Name: במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: למדו לבצע מבחן מתילציה במבחנה להערכת סטטוס מתילציית ארגינין בחלבונים באמצעות PRMTs מתוייגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של סובסטרטים וניתוח פעילות אנזימטית ישירה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי פרס הצטיינות ממשרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא, וNIH להעניק R01CA138528 לRW.

.1 הכנת בונת ביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל את הפרוטוקול, PRMTs שיבוט לתוך וקטורי ביטוי יונקים עם תג N-מסוף epitope (Myc או HA), ואת המצע במסגרת עם גלוטתיון-S-transferase (GST) לביטוי ברמה הגבוהה של חלבון וטיהור מתא חיידק lysates, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות מולקולריות סטנדרטית. </li></ol> .2 טיהור PRMTs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 100 תרבות מנות מ&quot;מ כדי לשמור על תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (Beas2B). מעבר התאים כל 3 ימים ולא נותן להם לגדול למפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלפני transfection, זרע 7.5 x 10 5 תאים במדיום תרבות 10 מ&quot;ל בצלחת תרבות 100 מ&quot;מ. מערבולת כדי לפזר באופן שווה את התאים, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב את התקשורת ולהוסיף 5 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות ללא סרום ואנטיביוטיקה. מערבולת ולשאוב את המדיום. חזור על פעולה זו אחתיותר זמן, ולבסוף מוסיף 5 מ&quot;ל של סרום / בינוני אנטיביוטיקה ללא ולהמשיך transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 6 מיקרוגרם של פלסמיד דנ&quot;א לתוך 750 μl של מדיום סרום ללא בצינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ&quot;ל, לדלל 30 μl של מגיב transfection ל750 μl של מדיום חופשי בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון בדילול מלא מגיב transfection (שלב 2.5) לצינור המכיל DNA בדילול מלא (שלב 2.4). מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת transfection בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, פיפטה תערובת transfection בעדינות על גבי התאים, מערבולת לערבב באופן שווה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 שעות, לשאוב את המדיום המכיל תערובות transfection מהתאים. הוסף בינוני תרבית תאים טריות בתוספת סרום ואנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidifiedחממה ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעה, lyse התאים ב 1 מ&quot;ל של חיץ תמוגה (שנאגרו מלוח 1x פוספט, 1% P-40, 0.5% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet, ו1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​phenlymethyl sulphonyl פלואוריד). לאסוף lysates לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק עם מרים תא דגירה lysates על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates ב15,000 XG 10 דקות בצנטריפוגה ספסל העליונה כדי לנקות את lysates מפסולת תא. [* מומלץ מאוד כדי לאשר את הביטוי של HA-PRMT1 באמצעות immunoblotting של aliquot של lysates עם אנטי HA נוגדנים, לפני שתמשיך לטיהור של האנזימים עבור assay מתילציה.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיהור של PRMTs, דגירה 3 מ&quot;ג של lysates תא עם 30 μl של 50:50 השעיה של אנטי HA מטריצת זיקה שבנאגרה מלוח פוספט (PBS), ולסובב את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במסובבי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לסובב את הצינורות ב 14,000 XG בצנטריפוגה ספסל העליון למשך 2 דקות כדי לאסוףחרוזים. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 3x עם 1 מ&quot;ל של Ripa חיץ [20 מ&quot;מ טריס (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 מ&quot;מ EDTA ו1% Triton-X-100] בכל שטיפה אחריו צנטריפוגה ב 14,000 XG עבור 2 דקות. לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את החרוזים פעם אחת עם של חיץ מתילציה 100 μl (50 מ&quot;מ טריס pH 8.5, 20 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 100 סוכרוז מ&quot;מ). לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant. חרוזים המכילים את PRMTs המשותק מוכנים לשימוש assay מתילציה. [* מומלץ מאוד להשתמש PRMTs המשותק באופן מיידי בassay מתילציה.] </li></ol> .3 טיהור של מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של GST-G3BP1 הפכה BL21 לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום לוריא-Bertani (LB) מכיל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין. לגדול תרבויות לילה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר את תרבות הלילה ל50 מ&quot;ל של מדיום LB טרי והמשךinue לגדול ל OD 600 של 0.5-0.7 (זה לוקח בערך 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר OD 600 מגיע 0.5-0.7, להוסיף איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ ולהמשיך לתרבות ל4 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,500 XG עבור 10 דקות, ולעבד את גלולה לטיהור GST או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות Re גלולה חיידקים ב5 מ&quot;ל של חיץ תמוגה (1x PBS עם מעכבי פרוטאז, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של ליזוזים, ו0.1% Triton-X-100) ו דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בשלב זה lysates יופיע עכור וצמיג עקב השחרור של הדנ&quot;א הגנומי חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירה הדנ&quot;א הגנומי ידי sonication (10 פעימות של 1 שניות כל אחד עם משרעת של 30%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את lysates על ידי צנטריפוגה ב15,000 XG 10 דקות ולהעביר את supernatant ברור לצינור 15 מ&quot;ל. אם supernatant לא ברור לחזור על centrifuתהליך gation עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לשטוף את חרוזי GST-sepharose פעמיים עם PBS הקר כקרח ולהפוך את ההשעיה 50:50 של GST-sepharose בPBS. הוסף 200 μl של ההשעיה GST-sepharose לlysate תא החיידק פינה ולסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, צנטריפוגה הצינורות ב XG 500 במשך 3 דקות כדי לאסוף את חרוזים. שטוף את החרוזים 3x עם קרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, resuspend את החרוזים של חיץ elution (50 מ&quot;מ טריס pH 8.0, 150 mM NaCl, גלוטתיון 30 מ&quot;מ) 100 μl ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 15,000 XG למשך 2 דקות ולהעביר את supernatant המכיל חלבון המטוהר לעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק. לבצע אלקטרופורזה SDS ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) ניתוח על 5 μl של החלבון המטוהר יחד עם סכומים ידועים של אלבומין בסרום שור (BSA) להעריך את הריכוז של החלבון המטוהר. </li></ol> .4 מתילציה Assay הערה: בצע את השלבים הבאים באזור נפרד המיועד לעבודת רדיואיזוטופים ובהתאם לפרוטוקולים של המוסד בביצוע ניסויים עם איזוטופים רדיואקטיביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של GST-מצע מטוהר ותערובת אב המכילה מאגר מתילציה 1x (50 מ&quot;מ טריס pH 8.5, 20 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, סוכרוז 100 מ&quot;מ), 1 μCi של S-adenosyl- L- [methyl- 3 H] מתיונין, ומים לנפח סופי של 10 μl לPRMTs המשותק (שלב 2.13) ו דגירה התגובה ב30 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 μl של חיץ מדגם 2x SDS. לאחר denaturation של הדגימות על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להפריד את הדגימות על ג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוחר יותר, להעביר את החלבונים הופרדו מג&#39;ל SDS על קרום nitrocellulose באמצעות העברת electrophoretic חצי יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה, לכסות עם הקרוםutofluor (מגבר תמונת autoradiographic), ובעדינות רוק עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. , לאחר 2 שעות לשפוך את autofluor ולשמור לשימוש מאוחר יותר. [* תווית הצינור כחומר רדיואקטיבי] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר במהירות לייבש את הקרום על נייר סינון, לאטום אותו בשקית ניילון ולחשוף את הקרום לסרט X-ray ב -20 מעלות צלזיוס. זמן חשיפה מספיק נע בין 5-30 ימים. </li></ol> .5 אישור ביטוי PRMT וטוען שווים של מצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהשיג חשיפות מספיק, להעביר את הקרום לקופסא פלסטיק המכילה חיץ חסימה [שנאגר מלוח טריס עם 20-Tween (TBST + חלב 3% דלי שומן)] ועדינות רוק עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את חיץ החסימה כפסולת רדיואקטיבית. דגירה הממברנה עם אנטי HA נוגדן (1: 1,000 דילול) בTBST הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם 3x TBST דגירה הממברנה עם נוגדן המשני אנטי עכבר שכותרת HRP(1: 5,000 דילול) בTBST בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשטוף את הממברנה עם 3x TBST, ולבצע זיהוי chemiluminiscence של חלבונים עם מצע HRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זיהוי של PRMTs מתויג-HA, דגירה הקרום עם פתרון מכתים Ponseau-S למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. מהר לשטוף 3x הקרום במים כדי לאתר את מצעים מתויג GST. סרוק את התמונה. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה משמש באופן שגרתי לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. assay חזק, ועולה בקנה אחד זה יהיה גם לספק ראיות מוחלטות על הספציפיות של PRMTs למצעים שלהם. רכיבי מפתח להצלחה של assay זה הם: .1 ביטוי של PRMTs בתאי יונקים, 2 פעילות של PRMTs המטוהר, 3 ביטוי וטיהור של מצע, ו.4 העברה מערבית מלאה של חלבוני קרום nitrocellulose. PRMTs רקומביננטי הביע, וגם מטוהרים מחיידקים יכולים לשמש בתגובות מתילציה ...

