זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות את האינטראקציה בין שני חלבונים או תחומי חלבון. במקרה זה, תחומי החלבון הקשורים לסרטן עדיין נחקרים ו-CHFR. המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות את האינטראקציה בין שני חלבונים או תחומי חלבון.

במקרה זה, תחומי החלבון הקשורים לסרטן עדיין נחקרים ו-CHFR. השלב השני הוא לדגור את מערך הפפטידים CHFR עם השותף המקשר שלו, חלבון הדומם. לאחר מכן, המערך נשטף ומודגר עם פרוקסידאז צנון סוס, נוגדן מצומד.

לאחר מכן המערך נתון לזיהוי זוהר כימי כדי לזהות את הכריכה. השלב האחרון הוא ניתוח התוצאות וזיהוי אתרי הקישור בין החלבונים. מחקר זה סולל את הדרך לתכנון מעכבים רציונליים של קשירת CHFR עדיין, שהאינטראקציה הבלתי מבוקרת שלהם עלולה להוביל להתפתחות סרטן.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר אינטראקציה בין חלבונים, כגון מהם האזורים הספציפיים שעושים מדיטציה אינטראקציה בין שני חלבונים, חלקו את רצף חלבון המטרה ל-10 עד 20 שאריות פפטידים. זה חופף חלקית. כמות החפיפה יכולה להיות מגוונת, אך באופן עקרוני, ככל שהחפיפה ארוכה יותר, כך ייטב.

בעת תכנון הפפטידים קחו בחשבון אלמנטים משניים ידועים בחלבון שיכולים להיות אחראים לאינטראקציה. ניתן להזמין את מערך הפפטידים המעוצב דרך ספקים מסחריים. עבור ניסוי זה, פפטידים משאריות תחום CHFR 4 24 עד 6 62 קשורים קוולנטית למערך דרך מסוף C.

לאחר קבלת המערך המתוכנן, הכינו אותו לניסוי על ידי חסימתו תחילה כדי למנוע קשירה לא ספציפית. הכינו תמיסת חסימה של 2.5% משקל לנפח. אבקת חלב רזה בתמיסת tris buffer המכילה 0.05% Tween 20 או TBST למניעת קשירה לא ספציפית.

טבלו את המערך בחמישה מיליליטר של תמיסת חסימה. דגרו את המערך במשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. שטפו תחילה את המערך עם חמישה מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 שניות.

לאחר מכן שטפו את המערך פעמיים עם חמישה מיליליטר TBST למשך חמש דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את המערך השטוף עם חמישה מיליליטר של תמיסת חלבון מתויגת פולי היסטידין המכילה 2.5% משקל לנפח. יש לערבב אבקת חלב רזה למניעת קשירה לא ספציפית.

כאן משתמשים בתמיסה של 4.5 מיקרו-מולרית של שאריות חלבון דומם 500 עד שש 50. לאחר מכן דגרו את המערך בתמיסת החלבון למשך שלוש עד שמונה שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה בתמיסת החלבון.

שטפו את המערך עם חמישה מיליליטר TBST למשך 30 שניות על שייקר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות נוספות של חמש דקות. כעת דגרו את המערך השטוף עם חמישה מיליליטר של נוגדן מצומד פרוקסידאז צנון סוסים מדולל במאגר דגירה המכיל את אותם מרכיבים באותם ריכוזים כמו תמיסת החסימה למשך שעה אחת על שייקר בטמפרטורת החדר, הנוגדן יכול לקשור את חלבון המטרה או את התג, לבצע ניסויי בקרה, לבדוק את האינטראקציה של הנוגדן עם פפטידים במערך על ידי חזרה על אותו פרוטוקול במערך נפרד החלק מבלי לדגור עם החלבון לפני קריאת המערכים. שוטפים אותם כמו קודם עם חמישה מיליליטר TBST.

בצע פיתוח כימילומינסנציה עם ערכת מצע משופרת של כימילומינסנציה מערבית. בצע את הזיהוי עם מנתח תמונה זוהר כגון מצלמת Fuji film LAS 3000. נתח את התוצאות, וודא ששני הכפילויות במערך מציגות את אותם אותות כדי שהתוצאות יהיו אמינות.

אם המבנה של שותף החלבון ידוע, חפש במבנה את פפטידי הקישור וחפש את אתרי הקשירה. זכור שפפטידים שנמצאים רחוק ברצף יכולים להיות יחד במבנה השלישוני וליצור אתר קשירה. בדוגמה שלנו, עדיין חלבון סנטרו סומלי חשוב ביותר השולט בחלוקת תאים תקינה והתפשטות תאים עדיין מקיים אינטראקציה עם מספר חלבונים דרך האזור הלא מסודר מהותי שלו.

באמצעות מערך הפפטידים המתוכנן, נחשפו אתרי הקישור שעדיין במדכא הגידול CHFR. כל נקודה שחורה במערך מייצגת פפטיד שמקורו ב-A-C-H-F-R שחייב עדיין לציין שכל פפטיד מופיע פעמיים מכיוון שהוא קיים בשכפול, מה שמאמת את אמינות התוצאות. סינון מערך הפפטידים חשף שבעה פפטידים שמקורם ב-CHFR שנקשרו לשאריות האזור שעדיין לא מסודרות באופן מהותי 500 עד 6 50.

תוצאות אלה אפשרו לנו למפות את אתר הקישור של סטילס על CHFR. למרות המרחק של שבעת הפפטידים הללו ברצף הראשוני של CHFR. הם יוצרים אתר קשירה מוגדר היטב למבנה השלישוני של CHFR.

שיטה זו ישימה לאפיון כל אינטראקציה עם חלבון בעקבות הליך זה. יש להשתמש בשיטות כמותיות כמו פלואורסצנטיות ואיזוטופ או ITC על מנת לאמת, לכמת את הכנסת הפפטיד.