Name: אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב Ex Vivo תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו פרופיל מטבולי בזמן אמת של אורגנואידים מקריפטות מעי עכברים באמצעות ניתוח זרימה חוץ-תאית XF 24. שיטה זו מאפשרת למדוד צריכת חמצן וקצב חמצון בתרביות תלת-ממדיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקי RO1 CA 135,561, R01 CA151494, R01 CA174432 וP3013330 מהמכונים הלאומי לבריאות. ברצוננו להודות למישל יוסטון, אלנה Dhima וד&quot;ר אנה Velcich על הערותיהם מועילות בפיתוח פרוטוקול בידוד קריפטה. אנו מודים גם להדרכת הסוכרת ומרכז המחקר של אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה נתמך על ידי NIH P60DK20541, וד&quot;ר מיכאל בראונלי וד&quot;ר Xue-יאנג Du, שינחה ויפעיל את מתקן סוסון הים, בהתאמה.

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה. 1. בידוד קריפטה ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מאורות מהמעי הדק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מאורות מעיים מכל מודל עכברים של עניין. להרדים את העכברים עם CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בטן אורכית ולמלא את המעי דק (SI) עם פוספט הקר כקרח שנאגרו, PBS (-Ca 2 +; -Mg 2+) עם (אנטי-אנטי) אנטיביוטיקה antimycotic 2x. מהירות לבודד מעי דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לנתח ללא שומן mesenteric באמצעות אזמל. היזהר שלא לנקב את הרקמה - בכל העת לשמור על הרקמה לחה עם PBS הקר כקרח. פתח את inteStine אורכית ולשטוף ביסודיות עם קרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מעי דק לשני חלקים ולרדד באמצעות קצה צמר גפן רטוב, בעדינות לגרד את villi באמצעות שקופיות מקוררות מראש. לשטוף במרץ כמה פעמים PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 דקות ב 20 מיליליטר 1x PBS לכל חומצת ethylenediaminetetraacetic 3 מ&quot;מ (EDTA) /0.5 dithiothreitol מ&quot;מ (DTT) לניתוק אינו אנזימטית של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך ברקמה לחתיכות קטנות (2-4 מ&quot;מ) באמצעות סכין גילוח בשקופית מקורר מראש. העבר את החתיכות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר קר PBS קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה בעדינות 10x באמצעות פיפטה חד פעמית סטרילי 10 מיליליטר. בואו ברי רקמה משקעים על ידי כוח הכבידה. הסר את supernatant עם טפטפת. חזור שלוש פעמים נוספות; להפוך את supernatant בטוח הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של PBS לכל 2 מ&quot;מ EDTA. מערבולת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו משקעי רקמות ולהשליך supernatant. להוסיף 15 מיליליטר קרח PBS ופיפטה הקריםלמעלה ולמטה 5x עם פיפטה 10 מיליליטר. בואו ברי רקמת משקעים ולאסוף את supernatant כבר 1 (F1). חזור על איסוף F2-F5, כל חלקן בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר קרח הקר PBS ולרעוד הפעם במרץ ביד במשך 15 שניות. לאסוף F6 ולחזור לF7, F8. אם חתיכות רקמה מתחילות לצוף, הקש כדי לעזור להם להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק aliquot של כל חלק מתחת למיקרוסקופ. בריכת שברים המכילים כוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השברים ונקוו דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר, איסוף מאורות בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, זורקת את כדור supernatant וגלול ב-10 PBS קר כקרח מיליליטר עם מאורות אנטי-אנטי והעברת 2x לצינור 15 מיליליטר. חזור על לשטוף עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטר ADF קר כקרח, מתקדם DMEM / (&quot;נשר בינוני / חם של שינוי&quot; Dulbecco של F-12) F-12 - 2x אנטי-אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטרDF - 1x אנטי-אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מאורות באמצעות hemocytometer. התאם את קריפטה פתרון הנפח ומעביר לצינור 1.5 מיליליטר, כך שריכוז קריפטה הסופי כאשר resuspended יהיה 100-500 מאורות לכל 50 μl של תערובת דביקה חלבון (Matrigel). צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס ומאורות גלולים בתערובת החלבונים הדביקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 50 μl של קריפטה - השעיה תערובת חלבונים דביקה לכל גם בצלחת 24 גם (אזור גידול: 2 סנטימטר 2), הצבה בזהירות טיפת ההשעיה במרכז כל אחד. לשמור את הצלחת בCO 2, 37 ° C חממה ל~ 30 דקות עד שההשעיה מתמצקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מדיה μl תרבות השלמה קרה כקרח (מתקדם DMEM / F12 עם אנטי 1x - אנטי, 10 מ&quot;מ 4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, מוסף 1x B27, מוסף 1x N2, 1 מ&quot;מ N-Acetyl-L-ציסטאין ng / ml (NAC), 50 ng / ml גורם גדילה באפידרמיס (EGF), 100גולגולת של, R-Spondin 500 ng / ml). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש גורמי גדילה ב0.1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב- PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריפטה Organoid תרבות ומעבר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids קריפטה לאחר זריעת 14-21 יום מעבר (או לפי צורך) באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת שינוי בכל יום שישי וביום שני. בימי רביעי, להחליף מחצית התקשורת עם תקשורת טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם פעמיים עם 500 μl PBS ב 5 דקות במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ועדינות לשבור את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה מייקר P1000 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה תרבות 1 מיליליטר מלאה וליחיד וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשבש organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x (לבדוק מתחת למיקרוסקופ לניתוק organoid נכון עם תשואת קריפטה טובה עד שיטה עקבית מפותח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המאורות לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge;צנטריפוגות ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול ביחס של 1: 3 או 1: 6 במידת צורך מאורות resuspending, ב -50 μl Matrigel לכל טוב. המשך כפי שתואר לעיל (סעיף 1.1.16-18). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת Organoid קריפטה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם ב500 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר תקשורת ולאחת וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשבור את organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את organoids לצינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות גלולים ב500 μl הקפאת תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מאורות לcryotube, במקום הצינור במכל וחנות הקפאה ב-80 ° C מקפיא overnight. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכוכים לN 2 טנק נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר organoids קריפטה קפואה במהירות הפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl מדיה מלאה תרבות אחת, צנטריפוגות ב 100 XG, 5 דקות וגלולות בתערובת חלבונים דביקה, ותרבות כפי שתואר לעיל. להתאוששות טובה יותר, להוסיף מעכב רוק (Y-27632) לתקשורת ההקפאה. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. קריפטה Organoid מטבוליזם Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת צלחת 24 גם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ולספור מאורות בהתאם לפרוטוקול (ראה סעיף 1.1 לבידוד קריפטה וסעיף 1.2 למעבר קריפטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות גלולים בתערובת חלבונים דביקה (100-200 מאורות לכל 20 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה צלחת קריפטה-דביקה תערובת חלבונים בצלחת 24 גם assay (לוודא שיש בtriplicates לפחות עבור כל דגימה) ולאפשר ההשעיה לבסס על 37 מעלות צלזיוס בCO 2חממה; לאחר מכן להוסיף 500 μl תקשורת ותרבות השלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות תרבות (כמפורט בסעיף 1.1) ולבחון תחת מיקרוסקופ עד מאורות לגדול לתוך organoids פותח באופן מלא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי השטף Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית מימה הלילה ב2 אינם CO (0% CO 2), 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות ולשטוף organoids פעמיים עם 500 DMEM μl (בלי: גלוקוז, L- גלוטמין, פירובט נתרן וסודיום ביקרבונט, ועם: פנול אדום). חכה 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 675 μl לבינוני גם assay (DMEM עם 2 המ&quot;מ L- גלוטמין ו5 מ&quot;מ D-גלוקוז) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק המורפולוגיה המיקרוסקופית organoids קריפטה כדי להבטיח שorganoids ותערובת החלבונים הדביקה לא ניזוקו לאחר שטיפה. דגירה 1 שעה שבאינו CO 2, 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה (oligomycin, קרבוניל ציאניד-p-trifluoro-פניל-hydrazone methoxy (FCCP), rotenone) במדיום assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת המחסנית על ידי טעינת 75 μl של 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה ליציאות ברצף המחסנית: נמל - oligomycin; הנמל B - FCCP; והנמל C - rotenone (הריכוזים הסופיים במהלך assay יהיה 1 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דקות 30 מחסנית - שעת 1 ב 37 ° C בחממת 2-CO שאינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, מפעיל את מנתח XF וליצור תבנית פרוטוקול assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחסנית וצלחת שירות לXF Analyzer ולהפעיל &quot;לכייל&quot; מחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק organoids קריפטה מיקרוסקופית כדי לוודא שהם מחוברים לתערובת החלבונים הדביקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תרבית תאי עומס לפרוטוקול assay המכשיר ולהפעיל. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