מתילציה החלבון תוארה לראשונה בשנת 1968 1. זה לא היה עד השיבוט הראשון של PRMT1 ב -1996, כי חוקרים החלו להעריך את החשיבות של שינוי שלאחר translational זה 2. מעניין, כ -2% משאריות ארגינין בחלבונים של תמציות גרעיניות מפוגלים 3, המציינים את השפע של שינוי זה. ארגינין הוא חומצת אמינו טעונה חיובי עם צד שרשרת בסיסית והחנקן / s בתוך הרשתות בצד של ארגינין יכול להיות שלאחר translationally שונה באמצעות התוספת של קבוצה מתיל, תהליך המכונה מתילציה ארגינין 4-6. מתילציה ארגינין היא מזורזת על ידי כיתה של אנזימים דהינו., transferases תיל ארגינין חלבון (PRMTs). יכול גם להיות monomethylated Arginines או dimethylated והאחרון יכול להיות או סימטרי או לא סימטרי, תלוי בסוג של PRMTs מזרזות התהליך 4-6. חלבונים המציגים argininמוטיבים עשירים דואר גליצין הם יעדים פוטנציאליים לקטליזה בתיווך PRMT. מתילציה בתיווך PRMT של מצעים הוכח לווסת אינטראקציה בין חלבונים, אינטראקציה חומצת חלבון גרעין, תפקוד חלבון, ביטוי גנים, ו / או איתות תאית, כל אלה הם הגורמים קריטיים להומאוסטזיס סלולארי רגיל 7-9. על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של מתילציה ארגינין חלבון, מבחני מדויקים, יעיל, לשחזור נדרשים לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. ב assay מתילציה מבחנה, המעריך את היכולות של PRMTs מטוהר לזרז מתילציה של מצעים שלהם, הוא assay מקובל היטב ללימוד מתילציה ארגינין 10-12. ההצלחה הכוללת של assay זה תלוי במידה רבה על הפעילות של PRMTs המטוהר. ניתן לבטא PRMTs ומטוהר מחיידקים, או תאי יונקים 10,11. assay זה במבחנה מתילציה, כמו דetailed בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה המתוארת במקור על ידי Tini ועמיתים 10. בפרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט את השלבים כרוכים בביטוי והטיהור של PRMT1 בתאי יונקים. היכולת של PRMT1 המטוהר לזרז מתילציה בראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע 8, מאוחר יותר העריכה בנוכחות מתיונין S-adenosyl-L- [methyl- 3 ח] כ תורם מתיל. שימוש assay זה, אנו יכולים באופן מהימן להגדיר את היכולות של PRMTs לרומן methylate או מצעים ידועים, שבו הוא צעד ראשוני במחקר של מתילציה ארגינין החלבון.

<table><tbody><tr><td>S-אדנוזיל-L-[מתיל-3H] מתיונין</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>מתקן עליון לבקבוקים</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 מ"ל בקבוקוני נצנוץ</td><td>National Diagnostics מק</td><td>"ט:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מופחת</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מטריצת זיקה נגד HA</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad ג'ל דוק</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד HA</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה מתילציה assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

מתילציה ארגינין חלבון היא אחד מהשינויים שלאחר translational הנפוצים ביותר בגרעין. מתילציה ארגינין חלבון יכולה להיות מזוהה ו / או שנקבעה באמצעות גישות proteomic, ו / או immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים מתיל-ארגינין. עם זאת, טכניקות אלה לפעמים יכולות להיות מטעות, ולעתים קרובות מספקות תוצאות חיוביות כוזבות. והכי חשוב, בטכניקות אלה אינם יכולים לספק ראיות ישירות לתמיכה בסגוליות מצע PRMT. במבחנה מבחני מתילציה, לעומת זאת, הם מבחני ביוכימיים שימושיים, שהם רגישים, ולחשוף באופן עקבי אם החלבונים שזוהו הם אכן מצעי PRMT. Assay מתילציה טיפוסי במבחנה כולל PRMTs מטוהר, פעיל, מצע מטוהר ותורם רדיואיזוטופים שכותרתו מתיל (S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין). כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לבודד PRMT1 הפעילו כקטליזאטור, בן משפחת PRMT הביע כל מקום בגוף. שליפעילויות transferase thyl של PRMT1 המטוהר נבדקו מאוחר יותר על חלבון ראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע, בנוכחות S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין כתורם מתיל. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק לא רק להקמת מעמד מתילציה של מצעי PRMT1 פיסיולוגיים רומן, אלא גם להבנת המנגנון הבסיסי של מתילציה ארגינין החלבון.

