Name: טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: למדו שיטה מקיפה לעיבוד דגימות ריר מורכבות מחולי סיסטיק פיברוזיס לצורך חקר קהילות ויראליות ומיקרוביאליות באמצעות גישות מטגנומיות ומטטרנסקריפטומיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (1 R01 GM095384-01) הוענק ליער Rohwer. אנו מודים Epicentre, חברת Illumina למתן גישה מוקדמת לערכות Ribo-אפס לאפידמיולוגיה. אנו מודים למארק Hatay לעיצוב והייצור של בעל צינור ultracentrifugation. אנו מודים אנדריאס האס ובנימין נואלס לקריאה ודיונים של כתב היד קריטיים, ולורן פול לסיוע לתהליך הצילום.

למחברים אין מה לחשוף.

Metagenomics ויראלי חלקיקים נגיפיים מרוכזים באמצעות פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) או ריכוז נפח קטן. במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך בריכוז, אבל מראש סינון או צעדי צנטריפוגה במהירות נמוכים משמשים להסרת תאים האיקריוטים וחיידקים. lysates ויראלי יהיה מועשר יותר ומטוהר באמצעות ultracentrifugation צפיפות שיפוע 9,41 או מסנני גודל קטנים (למשל, 0.45 מיקרומטר) להסרת תאי חיידקים האיקריוטים וגדולים 25. ultracentrifugation שיפוע צפיפות מבוצע בדרך כלל עם פתרונות צפופים אבל אינרטי כגון כלוריד סוכרוז או צזיום לבודד ולהתרכז חלקיקים נגיפיים 41. הפרדה פיזית מבוססת על הגודל וצפיפות קלילה של חלקיקים נגיפיים. לכן, בחירה נכונה של גודל נקבובית מסנן וההכנה הקפדנית של מילויים הן חיוניים לבודד את הקהילות נגיפיות ספציפיות, כמו ההצלחה של ההתאוששות הפיסית שלVLPs קובע את הקהילה מבודדת 41 (כלומר, חלקיקים נגיפיים שאינו עוברים דרך המסנן או נפילה בתוך צפיפות החילוץ לא יזוהה בmetagenome). לאחר בידוד וריכוז נגיפיים, ייתכנו זיהום נוכחי חומר הגנומי שאינו נגיפי במדגם הן בצורה של חומצות גרעין וחופשיות של חיידקים ותאים האיקריוטים. לכן, זה קריטי כדי לוודא את טוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות (איורים 1 א ו -1 B). טיפול כלורופורם משמש בדרך כלל לlyse תאים הנותרים, ואחריו טיפול nuclease להשפיל חומצות גרעין חופשיות לפני מיצוי חומצות גרעין. אזהרה לעבודה שהוצגה הייתה השימוש בהפרדת שיפוע צפיפות לבודד חלקיקים נגיפיים כפי שהוא עשוי לכלול חלקיקים נגיפיים עטפו שעשויה להיות קליל מדי כדי להזין את שיפוע CsCl. חלופי &quot;לתפוס את כל-&quot; השיטה היא להשמיט separ שיפוע הצפיפותation ולבודד את ה- DNA הקהילה מ0.45 מיקרומטר - filtrates טופל בכלורופורם וDNase I. גישה זו היא גם מתאים כדי להתאים כרכי מדגם קטנים כמו אלה ממטליות או פלזמה דם. עם זאת, זה עלול לגרום לזיהום חיידקי כלורופורם עמיד וכמות גבוהה יותר של DNA תאי DNase I-עמיד. פרוטוקולי רצף הנוכחיים דורשים 1 ng עד 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין להכנת ספריית רצף לפי תשואות DNA גבוהות יותר לספק מבחר רחב יותר של אפשרויות סידור. ריכוז ה- DNA של viromes נוצר לעתים קרובות נע בין מתחת לסף הגילוי ליותר מ -200 ng / μl. הסכום של חומצות גרעין נגיפיות התאוששו עשוי להיות מספיק להכנת ספריית רצף ישירה. במקרים כאלה, הגברה חומצות גרעין היא חיונית. ספריות הגברה רובה לינקר (LASLs) 2,42,43 והגברת הגנום כולו מבוססת על הגברה עקירה מרובה (מד&quot;א) הן שנישיטות נפוצות ביותר ליצירת DNA