אין גילויים.

בדקנו את שיעור צריכת חמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של מאורות מבודדים מעכברים בן 8 חודשים וגדלו והפכו לorganoids ex vivo. לאחר המדידה של קצב הבסיסי, חילוף החומרים קריפטה הוערך על ידי הוספת oligomycin, ציאניד קרבוניל -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) וrotenone, ברצף. הסל OCR וECAR הבסיסי נרשמו 0-29 דקות (איור 2 א ו -2 ב). בדקות ה -29, oligomycin (מנ...

סרטן מעי גס (CRC) הוא הגורם המוביל השלישי של מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית. סרטן מעי גס לא סדיר - כלומר, שנובע מאוחר יותר בחיים (&gt; 50 שנים) וללא גורמים גנטיים לנטייה ברורה - חשבונות ל~ 80% מכל המקרים, עם שכיחות מאוד מושפעות דפוסי תזונה ארוך טווח 1,2. גידולים אלה תערוכת משמרת חילוף חומרים לכיוון התלות בגליקוליזה חמצוני, הידוע בשם האפקט ורבורג, שעשוי בחלק לעשות ריכוזים גבוהים יותר של בלוקים סלולריים בניין זמינים ואנרגיה (באמצעות glutaminolysis) להתיר ואולי לנהוג שיעור גבוה של תאים סרטניים התפשטות 3-5 . מחקרים של סרטן המעי הגס, כמו גם סוגי סרטן אחרים במערכת העיכול, כולל סרטן המעי דק מספקים תובנה חשובה לסיבת היווצרות גידול. חוקר את ההבדלים מטבוליים בין מדינות נורמליות, פרו-סרטניות וסרטניות של מערכות איברים במערכת העיכול עשוי לסייע determination של סיכון יחסי להתפתחות גידולים, כמו גם גילוי המוקדם של גידולים. יתר על כן, הבנת חילוף חומרים ביו-אנרגטיים הכוללים נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה תספק תובנה בסיסית לתוך איך מדינת פיזיולוגיה של תא, הזדקנות והמחלה מדאיגה את הומאוסטזיס מעיים. ניצול של טכנולוגית assay ביו-האנרגיה לניתוח שטף תאי יכול להעריך את השיעורים של נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה בו זמנית בתאי גידול בתרבות בזמן אמת 6,7. עד לאחרונה, מחקרים במבחנה של מעי דק היו מוגבלים לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר 8,9 ואינו מייצגים את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. בשינה 2009, סאטו et al. 10 הציג מערכת ex vivo תרבות לגדול organoids אפיתל במעי עכבר תלת-ממדי (3D), או epith&quot;מיני-אומץ&quot; elial, מתאים לחקירות ניסיוניות, אבחון וטיפול 10,11. יתר על כן, מאורות מבודדים מעכברים מוגבלים calorically לשמור על מאפייני הצמיחה שינו כorganoids בתרבויות כגון 12. בהשוואה לשורות תאים הפכו, ניתן להשתמש תרבויות organoid קריפטה להפיק נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הצגת מודל הרבה יותר טוב כדי להבין את מצב in vivo. מתאמנים את טכנולוגיית ניתוח ביו-אנרגיה לassay חילוף חומרים של אנרגיה של organoids קריפטה מעיים. organoids קריפטה המעיים העכבר היה בתרבית ex vivo לפתח מחקרי חילוף חומרים של אנרגיית קריפטה organoid הוצגו. שיעור צריכת החמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של organoids קריפטה נמדדו בהעדר ונוכחותם של שני מעכבים שונים חילוף חומרים (oligomycin, rotenone) ונושאת יון (ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone קרבוניל). Orga קריפטהתגובה המטבולית noid לתרכובות כימיות אלה באו לידי ביטוי בהצלחה באמצעות ECAR משתנה וערכי OCR. מחקרים ביו-אנרגטיים תאיים יבהירו את יחסי הגומלין ההדדיים בין מצב מטבולים וסיכון למחלות ופנוטיפ בסרטן, השמנת יתר, סוכרת, הפרעות בחילוף חומרים ומחל מיטוכונדריאליות ולעזור שיטות הקרנה מראש עם השלכות ישירות על רפואת translational. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד את מאורות מעי דקים וorganoids קריפטה התרבות. יתר על כן, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש תרבויות organoid קריפטה למבחנים מטבולים.