<html> היכולות של HA-PRMT1 לmethylate GST-G3BP1 נקבעו על ידי במבחנה assay מתילציה. PRMT1 מתויג-HA מטוהר מlysates תא Beas2B הועסק בתגובת מתילציה המכילה GST-G3BP1, ו1 μCi של S-adenosyl-L- מתיונין [methyl- 3 H], כתורם מתיל. PRMT1 יכול ביעילות לזרז מתילציה של GST-G3BP1 (איור 1, פנל עליון). תגובות מתילציה באמצעות משיכה ומורדות שבוצעו על lysates של תאי Beas2B transfected וקטור ריק שימשו כביקורת שלילית (איור 1, פנל עליון, מסלול 1). Imm...

מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את מצב המתילציה של חלבון ארגינין מתיל טרנספראז או מצעי PRMT. זה מושג על ידי ביטוי ראשון של PRTs מתויגים אפיטופים בתאי יונקים. לאחר מכן, ה-P RMTs מוזרמים חיסונית מליזאטים של התא באמצעות מהירויות SRO מצופות אנטי המגלוטינין או אנטי HA, ולאחר מכן שטיפה נרחבת להסרת חלבונים שאינם קשורים ספציפית.לאחר מכן, החרוזים השטופים מודגרים עם חלבון המצע המטוהר מחיידקים וטריטיום שכותרתו חילזון L מתיונין, או סם. לבסוף, התגובה נעצרת ומצב המתילציה של המצע נקבע באמצעות נתרן סיל סולפט, אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד או ניתוח דף SDS ואחריו רדיוגרפיה אוטומטית. בסופו של דבר, היכולת של p RMTs למתילציה של המצע נקבעת על ידי השוואת תגובות המתילציה באמצעות משקעים חיסוניים המבוצעים על הליזטים של תאים וקטוריים ריקים ותאי BRMT שעברו טרנספטציה.גישות פרוטאומיות או כתמים חיסוניים עם נוגדנים ספציפיים למתיל ארגינין יכולים לפעמים להטעות, ולעתים קרובות לספק תוצאות דואר שגויות. והכי חשוב, הם אינם יכולים לספק ראיות ישירות התומכות בספציפיות של מצע PRMT. היתרון העיקרי של בדיקת המתילציה במבחנה שאדגים בסרטון זה הוא שהיא רגישה וחושפת באופן עקבי אם החלבונים שזוהו שבהם מצעי PRMT ביום שלפני הטרנספקציה זרעים 750, 000 תאי אפיתל סימפונות אנושיים ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית.בצלחת תרבית של 100 מילימטר, סובבו את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 לחה של 5%. למחרת שואבים את המדיום ומוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום תרבית ללא סרום ואנטיביוטיקה מסתחררים ושואבים את המדיום. חזור על שלב זה פעם נוספת ולבסוף הוסף חמישה מיליליטר של מדיום ללא אנטיביוטיקה בסרום, והמשך לטרנספקציה.כדי לבצע את הטרנספקציה יש לדלל תחילה שישה מיקרוגרם של DNA פלסמיד PRMT ל-750 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום בצינור צנטריפוגה מפלסטיק סטרילי של 1.5 מיליליטר בצינור צנטריפוגה פלסטי נוסף של 1.5 מיליליטר. לדלל 30 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ל-750 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום. לאחר מכן העבירו את תמיסת המגיב המדולל לצינור המכיל DNA מדולל מעורבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.דגרו את תערובת הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, פיפטה את תערובת הטרנספקציה בעדינות על התאים ומערבב לערבוב אחיד. לאחר דגירה של שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, שאפו מהתאים את המדיום המכיל את תערובות הטרנספקציה.לאחר מכן הוסף מדיום תרבית תאים טרי בתוספת סרום ואנטיביוטיקה. לאחר דגירה של 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תאי ליסה במיליליטר אחד של מאגר ליזה. אוספים את הליזטים על צינור צנטריפוגה מפלסטיק בעזרת מרים תאים.לאחר מכן דגרו את הליזטים על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה. הליזאטים ב-15,000 GS למשך 10 דקות על צנטריפוגה על ספסל.כדי לנקות את הליזטים מפסולת תאים לטיהור P. דגרו שלושה מיליגרם של ליזטים תאים עם 30 מיקרוליטר של תרחיף של 50 עד 50 של מטריצת זיקה נגד HA במי מלח חוצצים פוספט. או PBS מסתובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס במסובב צינור.