Name: זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: למדו לזהות אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות מערכי פפטידים. הפרוטוקול ממפה אינטראקציות בין חלבון still לדומיין CHFR בסרטן ומסייע באיתור מטרות תרפויות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF נתמכה על ידי מענק החל ממועצת המחקר האירופית תחת שביעי תכנית המסגרת של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) / הסכם ERC גרנט N ° 203,413 ועל ידי מרכז מינרבה לביו-היברידי systems.HA המורכב וAI נתמך על ידי דליה ודן מידן המלגה לסטודנטים לתואר מתקדם באוניברסיטת עברית בירושלים.

1. עיצוב מערך פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את הרצף של חלבון המטרה לחופף חלקית 10-20 פפטידים שאריות. לשנות את כמות החפיפה בניסוי הספציפי והמשאבים של המעבדה ביצוע, אבל באופן עקרוני כבר החפיפה טובה יותר. בעת תכנון פפטידים לקחת באלמנטי מבנה המשני חשבון ידוע בחלבון שיכול להיות אחראי לאינטראקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזמן את מערך פפטיד המיועד דרך ספקים מסחריים. כאן, פפטידים שימוש קשורים קוולנטית למערך באמצעות C-הסופי. </li></ol> 2. חסימה הלא ספציפי מחייבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון חיץ 50 מ&quot;מ טריס או פוספט המכיל 0.05% Tween 20 (TBST / PBST) ולהתאים את ה- pH הרצוי עם כמות מדודה של HCl או NaOH (כדי לדעת הכוח היוני המדויק) וכוח יוני הרצוי עם NaCl . כאן, להשתמש pH של 7.5 וחוזק יוני של 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון החסימה2.5% (w / v) ברפרוף אבקת חלב ב TBST / PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע הלא ספציפי מחייב, לטבול את המערך ב 5 מיליליטר של תמיסת חסימה. דגירה המערך ל2-4 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ºC על שייקר. </li></ol> 3. דוגרים עם החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערך ראשון עם 5 מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 שניות ולאחר מכן פעמיים עם 5 מיליליטר TBST / PBST במשך 5 דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך נשטף עם 5 מיליליטר של מתויג פתרון החלבון המכיל 2.5% (w / v) ברפרוף אבקת חלב כדי למנוע הלא ספציפי מחייב. כאן, להשתמש 4.5 מיקרומטר של פתרון חלבון (STIL 500-650) מומס בפתרון החסימה המתואר. הערה: בדרך כלל חלבון מיקרומטר 5-10 משמש להקרנה, אך ריכוז החלבון יכול להיות אפילו נמוך כמו 2-3 מיקרומטר, בהתאם לזיקה המחייבת והריכוזים המקומיים של פפטידים שקשרו במערך (יעילות של סינתזה). החיץ שבו החלבוןנמס יכול להשתנות, אך הוא נפוץ לדלל את החלבון באמצעות אותו פתרון החסימה שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את המערך בפתרון החלבון ל3-8 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ºC. </li></ol> 4. דוגרים עם הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערך שלוש פעמים עם 5 מיליליטר TBST / PBST. ההדחה הראשונה היא למשך 30 שניות ואחריו שני 5 שוטף דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך נשטף עם 5 מיליליטר של נוגדן HRP-מצומדות מדולל (1: 1,500) בחיץ דגירה המכיל את אותם מרכיבים באותו הריכוזים כפתרון חסימה, עבור שעה 1 על שייקר בטמפרטורת חדר. הנוגדן יכול להיקשר גם חלבון המטרה או התג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויי שליטה בודקת את האינטראקציה של הנוגדן עם פפטידים על המערך, במיוחד אם המערך מכיל פפטידים מחלבון המטרה (למשל, לoligomerization מחקרים) על ידי חזרה על אותו הפרוטוקול ללא STEעמ &#39;3, דוגרים עם החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המערך שלוש פעמים עם 5 מיליליטר TBST / PBST. ההדחה הראשונה היא למשך 30 שניות ואחריו שני 5 שוטף דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li></ol> 5. קריאת המערך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע פיתוח chemiluminescence עם ערכה מערבית סופג ECL מצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את זיהוי עם מנתח תמונה זורח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התוצאות. ודא ששני הכפילויות במערך מראות את אותה אותות, ולכן התוצאות הן אמינות. אם המבנה של שותף החלבון ידוע, לחפש במבנה לפפטידים המחייבים ולחפש אתרי קישור. גם פפטידים שהם רחוקים ברצף יכולים להיות קרובים זה לזה במבנה שלישוני וליצור אתר קישור. </li></ol>