<table><tbody><tr><td>מטריצת ממברנת מרתף BD Matrigel, GFR, נטול פנול אדום, ללא LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (מי מלח חוצץ פוספט), ללא מגנזיום, ללא סידן, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו&פריים; s Modified Eagle &prime; s בינוני ללא גלוקוז, L-גלוטמין, פנול אדום, נתרן פירובט ונתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן אדום פנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>ריכוז סופי 15 מ"ג/ליטר ב-DMEM (D5030) - <חזק>שלב 2.2.2</</td></tr><tr><td>חזק>אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית, 100x, 100 מ"ל</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>ריכוז סופי 1x או 2x</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין, Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>ריכוז סופי 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; גלוטה-מקס וסחר; תוסף</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>35050061</td><td>ריכוז סופי 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>ריכוז סופי 10 מ"מ</td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין, 25 גרם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165-25G</td><td>ריכוז סופי 1 מ"מ</td></tr><tr><td>100x N-2 תוסף, נוזל</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>ריכוז סופי 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; תוסף מינוס ויטמין A, נוזל</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>ריכוז סופי 1x</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי R-Spondin 1, CF, 50 &mu; g</td><td>מו"פ D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>ריכוז סופי 500 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים EGF, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים נוגין, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-גלוטמין, 200 מ"מ</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>ריכוז סופי 2 מ"מ</td></tr><tr><td>Gibco&reg; אבקת גלוקוז</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>ריכוז סופי 5 מ"מ</td></tr><tr><td>אמביון&reg; 0.5 מ' EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>ריכוז סופי 3 מ"מ עבור <חזק>שלב 1.1.5</חזק>; 2 מ"מ עבור <חזק>שלב 1.1.8</חזק></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>ריכוז סופי 3 מ"מ</td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>בסרום בקר עוברי PBS (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% ב-PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; הקפאת תרבית תאים</td><td>טכנולוגיות חיים</td> בינוניות <td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ROCK (Y-27632)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y0503</td><td>ריכוז סופי 10 &mu; M</td></tr><tr><td>אוליגומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O4876</td><td>ריכוז סופי 1 &mu; M</td></tr><tr><td>קרבוניל ציאניד-p-טריפלואורו-מתוקסי-פניל-הידרזון (FCCP)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2920</td><td>ריכוז סופי 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>ריכוז סופי 1 &mu; M</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>221465 ריכוז סופי 0.1 N ב- PBS</td></tr><tr><td>XF24 מנתח שטף חוץ-תאי (מנתח XF)</td><td>מדע</td><td></td><td></td> ביולוגי של סוסון ים</tr></tbody></table>