למחרת, סובב את הצינורות ב-14,000 GS על צנטריפוגה על ספסל למשך שתי דקות כדי לאסוף את החרוזים. לאחר השלכת החרוז יש לשטוף את החרוזים עם מיליליטר אחד של מאגר RIPA ואחריו צנטריפוגה כמו קודם. לאחר שטיפת החרוזים שלוש פעמים עם מאגר RIPA, שטפו את החרוזים פעם אחת עם 100 מיקרוליטר של מאגר מתילציה.לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט. החרוזים המכילים את ה-p RMTs המשותקים מוכנים לשימוש בבדיקת המתילציה. בצע את בדיקת המתילציה באזור נפרד המיועד לרדיואיזוטופ.עבודה בהתאם לפרוטוקולי המוסד לעבודה עם איזוטופים רדיואקטיביים. הכן גלוטתיון מטוהר, s transferase, או מצע GST כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שלב שני מיקרוגרם עם תערובת מאסטר המכילה מאגר מתילציה אחד x ומיקרו קירי של טרידיום שכותרתו L מתיונין.מוסיפים את התערובת ל- p RMTs המשותקים ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שעה, עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של שני XSD. מאגר דגימה לאחר דנטורציה של הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.הפרד את הדוגמאות לפי דף SDS מאוחר יותר. העבירו את החלבונים המופרדים מג'ל ה-SDS לקרום ניטרוצלולוז באמצעות העברה אלקטרופורטית חצי יבשה. לאחר ההעברה, מכסים את הממברנה בתמונה רדיוגרפית אוטומטית.מגביר ונדנד בעדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר שעתיים, שפכו את המגבר ושמרו לשימוש מאוחר יותר. יבש במהירות את הממברנה באוויר על נייר פילטר, אטום אותה בשקית ניילון וחשוף את הממברנה לסרט רנטגן במינוס 20 מעלות צלזיוס. זמני חשיפה מספיקים נעים בין חמישה ל-30 יום.לאחר השגת חשיפות מספקות, העבירו את הממברנה לקופסת פלסטיק המכילה חיץ חוסם ונדנדו בעדינות למשך שעה. השלך את המאגר החוסם כפסולת רדיואקטיבית. לאחר מכן דגרו את הממברנה עם נוגדן נגד HA ב-T tris, תמיסת מלח עם טווין 20, קיצור TBST במהלך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין למחרת.שוטפים את הממברנה עם TBST שלוש פעמים. לאחר מכן דגרו את הממברנה עם פרוקסידאז צנון סוסים שכותרתו נוגדן משני נגד עכבר ב-TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה עם נדנוד עדין. לאחר שטיפת הממברנה עם TBST שלוש פעמים, בצע זיהוי כימילומינסנציה של חלבונים עם מצע פרוקסידאז חזרת לאחר זיהוי תג HA P RMTs.דגרו את הממברנה בתמיסת מכתים פונצ'ו S למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, יש לשטוף במהירות את הממברנה שלוש פעמים במים לפני סריקת התמונה. כדי לזהות את הסובסטרטים המתויגים GST, היכולות של תג HA PMT אחד למתילציה של תג GST G שלושה PP אחד נקבעו על ידי בדיקת מתילציה במבחנה.HA TAG prm T אחד מטוהר מתאי B2B. ליזאטים שימשו בתגובת מתילציה המכילה GSTG שלוש, BP אחד ומיקרו קארי אחד של טריטיום שכותרתו שבלול L מתיונין. כתורם מתיל, p MT אחד יכול לזרז ביעילות את המתילציה של GS TG שלוש תגובות מתילציה של BP אחד באמצעות משיכות שבוצעו על ליזטים של וקטור ריק.תאי B2B שעברו טרנספטציה שימשו כבקרה שלילית. כתמים חיסוניים עם נוגדנים נגד HA אישרו את הביטוי של p rmt. לאחר מכן נעשה שימוש בצביעה אחת של פונצ'ו כדי להדגים עומס שווה של GSTG שלוש BP אחד בשתי התגובות.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת מתילציה במבחנה.

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ומדידה כמותית של ארגינין חופשי וקשור לחלבון ומתיל-ארגינינים על ידי ספקטרוסקופיית H-NMR 1.

חקר ארגינין מתילום על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים...

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ"א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ"א הגנומי היעד.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

למדו לבצע מבחן מתילציה במבחנה להערכת סטטוס מתילציית ארגינין בחלבונים באמצעות PRMTs מתוייגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של סובסטרטים וניתוח פעילות אנזימטית ישירה.

במבחנה מתילציה Assay ללמוד מתילציה ארגינין חלבון

גלה סרטונים נוספים