<ol><li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptides+to+study+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using peptides to study protein–protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li>
<li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot-synthesis%3A+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable%2C+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li>
<li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li>
<li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li>
<li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li>
<li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays%3A+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique%3A+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports%E2%80%94principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li>
<li>Innovative Peptide Solutions. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jpt.com">http://www.jpt.com</a> (2014).</li>
<li>PEPSCAN shaping peptides to perfection. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.pepscan.com">http://www.pepscan.com</a> (2014).</li>
<li>Intavis Bioanalytical Instruments. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.intavis.com">http://www.intavis.com</a> (2014).</li>
<li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li>
<li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li>
<li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).</li>
<li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li>
<li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li>
<li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li>
<li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li>
<li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li>
<li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li>
<li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li>
<li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li>
<li>Olaussen, K. a, Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li>
<li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Vif%E2%80%93A3G+interaction+using+peptide+arrays%3A+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li>
<li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li>
<li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+%28tBID%29+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+%28MTCH2%29+Protein%3A+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li>
<li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הקרנת מערך פפטיד היא כלי מצוין לזיהוי אתרי הקישור של חלבון מטרה בשותפיה. assay זה הוא מהיר וקל לביצוע וניתן לקבל תוצאות באחד או שני ימי עבודה. הקרנת מערך פפטיד היא תכליתית ויכולה לשמש למטרות רבות. ניתן להשתמש בו לאפיון שינויי תרגום פוסט כגון זרחון וזיהוי מצעים של קינאזות. לדוגמא: קינאז FLT3, אשר קשורים לאקוטיים לוקמיה מיאלואידית, phosphorylates פפטידים מצע Tyr המכיל נמצאו על ידי מערך פפטיד הקרנת 6. התכונות המעכבות של pazopanib מעכבי טירוזין קינאז וlapatinib נבדקו באמצעו...

אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא החי. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון. סיבה לכך הוא פפטידים יכולים להיות מסונתזים בקלות ולאפשר התמקדות באתר אינטראקציה ספציפית מצד אחד, ועל מטרות חלבון מרובות באופן תפוקה גבוהה על יד 1,2 האחר. הקרנת מערך פפטיד היא מהיר, קל לביצוע בשיטה לקבלת כמות גדולה של נתונים על האינטראקציות של חלבון מטרה עם שותפים רבים בזמן קצר 3. שלא כמו שיטות ביוכימיות או ביו-פיסיקליות אחרות לאיתור וניתוח אינטראקציות בין חלבונים, הקרנת מערך פפטיד דורשת ריכוז נמוך מאוד של חלבון והוא יכול לזהות חלש מאוד מחייב. מערכי פפטיד יכולים לשמש ליישומים רבים באינטראקציות פפטיד חלבון כגון מיפוי חלבונים או אתרי האינטראקציה קולטן ליגנד 4, ממשקים שָׁוֶה או הטרו-oligomerization של, נוגדנים המאפיינים epitopes 5, לומדים פעילויות אנזים 6 ותפוקה גבוהה structure- יחסי פעילות (SAR) לומדים 7. לבחינה מעמיקה על הקרנת מערך פפטיד לראות כץ ואח &#39;. 4 מספר סוגים של מערכי פפטיד קיימים כיום. ישנן שתי אסטרטגיות עיקריות סינתטיות להכנת מערכי פפטיד: סינתזה של פפטידים לפני צירופם התמיכה המוצקה, או הסינתזה של פפטידים ישירות על התמיכה המוצקה, בעיקר באמצעות 4,8 טכניקת SPOT.פפטידים מסונתזים על התמיכה המוצקה בדרך כלל על ידי 9-fluorenylmethyloxycarbonyl כימיה (Fmoc) 8. בין התוכניות סינתטיות הנפוצות קובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית N (למשל, מערכי pepstar JPT 9) וקובץ מצורף פפטיד דרך התחנה הסופית C הם (למשל, מערכי pepchip PEPSCAN 10, מערכי JPT pepspot 9 ומערכי celluspot INTAVIS 11) 4. התמיכה המוצקה יכולה להשתנות וכך גם הכימיה של צימוד פפטיד אליו. יכולים להיות מחוברים פפטידים הופסקו-Cys שקופיות זכוכית באמצעות קבוצת תיאול 12. התחנה הסופית N של פפטיד יכולה להיות מחויבת קוולנטית לקבוצת הידרוקסיל על הקרום תאית באמצעות esterification של חומצת אמינו מחובר 8. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון מערכי פפטיד כשיטה לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון. המערך השתמשנו הוא מערך Celluspots, שהוא מיקרו-מערך המכיל amo הגדולUNT של כתמים (כפילויות של עד 384 נקודות) על קרום תאית קטן הנתמכים על ידי שקופית זכוכית. זה מאפשר עבודה עם כמויות נמוכות של חלבון ונוגדנים וקבלת כמות משמעותית של נתונים לכל ניסוי בודד. מערך זה מכיל גם צפיפות פפטיד גבוהה המאפשרת זיהוי של זיקה נמוכה מחייבת. המערך שימש למיפוי האינטראקציה Stil-CHFR, וזה חשוב מאוד לשליטה בתא נורמלי התפשטות 13. אינטראקציה בלתי מבוקרת בין שני החלבונים יכולה להוביל להתפתחות הסרטן. על ידי מיפוי אינטראקציה זו שמצאנו את אתר הקישור הספציפי ומחייבים שאריות 14. זו סוללת את הדרך לעיצוב מעכבים רציונאליים המעכבים אינטראקציה חלבון-חלבון זה.

<table><tbody><tr><td>מערך פפטידים</td><td>INTAVIS מכשירים</td><td></td><td></td>ביואנליטיים</tr><tr><td>נוגדן בדיקה שלו (H-3) HRP</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL ערכת</td><td>תעשיות ביולוגיות</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>חלב רזה</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת LAS-3000&nbsp;</td>סרט <td></td><td></td><td>פוג'י</td></tr></tbody></table>

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

אינטראקציות בין חלבונים לתווך את רוב התהליכים בתא הומאוסטזיס ושליטה חיים של האורגניזם. אינטראקציות חלבון פגומות עלולות לגרום למחלה, מה שהופך את אינטראקציות חלבון מטרה לתרופות חשובות. מכיוון שכך, חשוב מאוד להבין האינטראקציות הללו ברמה המולקולרית. אינטראקציות חלבון נלמדות תוך שימוש במגוון של טכניקות הנעות בין מבחני סלולריים וביוכימיים למבחנים ביו-פיסיקליים כמותי, ואלה עשויים להתבצע גם עם חלבונים באורך מלא, עם תחומים חלבון או עם פפטידים. פפטידים לשמש כלי מצוין כדי לחקור אינטראקציות חלבון שכן הוא יכול להיות מסונתזים פפטידים בקלות ולאפשר התמקדות באתרי אינטראקציה ספציפיות. מערכי פפטיד יאפשר זיהוי של אתרי האינטראקציה בין שני חלבונים, כמו גם הקרנה לפפטידים שנקשרים חלבון המטרה למטרות טיפוליות. הם גם מאפשרים מחקרי SAR תפוקה גבוהה. לזיהוי אתרי קישור, typiמערך פפטיד קאל מכיל בדרך כלל חופף חלקית 10-20 פפטידים שאריות נגזרים מהרצפים מלאים של חלבונים אחד מבני זוג או יותר של חלבון המטרה הרצויה. הקרנת המערך לכריכה חלבון המטרה מגלה פפטידים המחייבים, המקביל לאתרי הקישור בחלבונים הדומים, בשיטה קלה ומהירה רק באמצעות כמות קטנה של חלבון. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להקרנת מערכי פפטיד למיפוי אתרי האינטראקציה בין חלבון מטרה ושותפיה. מערך פפטיד נועד מבוסס על הרצפים של חלבוני השותף לוקחים בחשבון מבנים משניים שלהם. מערכי שימוש בפרוטוקול זה היו מערכי Celluspots שהוכנו על ידי מכשירי Bioanalytical INTAVIS. המערך חסום כדי למנוע נוקבים מחייבים ולאחר מכן הודגרו עם החלבון הנחקר. זיהוי באמצעות נוגדן חושף פפטידים מחייבים המתאימים לאתרי אינטראקציה הספציפיים בין החלבונים.

