השימוש בMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ומסד נתונים מותאמים אישית לאפיון חיידקים ילידים למערת סביבה ייחודית (Kartchner מערות, AZ, ארה"ב)

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח, ליישם ולהדגים נוהל מפורט לזיהוי חיידקים מבוסס ספרייה באמצעות MALDI לספקטרומטריית מסה. זה מושג על ידי רכישת ספקטרום מסה של חיידקים באמצעות ספקטרומטר מסה מאלוף. במחקר זה, ספקטרום מסה של 15 חיידקים שבודדו מסביבה קאוסטית נאסף הפסגות המתקבלות, דפוסים אופייניים או טביעות אצבע של החיידקים שנותחו.

ספקטרום המסה הללו מיובא לאחר מכן לתוכנה ונבנה מסד נתונים של מודלים. לאחר מכן, ספקטרום המסה הייחוס במסד הנתונים של המודל מעובד ומנותח באמצעות ניתוח אשכולות, התאמת שיא וניתוח סטטיסטי. לבסוף, ספקטרום מסה של חיידקים מקודדים עיוורים, שנבחרו באופן אקראי מ-15 החיידקים הללו נאספים שוב ומושווים לספקטרום הייחוס במסד הנתונים של המודל לתוצאות הזיהוי מראות שניתן לזהות חיידקים בצורה נכונה על סמך מקדמי דמיון או סמנים ביולוגיים פוטנציאליים ומחלקות שיא.

התחל הליך זה עם תצהיר של מיקרוליטר אחד של תמצית חלבון שאינה מכילה תאים ברי קיימא על צלחת מטרה מנירוסטה ואפשר לה להתייבש. לאחר מכן מכסים את תמצית החלבון המיובשת במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצה ומניחים לה להתייבש. לאחר מכן הפקידו מיקרוליטר אחד של תקן CBR על לוחית המטרה לאחר שהיא מתייבשת, כסו את ה-CBR במיקרוליטר אחד של תמיסת מטריצה והניחו לו להתייבש.

לבסוף, הפקידו שני מיקרוליטרים של תמיסת מטריצה על לוחית המטרה כבקרה שלילית. השתמש בספקטרומטר רב למסה המצויד בלייזר חנקן ומופעל באמצעות תוכנת הבקרה Bruker flex. אסוף כל ספקטרום מסה במצב ליניארי חיובי על ידי צבירה של 500 זריקות לייזר במרווחים של 100 זריקות.

הגדר את מקור היונים מתח אחד ל-20, קילו-וולט את מקור היונים, שני מתחים ל-18.15 קילו-וולט ומתח העדשה ל-9.05 קילו-וולט. פרמטרים אלה הם ספציפיים למכשיר ועשויים לדרוש אופטימיזציה. הגדר את טווח המסה לטעינה להערכת ספקטרום אוטומטית בין שניים ל-20 קילודלטון לטעינה.

לאחר מכן הגדר את סף הרזולוציה המינימלי ל-100. בחר את אלגוריתם זיהוי שיא ה-OID. הגדר את סף יחס האות לרעש לשניים, ואת סף העוצמה המינימלי ל-100.

לבסוף, הגדר את שיא הצטברות ל- 500 עבור עיצוב מסד נתונים. צור מסד נתונים חדש בביו-נומריה 7.1 באמצעות אשף מסד הנתונים החדש. לאחר מכן צור סוג ניסוי ספקטרום, כגון maldi, באמצעות פקודות בחלונית סוגי ניסויים.

לאחר מכן, צור את הרמות באמצעות לוח עיצוב מסד הנתונים, נווט לתפריט מסד הנתונים והוסף רמות חדשות באמצעות הפקודה הוסף רמה חדשה כאן. צור רמת מינים, רמת שכפול ביולוגי ורמה טכנית. לייבא את ספקטרום המסה הגולמי.

ראשית, ייצא את ספקטרום המסה הגולמי כקבצי טקסט באמצעות ניתוח גמיש על ידי ניווט בתפריט הקובץ ולחיצה על פקודת ייצוא ספקטרום המסה. לאחר מכן ייבא את ספקטרום המסה הגולמי למסד הנתונים ברמת השכפולים הטכניים. עבד מראש את ספקטרום המסה הגולמי על ידי ייבוא ודגימה מחדש באמצעות אלגוריתם התאמה ריבועי

לאחר מכן בצע חיסור בסיסי באמצעות דיסק מתגלגל בגודל של 50 נקודות חישוב רעש באמצעות טרנספורמציה של גל רציף או CWT. החלק את הספקטרום באמצעות חלון קייזר עם גודל חלון של 20 נקודות ובטא של 10 נקודות. לאחר מכן בצע חיסור בסיס שני באמצעות דיסק מתגלגל בגודל של 200 נקודות.