מספיק עבור סידור. שיטות מד&quot;א כגון אלה המבוססים על DNA פולימרז Phi29 ידועות סובלות מהטיות הגברה, ואולי מעדיפים להגביר ssDNA וDNA המעגלי, וכתוצאה מכך המיון שונה שאינו כמותיים ואפיון פונקציונלי 44,45. גרסה מותאמת של גישת LASLs הוכח להציג רק הטיות מינימליות, מקדמת רגישות גבוהה יותר (לכמויות קטנות של חומר מוצא), והוא מותאם בקלות לפלטפורמות שונות רצף 43. עם זאת, יש לו את הגישה שלבים רבים, דורשת ציוד מיוחד כדי להקטין את איבוד DNA, ומוגבל לתבניות dsDNA. במעבדה שלנו, גישה זו הותאמה בהצלחה להגברת כמות לזיהוי וגילוי של DNA שחולץ מlavage- רונכואלוואולרית, VLPs coral- וים-נגזרים המים (לא פורסם והורביץ et al. 46). יש לפתח צינורות ניתוח נתונים CLAssically היה אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של ניתוח metagenomics הנגיפי בשל האופי המגוון מאוד וידוע ברובם של קהילות ויראלי. אמנם יש 10 8 גנוטיפים מוערכים נגיפיים בביוספרה, למאגרי מידע נגיפיים הנוכחיים תאריך להכיל ~ 4,000 הגנום נגיפי, שזה בערך 1 / 100,000 של גיוון נגיפי כולל משוער זה. לכן, חיפושים מבוססי דמיון (כגון תפציץ 47) למשימה הטקסונומי ופונקציונלית בmetagenomes הנגיפי יש אתגרים הגלומים. רצפים רבים נכשלים יש קווי דמיון משמעותיים לגנומים באתר, ולכן, מסווגים כידועים. למרות חיפושים מבוססי הומולוגיה הם היישומים החשובים ביותר לצורך קביעת טקסונומיה ולתפקד רצף נתונים, גישות חלופיות המבוססות על ניתוח של מסדי נתונים עצמאיים פותחו -48 50. Fancello et al. 51 מספקים סקירה של כלים חישוביים ואלגוריתמים המשמשים בVira מלאהmetagenomics l. החיידקים metagenomics בדרך כלל, את הסכום הכולל של ה- DNA שחולץ מקהילות hypotonic טופל תמוגה חיידקים (HL-DNA) נע בין 20 ng עד 5 מיקרוגרם. התשואה תלויה מאוד במצב בריאותו של המטופל ואת כמות מדגם ליחה שנאסף, מה שמסביר את השינויים ראו בתשואה הכוללת של HL-DNA שחולץ במחקר זה (טבלה 2). השלבים הקריטיים כדי להפיק נתונים רצף איכות טובה להסתמך על האיכות של ספריות רצף שנוצרו. איור 2 מציג מגוון גודל אופייני לספריות רצף שנוצרו מה- DNA של חיידקים שמקורם בכיח CF באמצעות הליך פיצול ה- DNA מבוסס האנזימטית. גודל הספרייה האופטימלי תלוי בבחירה של פלטפורמת רצף ויישום, ולכן, יכול להיות מותאם הליך הפיצול, במידת צורך, דרך גישות חלופיות כגון sonication ועִרפּוּל. בנוסף לתוצאות הנציג הציגו, ההצלחה של השיטה המוצגת בכיח CF שנאסף מחולים מרובים על פני נקודות זמן מרובות היא גם מאוירת באל Lim et. (2012) 9 וLim et al. (2014) 10. מחקרים קודמים 9,10 מציעים שכל חולה מטפח קבוצה ייחודית של קהילת חיידקים שעוברת לאורך זמן, ובכך משקף את ההתמדה של השחקנים המרכזיים בקהילה תוך תנודות צפויות עקב הפרעות כגון טיפולים אנטיביוטיים. אם תנודות אלה מתרחשות מדי יום גם ללא הפרעות חיצוניות או בשל שיטת דגימה ועיבוד מדגם, עדיין בשאלה. בהתבסס על metagenomic HL-DNA וניתוח amplicon 16S rDNA, דגימת אורך 7 הימים מראה כי התנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיות (יום 1, 2, ו -3) היה מינימאלי (איורים 3 א ו 3 ב &#39;). על introduction של אנטיביוטיקה דרך הפה מייד לאחר דגימת יום 3, שינויים בפרופיל הקהילה התבררו ביום 4. בעוד ציפרופלוקסצין האנטיביוטיקה מיועד למגוון רחב של חיידקים פתוגנים ידועים