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב ex vivo תרבויות עכבר המעיים קריפטה organoid

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

רירית המעי הקטנה מציגה ארכיטקטורה חוזר על עצמו מחולק לשני מבנים בסיסיים: villi, מקרינים לתוך חלל המעי ומורכב מenterocytes הבוגר, תאי גביע ותאי enteroendocrine; ובכוכים, המתגוררים הפרוקסימלי לsubmucosa וmuscularis, חסת גזע בוגרים ובתאים ותאים הבוגר פנט, כמו גם סטרומה ותאי חיסון של מייקרו-סביבת קריפטה. עד השנים האחרונות, במחקרי מבחנה של מעי דק היה מוגבל לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר, ואינו מייצג את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. הנה, אנחנו מדגימים שיטה המותאמת מאל סאטו ואח. (2009) לculturing organoids קריפטה העיקרי מעיים עכבר נגזר מעכברי C57BL / 6. בנוסף, אנו מציגים את השימוש בתרבויות organoid קריפטה לassay הפרופיל המטבולי קריפטה בזמן אמת על ידי מדדment של הצריכה בסיסית חמצן, קצב glycolytic, ייצור ATP ויכולת נשימה. Organoids לשמור על מאפיינים שהוגדרו על ידי המקור שלהם ולשמר היבטים של ההסתגלות המטבולית שלהם באו לידי ביטוי בצריכת חמצן ושיעורי החמצה תאיים. מחקרים מטבוליים בזמן אמת בorganoid מערכת תרבות קריפטה זה הם כלי רב עוצמה כדי לחקור את חילוף החומרים של אנרגיית organoid קריפטה, ואיך זה יכול להיות מווסת על ידי גורמים תזונתיים ותרופתיים.

organoids קריפטה הוקמו מ8 חודש C57BL / 6 עכברים ישנים האכיל מטוהר דיאטה מכרסם מכון לתזונת 76A (AIN76A) אמריקאי. ניתן לגדל organoids קריפטה מעיים בתרבות לפרקי זמן ארוך מכוך בודד (איור 1 א, חץ אדום יחיד). Organoids לצמוח מתוך מבנים דמויים מערים ב18-20 ימים בתרבות (איור 1, חיצים אדומים). מאורות היו passaged כל 3 שבועות וorganoids יעילות התאוששו לאחר כל מעבר. מכשור ביו-אנרגית סוסון י...

organoids קריפטה מעי הדק תרבית ex vivo לספק מערכת תרבית רקמה שמשחזרת צמיחה של מאורות תלויים בתאי גזע והנישה שלהם. הקמנו שיטה לassay הפרופיל המטבולי בזמן אמת בorganoids קריפטה עכבר העיקרי. מצאנו organoids לשמור על מאפיינים פיסיולוגיים שהוגדרו על ידי המקור שלהם.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב Ex Vivo תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

