טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף ולעבד דגימות מורכבות הקשורות למארח כגון כיח סיסטיק פיברוזיס, כדי לחקור את הקהילות הוויראליות והמיקרוביאליות באמצעות גישות מטגנומיות ומטא-טרנסקריפטומיות. זה מושג על ידי שאיפת הנבדק תמיסת מלח היפרטונית 7% באמצעות נבולייזר, ולאחר מכן איסוף דגימות ליחה מושרות לאורך פרק זמן של 30 דקות. לאחר מכן, הדגימה הומוגנית מיד ומופצת באופן שווה לארבעה צינורות המסומנים כמטגנום ויראלי, מטגנום מיקרוביאלי, מטא טרנסקריפטום וליחה נוספת.

לאחר מכן, צינור המטא טרנסקריפטום אטום, ממוקם אופקית והליחה הומוגנית במהירות בינונית למשך 10 דקות. לבסוף, אליקוטים בודדים מעובדים בנפרד כדי לבודד ולטהר תאים נגיפיים או חיידקיים לפני בידוד חומצות גרעין למחקרים מטגנומיים. בסופו של דבר, חומצות הגרעין המבודדות משמשות להכנת ספריית ריצוף תפוקה גבוהה ליצירת ספריות מטא-גנומיקה ומטא-טרנסקריפטומיקה.

היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא מספק זרימת עבודה מקיפה לעיבוד דגימה מורכבת הקשורה למארח לחקר קהילות נגיפיות וחיידקים ברמת ה-DNA וה-RNA. הדגמה חזותית של הליך זה היא קריטית מכיוון ששלבי הטיפול המקדים בדגימה חשובים כדי להבטיח טיפול נכון בדגימה בעוד שקשה ללמוד את שלבי טיהור התאים הוויראליים והמיקרוביאליים בשל המורכבות בהליך לפני איסוף הדגימה, סמן ארבע שפופרות של 15 מיליליטר לדגימה עם הדברים הבאים, הראשון עם מטגנום נגיפי, השני כמטגנום מיקרוביאלי מספר שלוש עם מטא טרנסקריפטום וצינור מספר ארבע ככיח נוסף. הוסף שני מיליליטר של חרוזי סיליקה של 0.1 מילימטר לתוך הצינור המסומן מטא טרנסקריפטום, ואחריו שישה מיליליטר של מאגר ליזה RNA מבוסס גיני איזותיוציאנט, או מאגר ליזה של GITC.

בהתאם להליך איסוף הדגימה המתואר בפרוטוקול הטקסט ובאמצעות כוסות דגימה מראש, העריכו את נפח הדגימה על ידי שקילת הכוס לאחר איסוף הדגימה והפחיתו את משקל הכוס הריקה. עבור המשקל הנותר, גרם אחד יהיה שווה ערך למיליליטר אחד של דגימה. אם נפח הדגימה קטן משמונה מיליליטר, הוסף את הנפח המתאים של 0.02 מיקרומטר מסונן XPBS אחד כדי להביא את הנפח הסופי לשמונה מיליליטר.

לאחר מכן השתמש מיד במזרק של שלושה מיליליטר כדי להומוגניזציה של הדגימה עד שלא יישארו גושים גלויים בתוך הליחה באמצעות אותו מזרק שאב מיד שני מיליליטר ליחה והזריק אותו לתוך צינור המיקרו טרנסקריפטום המכיל חרוזי סיליקה ומאגר ליזה GITC. סגור את המכסה והשתמש בסרט פרה כדי לאטום היטב את המכסה כדי למנוע דליפה, השתמש במערבולת, אדוני כדי להומוגניזציה מיידית של הליחה במהירות בינונית למשך 10 דקות. באמצעות אותו מזרק, שני מיליליטר ליחה כל אחד לתוך הצינורות המסומנים מטגנום וירה ומטגנום מיקרוביאלי, ומעבירים את הליחה הנותרת מכוס הליחה לצינור המסומן כיח נוסף.

אחסן את כל הצינורות בארבע מעלות צלזיוס או על קרח והובל למעבדה במידת הצורך כדי ליצור מטגנום ויראלי. לאחר הכנת מאגרים ותמיסות. טפל בדגימות מראש על ידי הוספת מאגר מגנזיום מלוח מסונן של 0.02 מיקרומטר לנפח כולל של שישה מיליליטר.

כדי לסייע בהמסת ריר, הוסף שישה מיליליטר של 6.5 מילי-מולרי של DTT לכל דגימה. מערבולת נמרצת לערבב ולדגור במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מערבולת נמרצת, הדגימות מסתובבות שוב ב-3056 Gs ו-10 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות.

אספו כל סופרנטנט לתוך שפופרת חדשה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש במסנן נקודתי של 45 מיקרומטר המותקן על מזרק כדי לסנן את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 15 מיליליטר. הסר 100 מיקרוליטר של דגימה לתוך צינור מיקרו פוגה ולאחר מכן בצע טיפול בכלורופורם.

חלץ את הסופרנטנט ובצע טיפול DN one. הוסף נפח שווה של 4%para של פורמלדהיד כדי לתקן את הדגימה. למיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי, עיין בפרוטוקול הטקסט לגישת העשרת חלקיקים נגיפיים.