STIL הוא חלבון centrosomal חשוב מאוד. היא שולטת התפשטות חלוקת תאים נורמלית ותאי 13,15 - 19. STIL אינטראקציה עם כמה חלבונים 18,20,21, ורוב האינטראקציות מתרחשים דרך החלק המרכזי שלה, שהוא אזור במהות סדר (IDR) 14. עיצבנו מערך המורכב של פפטידים הנגזרים מCHFR החלבון הקושר STIL. CHFR הוא מדכא גידולים הנגרם בתגובה להמיטוטי מתח 22. מכיוון שהמבנה של תחום מחייב STIL של CHFR לא היה ידוע באותה העת, חילקנו את תחום החלבון לפפטידים ארוכים 15 שאריות עם ח...

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות את האינטראקציה בין שני חלבונים או תחומי חלבון. במקרה זה, תחומי החלבון הקשורים לסרטן עדיין נחקרים ו-CHFR. המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות את האינטראקציה בין שני חלבונים או תחומי חלבון.במקרה זה, תחומי החלבון הקשורים לסרטן עדיין נחקרים ו-CHFR. השלב השני הוא לדגור את מערך הפפטידים CHFR עם השותף המקשר שלו, חלבון הדומם. לאחר מכן, המערך נשטף ומודגר עם פרוקסידאז צנון סוס, נוגדן מצומד.לאחר מכן המערך נתון לזיהוי זוהר כימי כדי לזהות את הכריכה. השלב האחרון הוא ניתוח התוצאות וזיהוי אתרי הקישור בין החלבונים. מחקר זה סולל את הדרך לתכנון מעכבים רציונליים של קשירת CHFR עדיין, שהאינטראקציה הבלתי מבוקרת שלהם עלולה להוביל להתפתחות סרטן.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר אינטראקציה בין חלבונים, כגון מהם האזורים הספציפיים שעושים מדיטציה אינטראקציה בין שני חלבונים, חלקו את רצף חלבון המטרה ל-10 עד 20 שאריות פפטידים. זה חופף חלקית. כמות החפיפה יכולה להיות מגוונת, אך באופן עקרוני, ככל שהחפיפה ארוכה יותר, כך ייטב.בעת תכנון הפפטידים קחו בחשבון אלמנטים משניים ידועים בחלבון שיכולים להיות אחראים לאינטראקציה. ניתן להזמין את מערך הפפטידים המעוצב דרך ספקים מסחריים. עבור ניסוי זה, פפטידים משאריות תחום CHFR 4 24 עד 6 62 קשורים קוולנטית למערך דרך מסוף C.לאחר קבלת המערך המתוכנן, הכינו אותו לניסוי על ידי חסימתו תחילה כדי למנוע קשירה לא ספציפית. הכינו תמיסת חסימה של 2.5% משקל לנפח. אבקת חלב רזה בתמיסת tris buffer המכילה 0.05% Tween 20 או TBST למניעת קשירה לא ספציפית.טבלו את המערך בחמישה מיליליטר של תמיסת חסימה. דגרו את המערך במשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. שטפו תחילה את המערך עם חמישה מיליליטר של תמיסת חסימה למשך 30 שניות.לאחר מכן שטפו את המערך פעמיים עם חמישה מיליליטר TBST למשך חמש דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את המערך השטוף עם חמישה מיליליטר של תמיסת חלבון מתויגת פולי היסטידין המכילה 2.5% משקל לנפח. יש לערבב אבקת חלב רזה למניעת קשירה לא ספציפית.כאן משתמשים בתמיסה של 4.5 מיקרו-מולרית של שאריות חלבון דומם 500 עד שש 50. לאחר מכן דגרו את המערך בתמיסת החלבון למשך שלוש עד שמונה שעות בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה בתמיסת החלבון.