מטרת הליך זה היא לבחון את הפרופיל המטבולי של אורגנואידים ראשוניים של קריפטה של עכבר בזמן אמת. זה מושג תחילה על ידי איסוף המעי הדק של העכבר, ולאחר מכן בידוד קריפטות המעיים שאנדרה מכופף במטריג'ל. השלב השני הוא תרבית הקריפטות עד שהן יוצרות אורגנואידים קריפטוגרפיים שגדלו במלואם.השלב הבא הוא הכנת בדיקת מחסנית למחקרים מטבוליים. השלב האחרון הוא לטעון את המחסנית ואת לוחית השירות לתוך מנתח השטף החוץ-תאי XF 24 ולהפעיל ניתוח שטף חוץ-תאי כדי למדוד את קצב צריכת החמצן וקצב ההחמצה החוץ-תאית של אורגנואידים קריפטו K. בסופו של דבר, הליך זה מאפשר לחקור את הפרופיל המטבולי של אורגנואידים קריפטו במעי העכבר הראשוני בזמן אמת.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש בתרבית תאים למאמרים מטבוליים הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך את חילוף החומרים של איברי קריפטו במעי בזמן אמת. תרביות אורגנואידים מחקות את המצב החיסוני בצורה מדויקת יותר, וזה עוזר לייצר נתונים פיזיולוגיים רלוונטיים יותר. ניתן להרחיב את הטכניקה גם לניתוח תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות אחרות של XI.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון אפיון שינויים מטבוליים בקריפס המעי הדק במהלך גידול, ובמחקר סוכרת ומטבוליזם כמו השוואת חילוף חומרים של מצבים נורמליים ומחלה. כדי להתחיל בהליך זה, פתח את הבטן של עכבר שעבר המתת חסד לאורך. מלאו את המעי הדק ב-PBS ללא סידן ומגנזיום קר כקרח ושתי אנטי-פטריות אנטיביוטיות.לאחר מכן בודד במהירות את המעי הדק. הסר את השומן המזנטרי בעזרת אזמל. היזהר לא לנקב את הרקמה ולשמור על הרקמה לחה עם PBS קר כקרח במהלך כל ההליך.פתח את המעי ושטוף אותו היטב עם PBS קר כקרח. לאחר מכן, חותכים את המעי הדק לשני חלקים. משטחים אותם בעזרת קצה כותנה רטוב.לאחר מכן, מגרדים בעדינות את ה-VII באמצעות שקופית preco. שטפו את הטישו במרץ ב- PBS קר כקרח מספר פעמים. לאחר מכן דגרו אותם ב-20 מיליליטר של XPBS אחד עם שלושה מילי-מולרי EDTA ו-0.5 מילי-מולרי DTT למשך שלוש דקות.לאחר מכן, חותכים את הרקמות לשניים עד ארבעה מילימטרים על מגלשת פרקו. בעזרת סכין גילוח, העבירו את החלקים לצינור של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר PBS קר כקרח. לאחר מכן פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה חד פעמית סטרילית של 10 מיליליטר.לאחר ששברי הרקמה מתיישבים על ידי כוח הכבידה, הסר את ה- SUP natum בעזרת פיפטה. חזור על ההליך שלוש פעמים נוספות וודא שהסופרנטנט צלול. כעת, העבירו את חלקי הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר PBS עם שני מילי-מולארי EDTA SW ודגרו את התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנוד עדין.לאחר מכן, הניחו לרקמה להתיישב והשליכו את הספינאט. הוסף 15 מיליליטר של פחם קרח PBS וצינורות למעלה ולמטה חמש פעמים. תן לשברי הרקמה להתיישב ולאסוף את הסופינאט כשבריר אחד.חזור על ההליכים כדי לאסוף את השבר שתיים לשבר חמש ושמור על השברים נפרדים. לאחר מכן, הוסיפו 15 מיליליטר קרח הנקרא PBS ונערו במרץ ביד במשך 15 שניות. אסוף את שבר שש וחזור על ההליכים עבור שבר שבע ושבר שמונה.אם חלקי הרקמה מתחילים לצוף, הקש על הצינור כדי לעזור להם להתייצב. לאחר מכן בדוק את הכמות של כל שבר עבור crips תחת המיקרוסקופ. זו דוגמה לשבר רע, וזו דוגמה לשבר טוב.משוך את אלה המכילים קריפס יחד. לאחר מכן, העבירו את השברים הנמשכים דרך מסננת תאי ניילון של 70 מיקרון ואספו את הקריפס בצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה ב-100 פעמים G למשך חמש דקות, ארבע מעלות צלזיוס, השליכו את ה-supinate והשעו מחדש את ה-PT ב-10 מיליליטר של PBS קר כקרח עם שני אנטי-פטריות אנטיביוטיות.