אחרת, באמצעות תמיסות צזיום כלוריד טריות, הגדר שיפוע צזיום כלוריד על ידי העמסת מיליליטר אחד של 1.7 גרם למיליליטר של תמיסת צזיום כלוריד לכל צינור, ואחריו מיליליטר אחד של 1.5 גרם למיליליטר, מיליליטר אחד של נקודה 35 גרם למיליליטר, ולבסוף, מיליליטר אחד של 1.2 גרם למיליליטר של תמיסת צזיום כלוריד. לבסוף, טען שישה עד שמונה מיליליטר של דגימה לצינורות שיפוע בודדים. סמן שכבות בודדות כדי לציין את המיקום של כל שבר.

לאחר מכן אזנו כל זוג שניים מנוגדים לטווח של מיליגרם אחד. נעל בזהירות כל צינור בדלי הסיבוב. העמיסו על הרוטור והצנטריפוגה בטמפרטורה של 82, 844 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינורות מהמחזיק מבלי לשבש את שיפועי הצפיפות בעזרת מחט בגודל 18 המחוברת למזרק של שלושה מיליליטר. ודא שהקצה הפתוח של המחט פונה כלפי מעלה. חודרים את הצינור ממש מתחת לשכבת הצפיפות של 1.5 גרם למיליליטר ושואבים לאט כ-1.5 מיליליטר תמיסה לתוך המזרק.

הסר לאט את המחט ואפשר לשבר הנותר בצינור לטפטף לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר דרך הפנצ'ר. סמן זאת כמותניים שבר עליון העבר את התמיסה במזרק המכיל את ה-V ps לשני צינורות מיקרו פוגה חדשים. לאחר הכנת מאגרים ותמיסות, על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף חמישה נפחים של נקודה 22 מיקרומטר מסוננת XPBS אחד כדי לדלל כל הומוגנט מתחת למכסה המנוע הכימי, הוסף אתנול בטא MAR capta לנפח של 2% לריכוז הסופי של הנפח, ונדנד את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לאחר הדגירה.

סובב את הדגימה ב-3056 GS ו-10 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש ב-10 מיליליטר מים בדרגה מולקולרית כדי להשעות מחדש את הגלולה ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני שתחזור על הכביסה. לאחר סיבוב אחרון, ולאחר השלכת ה-SUP natin, השתמש בחמישה מיליליטר של מאגר XDNA אחד כדי להשעות מחדש את הגלולה לפני הוספת 15 מיקרוליטר של ds.

אחד למיליליטר של דגימה דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב חוזר במשך שעתיים. לאחר סיבוב הדגימות והשלכת החטיף, השתמש ב-10 מיליליטר של מאגר SE כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר מכן סובב את הדגימה וחזור על הכביסה.

השתמש בשני מיליליטר של מאגר SE כדי להשעות מחדש את הגלולה ולהעביר את המתלה לשני צינורות מיקרו פוגה. לאחר מכן סובב את הצינורות ב -16, 000 GS בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לבסוף, לאחר הסרת הסופרנטנט, השתמשו בערכת מיצוי דנ"א גנומית בהתאם להוראות עבור חיידקים גראם-חיוביים.

כדי לבודד את ה-DNA, תוצאות קודמות ליצירת מטאגנומים ויראליים מסוכמות כאן. הווירומים מכילים מעט רצפים שמקורם בבני אדם, כאשר רק דגימה אחת המכילה 70% דגימת DNA אנושית CCF 4 A הושמטה משלב האולטרה-צנטריפוגה של שיפוע הצפיפות, וכתוצאה מכך, היא הכילה יותר מ-97% רצפים שמקורם בבני אדם. איור זה מציג תמונה פלואורסצנטית של דגימת כיח CF טיפוסית לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.

vlp ברור נצפה בהיעדר חלקיקים גדולים בעקבות הפרדת שיפוע הצפיפות הנראית כאן. שבע דגימות ליחה יומיות נאספו מחולה סיסטיק פיברוזיס יחיד שהתחיל אנטיביוטיקה דרך הפה. לאחר היום השלישי של האיסוף, התשואה הכוללת של ליזה היפוטונית, או HL DNA שנאסף מכל דגימה, נעה בין 210 ננוגרם ליותר מחמישה מיקרוגרם מספריות ריצוף Illumina שנוצרו עבור כל דגימה.

כל הספריות מלבד אחת הניבה יותר ממיליון רצפים ויותר מ-85% רצפים באיכות גבוהה נשמרו בעיבוד מקדים של נתונים. באמצעות תוכנת הדפסה, הכמות הכוללת של רצפים שמקורם בבני אדם נעה בין 14% ל-46%כפי שמוצג כאן, הפרופילים המיקרוביאליים של תת-הדגימות דומים מאוד לדגימות לאחר שני טיפולי ליזה היפוטוניים. בנוסף, הליזיס ההיפוטוני השני מגדיל את חלק הרצפים הלא אנושיים בשישה עד 17% בתוך המטאגנומים.

אל תשכח שעבודה עם דגימות קליניות ופתוגנים פוטנציאליים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש להשתמש תמיד בציוד מגן אישי בכל עת במהלך הטיפול בדגימה. נדרשות טכניקות טובות של ביולוגיה מולקולרית ומיקרוביולוגיה בעת ביצוע הליך זה כדי להבטיח שלא יהיה זיהום.

לאחר הליך זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע מטגנומיה נגיפית ומיקרוביאלית, כמו גם מחקרים מטא-טרנסקריפטומיים מדגימות מורכבות כגון כיח CF.