שטפו את המערך עם חמישה מיליליטר TBST למשך 30 שניות על שייקר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות נוספות של חמש דקות. כעת דגרו את המערך השטוף עם חמישה מיליליטר של נוגדן מצומד פרוקסידאז צנון סוסים מדולל במאגר דגירה המכיל את אותם מרכיבים באותם ריכוזים כמו תמיסת החסימה למשך שעה אחת על שייקר בטמפרטורת החדר, הנוגדן יכול לקשור את חלבון המטרה או את התג, לבצע ניסויי בקרה, לבדוק את האינטראקציה של הנוגדן עם פפטידים במערך על ידי חזרה על אותו פרוטוקול במערך נפרד החלק מבלי לדגור עם החלבון לפני קריאת המערכים. שוטפים אותם כמו קודם עם חמישה מיליליטר TBST.בצע פיתוח כימילומינסנציה עם ערכת מצע משופרת של כימילומינסנציה מערבית. בצע את הזיהוי עם מנתח תמונה זוהר כגון מצלמת Fuji film LAS 3000. נתח את התוצאות, וודא ששני הכפילויות במערך מציגות את אותם אותות כדי שהתוצאות יהיו אמינות.אם המבנה של שותף החלבון ידוע, חפש במבנה את פפטידי הקישור וחפש את אתרי הקשירה. זכור שפפטידים שנמצאים רחוק ברצף יכולים להיות יחד במבנה השלישוני וליצור אתר קשירה. בדוגמה שלנו, עדיין חלבון סנטרו סומלי חשוב ביותר השולט בחלוקת תאים תקינה והתפשטות תאים עדיין מקיים אינטראקציה עם מספר חלבונים דרך האזור הלא מסודר מהותי שלו.באמצעות מערך הפפטידים המתוכנן, נחשפו אתרי הקישור שעדיין במדכא הגידול CHFR. כל נקודה שחורה במערך מייצגת פפטיד שמקורו ב-A-C-H-F-R שחייב עדיין לציין שכל פפטיד מופיע פעמיים מכיוון שהוא קיים בשכפול, מה שמאמת את אמינות התוצאות. סינון מערך הפפטידים חשף שבעה פפטידים שמקורם ב-CHFR שנקשרו לשאריות האזור שעדיין לא מסודרות באופן מהותי 500 עד 6 50.תוצאות אלה אפשרו לנו למפות את אתר הקישור של סטילס על CHFR. למרות המרחק של שבעת הפפטידים הללו ברצף הראשוני של CHFR. הם יוצרים אתר קשירה מוגדר היטב למבנה השלישוני של CHFR.שיטה זו ישימה לאפיון כל אינטראקציה עם חלבון בעקבות הליך זה. יש להשתמש בשיטות כמותיות כמו פלואורסצנטיות ואיזוטופ או ITC על מנת לאמת, לכמת את הכנסת הפפטיד.

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

סרטון זה מדגים טכניקה המיישמת טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי כדי לאפיין את הספציפיות של נוגדנים המזהים שינויים לאחר תרגום (PTM) על פפטידי היסטון. שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים מצומדים פלואורופורים משותקים עם שילובי PTM ידועים מטופלת בנוגדנים ספציפיים ל-PTM מטרה. תהליך זה מסייע לזהות את הספציפיות של הנוגדן למטרה ואת התגובתיות הצולבת הפוטנציאלית שלו עם PTM שאינם מטרה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למדו לזהות אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות מערכי פפטידים. הפרוטוקול ממפה אינטראקציות בין חלבון still לדומיין CHFR בסרטן ומסייע באיתור מטרות תרפויות חדשות.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

גלה סרטונים נוספים