לבסוף, זהה את הפסגות באמצעות ה-CWT עם יחס אות לרעש מינימלי של 10 לאחר עיבוד מקדים של דפוסים אופייניים בטוחים של כל ספקטרום מסה, כגון רשימות שיא, המכילות גדלי שיא, עוצמות שיא ויחס אות לרעש. בשלב הבא, צור ספקטרום מסה מורכב מספקטרום מעובד מראש באמצעות הפקודה המסוכמת בתפריט הניתוח. בחר שכפול ביולוגי כרמת היעד. הנה.

שלב ספקטרום מסה של 10 שכפולים טכניים של אותה מושבה כדי להניב ספקטרום מסה מרוכב עבור אותה מושבה, וכתוצאה מכך שלושה ספקטרום מסה מרוכב עבור אותו מבודד ברמת השכפול הביולוגי. לבסוף, סכם את שלושת הספקטרום המרוכב כדי ליצור ספקטרום מרוכב אחד עבור אותו מבודד ברמת המין. כדי לבצע ניתוח אשכולות מבוסס דמיון וקנה מידה רב-ממדי, צור קבוצות עם צבעים.

ראשית, בחר את שלושת ספקטרום המסה המרוכב הביולוגי ולחץ על הפקודה צור קבוצה חדשה מבחירה בתפריט הקבוצה כדי ליצור קבוצה עבור המבודד המתאים. לאחר מכן עצב צבע המשמש אוטומטית לשלושת ספקטרום המסה הללו. בצע ניתוח אשכולות על ידי ניווט בתפריט האשכולות ולחיצה על הפקודה חשב ניתוח אשכולות.

בהגדרות ההשוואה, עמוד ראשון, בחר את מתאם פירסון והשאר פרמטרים אחרים כברירת מחדל. בעמוד השני, בחר שיטת קבוצת זוגות לא משוקללת עם ממוצע אריתמטי. לאחר מכן לחץ על סיום.

השג עלילת קנה מידה רב מימדית באמצעות פקודת קנה המידה הרב-ממדי בתפריט הסטטיסטיקה כדי לבצע התאמת שיא. לחץ על סוג הספקטרום maldi בחלונית הניסויים. לאחר מכן בחר פריסה.

הצג תמונה, מוצגים פסגות בודדות של ספקטרום. לאחר מכן בצע התאמת שיא באמצעות הפקודה do peak matching בתפריט הספקטרום כדי לזהות שיעורי שיא בצע אשכולות דו-כיווניים על ידי לחיצה על מטריצת סטטיסטיקה. כרייה. עוצמת הפסגות המותאמות למחלקות השיא מיוצגת כמפת חום לזיהוי חיידקים בשיטה המבוססת על מקדם דמיון, יצירת השוואה ויצירת רוגרמה המבוססת על ספקטרום מסה ברמת השכפול הטכני כפי שבוצע לניתוח אשכולות, שמור את הרוגרמה להשוואת דמיון.

בחר ספקטרום מסה לא ידוע ולחץ על הניתוח. זיהוי ערכים נבחרים. תיבת הדו-שיח לזיהוי מופיעה.

בחר את סוג המסווג המבוסס על השוואה ולחץ על הבא. בעמוד הבא, בחר את הגרם שנשמר כהשוואת הפניה ולאחר מכן לחץ על הבא. בחר את הדמיון הבסיסי כשיטת זיהוי ושוב, לחץ על הבא, בחר את הדמיון המקסימלי כשיטת הניקוד.

הקלד את ערכי הסף המתאימים ואת ערכי ההפרש המינימליים עבור כל פרמטר ולאחר מכן לחץ על הבא. לאחר השלמת החישובים, חלון הזיהוי מופיע בלוח התוצאות. מופיעים החברים במסד הנתונים המתאימים ביותר ללא-ידוע.

רוגרמה המבוססת על ניתוח אשכולות מראה דמיון בין כל מבודד במסד הנתונים. מערך הנתונים מכיל ספקטרום של 15 מינים שונים עם שלושה ספקטרומים מורכבים לכל מין. ניתוח אשכולות דו-כיווני יכול לעזור לחוקרים לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים למין או לזנים בתוך מין.

כאן, עוצמת שיא מיוצגת על ידי צבעים, ירוק פירושו עוצמה נמוכה, ואדום פירושו עוצמה גבוהה. לבסוף, על סמך ניתוחים אלה, ניתן להשוות את ספקטרום המסה של לא ידוע לגרם ולהשיג זיהוי מבוסס מקדם דמיון.