לאחר מכן העבירו את הקריפס לצינור של 15 מיליליטר וחזרו על הכביסה פעם נוספת. לאחר מכן, שטפו את הקריפטות פעם אחת עם 10 מיליליטר קר כקרח, A DF מתקדם D-M-E-M-F 12 המכיל שתי אנטיביוטיקה אנטי-פטריית. לאחר מכן שטפו את הקריפטות פעם אחת עם 10 מיליליטר של DF המכיל אנטי-פטריית אנטיביוטית אחת.לאחר מכן, ספרו את הקריפטות באמצעות ציטומטר המו. כוונן את נפח תמיסת הקריפטה והעבר אותו לצינור של 1.5 מיליליטר כך שריכוז הקריפטה הסופי בהשעיה יהיה 100 עד 200 קריפטות לכל תערובת חלבון ג'לטיני של 20 מיקרוליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תמיסת הקריפטה ב-100 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את הסנה והשהה מחדש את הקריפטות בתערובת החלבון הג'לטיני. לאחר מכן, צלחת 20 מיקרוליטר של תרחיף תערובת החלבון הג'לטיני של הקריפטה לכל באר בצלחת שירות של 24 בארות. שמור את הצלחת בחממת CO2 בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שהמתלה מתמצק.לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של אמצעי תרבית קרים כקרח לכל באר ותרבו את הקריפס עד שהם גדלים לאורגנואידים המפותחים במלואם בהליך זה, הרטיבו את המחסנית למשך הלילה בחממה שאינה פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את מדיום התרבות ושטוף את האורגנואידים פעמיים עם 500 מיקרוליטר DMEM. לאחר חמש דקות, הוסף 675 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לכל אחד.ובכן, בדוק את המורפולוגיה המיקרוסקופית של האורגנואידים של הקריפטה כדי לדגור אותם באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הכינו 10 תרכובות הניתנות להזרקה מיקרו-מולרית במדיום הבדיקה. הגדר את המחסנית על ידי טעינת 75 מיקרוליטר של 10 תרכובות הניתנות להזרקה מיקרו-מולרית ליציאות המחסנית ברצף.לאחר מכן, דגרו את המחסנית למשך 30 דקות עד שעה בחממה שאינה פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בו-זמנית, הפעל את מנתח ה-XF וצור את תבנית פרוטוקול הבדיקה. הנח את המחסנית ואת לוחית השירות לתוך מנתח ה-XF והפעל את מחסנית הכיול לאחר מכן, טען את לוחית תרבית התאים לתוך המכשיר והפעל את הבדיקה.הפרוטוקול המוצג כאן הוא אורגנואידים של קריפטה שמקורם בעכבר C 57 שחור בן שמונה חודשים ביומיים או 18 ימים. תרבות. איור זה מציג את הבדיקה המטבולית באמצעות אורגנואידים שמקורם בששת העכברים השחורים C 57 בני שמונה חודשים שבהם מוצגים קצב צריכת החמצן וקצב ההחמצה החוץ-תאית. קריפטות מסומנות באדום, והבקרה מסומנת בכחול.הריאגנטים שנטענו מראש במחסנית הוזרקו ברצף כאוליגו מיצין, B-F-C-C-P ו-C רוטנון. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן והמטבוליזם לחקור שינויים מטבוליים באורגנואידים קריפטוגרפיים שמקורם במטופלים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד קריפטה במעי, חילוף חומרים אורגנואיד בזמן אמת.תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה לבידוד קריפטים שלמים מהמעי הדק של עכבר. ניתן להשתמש בקריפטים השלמים המבודדים כדי להפיץ אורגנואידים תלת-ממדיים מאריכי חיים ומתחדשים במבחנה.

בידוד קריפטים במעי: שיטה לבידוד קריפטות שלמות ממודל המעי הדק של מורין

טכנולוגיית הדמיה משופרת מאפשרת הדמיה תלת מימדית של איברים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים מערכת תרבית איברים שלמה המאפשרת הדמיה חיה של הווילי המתפתח במעי העכבר העוברי.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

למדו פרופיל מטבולי בזמן אמת של אורגנואידים מקריפטות מעי עכברים באמצעות ניתוח זרימה חוץ-תאית XF 24. שיטה זו מאפשרת למדוד צריכת חמצן וקצב חמצון בתרביות תלת-ממדיות.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב Ex Vivo תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

גלה סרטונים נוספים