כגון P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, ודלקת ריאות Streptococcus, הטיפול הגדילו את השפע היחסי של P. aeruginosa תוך הפחתת spp Streptococcus. ופ melaninogenica. לפי יום 6, הקהילה התאוששה לאט למבנה קהילת המוצא הראשוני. התוצאות מצביעות על כך שתנודות של פרופילים של חיידקים בתוך מטופל אחד יש סיכוי גבוה יותר בשל הפרעות קהילה בדרכי הנשימה. בהתחשב בעקביות בין פרופילי חיידקים של ספריות 16S rDNA וmetagenomes מDNA נגזר HL, שללנו ההטיות שמקורן בפריימרים 16S rRNA שימשו במחקר זה. הסבר אפשרי אחד להבדלים לראות פני הטקסונומית 16S rDNAפרופילי אל שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL (איור 3) עשויים להיות הנוכחות של כמויות גבוהות של spp Pseudomonas. DNA תאי לאחר הטיפול האנטיביוטי. זו נתמכת על ידי הממצאים שההבדלים אלה היו בולטים ביותר ביום 7, שלושה ימים לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, אשר מטרות spp Pseudomonas. בנוסף לאחרים. ציפרופלוקסצין משמש בדרך כלל כטיפול הקו הראשון בחולים עם CF ופ הכרוני זיהום aeruginosa למרות שהספקטרום של פעילותה כולל את רוב פתוגנים הקשורים CF. חוקרים שערנו כי הטיפול האנטיביוטי מבטל קהילות רגישות כולל spp Streptococcus. ולכן יצירת נישה מולא על ידי פ &#39;עמיד aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa עשוי להרוויח התנגדות באמצעות הגדלת קהילות biofilm וDNA תאי הוכח להיות התמיכה המבנית העיקרית של אדריכלות biofilm 52. אפילו כtהוא מבנה הקהילה התאושש, DNA תאי אולי נשאר בכיח CF. לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שתמוגה hypotonic ושלבי הכביסה שהוצגו בעבודה זו עשויה להיות תועלת בכך שלא להסיר את ה- DNA המופק רק בני האדם, אבל DNA תאי גם הנגזרות של חיידקים שעלולות לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל. Metatranscriptomics איכות גבוהה metatranscriptome צריכה להכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA) ומייצגת דגימה משוחדת של תמלילי הקהילה (mRNA). בשל זמן מחצית החיים קצרים וכמות מוגבלת של mRNA, זה קריטי, כי הפרוטוקול, כפי שהוצג כאן, ממזער טיפול מדגם כדי למקסם את המספר של תמלילים התאוששו. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. אלה כוללים MICROB להעשיר, Ribo-אפס, ומדגם ספציפי h תוסףybridizations 53 המבוססים על הכלאת oligonucleotide, וmRNA בלבד הערכה המבוססת על RNA מיקוד הפעילות האנזימטית exonuclease מכיל monophosphate 5 &#39;. בנוסף, מספר גישות למוספים לmRNA כגון ערכת II-החיידקים MessageAmp שמעדיף polyadenylates ומגביר RNA ליניארי זמינות גם. חלק מהשיטות הללו (למשל, mRNA בלבד, Xpress MICROB E וMessageAmp) משמש במקביל ליעילות אופטימלית. עם זאת, היעילות של כל הגישות הללו מוגבלות, במיוחד כשעובדים עם rRNA המושפל באופן חלקי, כפי שנצפה לעתים קרובות בסך RNA שחולץ מן דגימות CF. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בם כדי ליצור metatranscriptomes מורכב משני mRNA אוקריוטים ופרוקריוטים. בנוסף, פולי הזנב () הוסיף לרצפים רשאי מפחית את כמות נתוני רצף שימושיים. אזורים עם מתיחות homopolymer נוטים לקבל ציוני איכות נמוכות יותר, גausing מספר משמעותי של קורא ליסונן על ידי רצף ותוכנה שלאחר רצף-, ואורך הקריאה השימושי הממוצע לאחר זמירה מפולי זנבות () יקטנו באופן משמעותי 54. התמודדות עם קהילות מורכבות של חיידקים CF ו- RNA המושפל באופן חלקי (איורים 4 א ו4C), המחקר הקודם שלנו הראה כי שיטת הכלאה-ידי לכידת ערכת זהב Ribo-Zero הייתה יותר יעילה בהסרת שני rRNA האדם וחיידקים בהשוואה לטיפולים משלבים שימוש ב ערכות אחרות 9 (לוח 3). נתונים כתוצאה מאפשר ניתוח מקביל של שני מארח אנושי ותמלילים של חיידקים. בהתאם לתפוקה והאיכות של RNA, כמו גם בחירה אולטימטיבית של פלטפורמת רצף, רב של תהליכים אלה כוללים את צעד סינתזת cDNA יכול להיות יעיל עם דור ספריית רצף. לדוגמא, RNA טופל Ribo-אפס יכול לשמש להכנת libra רצף metatranscriptomeריס באמצעות ערכת ScriptSeq RNA-Seq ספריית הכנה. ניתוח metagenomic של הקהילות הקשורים לבעלי חיים מספק ייצוג מקיף של הישות התפקודית הכוללת הכוללת את המארח והקהילות הקשורים אליו. העבודה שהוצגה כאן היא להתאמה למגוון של דוגמאות הקשורים לבעלי חיים מורכבים, במיוחד אלה המכילים ריר סמיך, כמויות גבוהות של פסולת תא, DNA תאי, חלבון ומתחמי גליקופרוטאין, כמו גם תאי מארח בנוסף לחיידקים ויראליים והרצויים חלקיקים. למרות שחלקיקים נגיפיים וחיידקים עלולים ללכת לאיבוד בכל שלב, חלקיקי בידוד וטיהור חיוניים כדי למזער את כמות ה- DNA מארח. בעוד נתוני metagenomics מספק פוטנציאל המטבולי של הקהילות שנבדקו, metatranscriptomics להשלים זאת על ידי חושף את ביטוי ההפרש של פונקציות מקודדות 9. הערכה מקיפה של נתונים גנומיקה ותמלילים הניבה תוספות חדשותights לדינמיקה של אינטראקציה קהילתית ומקל על פיתוח טיפולים לשיפור 9,10,55.

<html> קהילות ויראלי וחיידקים הקשורים לגוף האדם נחקרו בהרחבה בעשור האחרון באמצעות היישום של טכנולוגיות רצף 1,2. התוצאות הובילו להכרה בחשיבות החיידקים בבריאות ומחלות של בני אדם. היוזמה העיקרית הגיעה מהפרויקט האנושי Microbiome המתאר את החיידקים (וגם כמה חיידקים קדומים) המתגורר בעור אדם, ובתוך חלל פה, דרכי הנשימה, בדרכי מין ושתן, ומערכת עיכול 3. מחקרי Microbiome נוספים של דרכי הנשימה של אדם בריא באמצעות שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) 4,5 ומטליות אף ולוע 4 הראו כי הריאות יכולות לשמש כמכשיר דגימה סביבתי, תוצאות בקולוניזציה של חיידקים חולפים בדרך הנשימה. עם זאת, ההשפעה של קולוניזציה חיידקים במשטחים בדרכי נשימה לקויה יכולה לגרום לזיהומי ריאות חמורים וכרוניים, כגון אלה שראו בסיסטיק פיברוזיס (CF) מטופלים. t &quot;&gt; CF הוא מחלה גנטית קטלנית הנגרמת על ידי המוטציה בסיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור (CFTR) גן 6. מוטציות אלה להצמיח חלבוני CFTR פגומים שבתורו משפיע על הובלת יון transepithelial פני משטח הפסגה של האפיתל. המחלה פוגעת מספר רב של מערכות איברים, אבל הרוב המכריע של תמותה ותחלואה מיוחסת למחלת ריאות CF 7. CF הריאות מספקת מערכת אקולוגית ייחודית להתיישבות חיידקים. הפגם בהובלת יון גורם ריר לבנות בדרכי נשימת CF, יצירת מייקרו-הסביבות מורכבות של אירובי , Microaerophilic, ותאים אנאירוביים מעוגנים על ידי משטח הרירי עשירים בחומרים מזין סטטי. סביבה זו מאפשרת התישבות ושגשוגם של חיידקים, כולל, חיידקים, ופטריות נגיפיות. אקוטי וזיהומי חיידקי ריאה כרוניים להוביל לתגובות חיסוניים קבועות, אבל לא