוקסוליטיניב בצינור של 50 מיליליטר.

ריכוזי הרוקסוליטיניב שנבדקו בדוגמה זו הם 1, 5, 2, 0.5 ו-10 מיקרומולר. החזר את הנפח ל -40 מיליליטר באמצעות RPMI המכיל 20% סרום. מוסיפים לתאים 10 מיליליטר של מקדחה של 1.2% ומערבבים בזהירות צלחת בשש צלחות באר.

מחלק ארבעה מיליליטר לבאר. דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. לאחר שמושבות עמידות נראות לעין, השתמש בקצות פיפטה של 0.2 מיליליטר כדי לבחור את המושבות ולתת-תרבית אותן בנפרד.

ב-24 צלחות באר למשך שלושה עד ארבעה ימים קוצרים את ה-BAF העמיד שלושה תאים על ידי צנטריפוגה ב-450 GS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר בידוד ה-DNA הגנומי באמצעות ערכת מיצוי DNA גנומית מסחרית, הגבירו את ה-JAK Two CDNA באורך מלא מה-DNA הגנומי על ידי PCR. לאחר מכן מופרדים תוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל של אגר רוז ורצועת ה-DNA של 3.4 קילו-בסיס.

ייצוג מסגרת שני הציפוי של JAK מבודד באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית. לבסוף, רצף את ה-CDNA באורך מלא באמצעות שמונה פריימרים פנימיים המשתרעים על רצף הקידוד ונתח את הרצפים באמצעות תוכנה מסחרית כדי לאמת מוטציות עמידות לתרופות. גרסאות נבחרות במבחנה נוצרות על ידי מוטגנזה מכוונת אתר של רצף JAK two V 617 F ומוכנסות מחדש לשלושה תאי BAF.

הוסף 50 מיקרוליטר של מדיה המכילה ריכוזים שונים של רוקסוליטיניב לבארות שעל פני הצלחת בנפרד, צלחת 10 לרביעית של ה-BAF שלושה JAK שני תאי V 617 F לכל באר של צלחת 96 באר דגרו את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 שעות כדי להעריך את כדאיות התאים, הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב WST אחד לכל באר ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות. רשום את הספיגה ב-450 באמצעות קורא צלחות. בצע את כל הבדיקות בשלוש עותקים ושרטט את הספיגה הממוצעת כנגד ריכוזי רוקסוליטיניב.

בצע עקומה סיגמואידית בהתאמה הטובה ביותר באמצעות ציון אלגוריתם התאמת עקומה לא ליניארית. ריכוז התרופה וכתוצאה מכך 50% כדאיות התא כ-IC 50 הסלולרי לאחר מכן אימות in vivo של מוטציות עמידות מבוצע כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. מכיוון ששיבוטי התאים העמידים הנוצרים על ידי מוטגנזה אקראית עשויים לשאת יותר ממוטציה אחת, יש לאמת את המוטציות הללו בבידוד הן על ידי מבחני מבחנה והן על ידי מבחני in vivo.

במבחן במבחנה, גרסאות נבחרות נוצרו על ידי מוטגנזה מכוונת אתר של רצף JAK two V 607 F והוכנסו מחדש לשלושה תאי BAF, אשר נמדדו לאחר מכן ליכולת התפשטות תאים במינונים שונים של רוקסוליטיניב כדי להעריך ערכי IC 50. בנוסף, ספיגה חיסונית לפוספוטיזין או פוספו STAT 5 בוצעה על ליזטים חלבונים של תאי BF שלושה שהודגרו במינונים הולכים וגדלים של רוקסוליטיניב כדי לשלול כל עמידות מתווכת מחוץ למטרה. מוטנטים המציגים ערכי IC 50 משופרים וזרחון עצמי מתמשך בריכוזי רוקסוליטיניב גבוהים יותר מאושרים אפוא כגרסאות עמידות לתרופות כדי לאמת עמידות in vivo.

BF, שלושה תאים שהונדסו לבטא JAK, שני V, שישה וריאנטים של 17 F ודובדבן לוציפראז הוזרקו לעכברים, ולאחר מכן הוזרקו להם רוקסוליטיניב למשך שבועיים. אחרי שבועיים. העכברים צולמו עבור ביולומינסנציה מזורזת של לוציפראז, כימריזם BAF 3 במח העצם וזרימת הדם ההיקפית הוערכה על ידי מדידת הקרינה של תאים חיוביים לדובדבן.

התוצאות מראות כי עכברים המבטאים JAK שני V 607 F הם לרוקסוליטיניב בעוד שגרסאות עמידות מראות עלייה הדרגתית בביולומינסנציה לאורך תקופת הטיפול. לאחר השליטה, ניתן לבצע ניאוגנזה אקראית תוך ארבעה עד חמישה ימים אם היא נעשית כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח ספריית DNA של פלסמיד באופן אקראי לבדיקת מבחנה כנגד כל זוג יעד של תרופות.

אל תשכח שעבודה עם רטרו-וירוסים עלולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יינקטו אמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.