אפקטיביות, וכתוצאה מכך שיפוץ נרחב בדרכי נשימה, אובדן כושר ריאות, ובסופו pulmoכישלון nary. קהילות חיידקים הקשורים לריאות CF תוארו גם באמצעות שני גישות תלויות התרבות ותרבות העצמאית, הכוללים שימוש ב16S RNA ריבוזומלי (rRNA) רצף של גנים 8 וmetagenomics רובה 9,10. הגישה מבוססת-rRNA 16S היא מסוגלת לאפיין מגוון רחב של מינים של חיידקים וללכוד משמרות רחבות במגוון קהילה. עם זאת, הוא מוגבל בהחלטתה בהגדרת הקהילות (מסוכם בClaesson et al. 2010 11) והתחזיות של פוטנציאלי חילוף חומרים מוגבלות לפונקציות הכלליות אלה ידועים למינים שזוהו. לכן, שיטות לקביעת רצף גן 16S rRNA אינן מספיקות לדיוק האנליטי הטקסונומי ופונקציונלי ההכרחי של קהילות חיידקים השונות הנמצאות בריאות CF. גישת metagenomic המתוארת כאן משלימה את הגישה מבוססת-rRNA 16S, מתגברת על המגבלות שלו, ומאפשרת דרך יעילה יחסיתכדי לנתח את שתי טקסונומיה קהילת חיידקים ותוכן גנטי בריאות CF. DNA של חיידקים שבודדו מהדגימות הקשורים לבעלי חיים לעתים קרובות מכיל כמות גדולה של DNA מארח. דגימות כיח או רקמת הריאה CF מכילות בדרך כלל כמות גדולה של DNA האנושי שפורסמה על ידי נויטרופילים בתגובה החיסונית, לעתים קרובות יותר מ- 99% של ה- DNA הכולל 12 - 14. למרות שחלק מתאים אנושיים שלמים יכולים להיות נוכחים, רוב ה- DNA הזה הוא חופשי בפתרון או את הספיחה של חיידקים. בנוסף, הנוכחות של תקעים צמיגים במיוחד ריר, סלולרית פסולת ומזהמים ידועים אחרים לסבך עוד יותר את הבידוד של תאי חיידקים. כמה שיטות נבדקו למדלדלות דגימות אלה של ה- DNA האנושי, כוללים שיפועי Percoll לאדם נפרד מתאי חיידקים 15, הטיפול בDNase אני, ethidium ברומיד monoazide להשפיל DNA האנושי 16, וערכת MolYsis, כל עם הצלחה מוגבלת באופן סלקטיבי.<html> עד כה הליך טיהור DNA של חיידקים היעילים ביותר לליחת CF כבר שינוי של התהליך שתואר על ידי Breitenstein et al. (1995) 17. גישה זו, במסמך הידוע בשם שיטת hypotonic תמוגה (HL), משתמשת בשילוב של β-mercaptoethanol כדי להפחית אג&quot;ח mucin דיסולפיד, תמוגה hypotonic של תאים האיקריוטים, ואני DNase טיפול בDNA המסיס 9. למרות חוסר חלופות שיטת HL העלתה חששות בשל (i) הטיות אפשריות הנובעות מתמוגה לא רצויה של חיידקים ו( ii) אם התנודות שנצפו בהרכב קהילת 9,10 הם תוצר של תנודות הקשורות לעיבוד המדגם. בנוסף לדור של metagenomes רובה, אנו לטפל בבעיות אלה על ידי השוואת הפרופילים גנטי 16S rRNA של DNA הכולל וDNA של חיידקים שחולץ מן שיטת HL באמצעות אותה הקבוצה של דגימות כיח שנאספו ממטופל אחד על פני שבעה ימים רצופים. אף אוזן גרון &quot;&gt; בהשוואה לקהילות חיידקים, האפיון של קהילות נגיפיות הקשורים לבעלי חיים הוא מוגבל 18,19 קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF יש רק מאופיינות מינימאלית 20 -.. 22 המחקר metagenomic הראשון המאפיין את ה- DNA של קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF הראה כי רוב הווירוסים הקשורים לריאות CF הם פאגים 20. הפוטנציאל המטבולי של הפאג בCF ויחידים שאינם CF היה שונה באופן משמעותי. באופן ספציפי, קהילות הפאג באנשי CF נשאו גנים רעיוני של עיבודי מארח חיידקים לפיסיולוגיה של דרכי הנשימה CF, ומחקרי חיידקי ארסיות 20. לאחר metagenomic של וירוסים ברקמת הריאה CF הפגינו ההטרוגניות המרחבית שונה של קהילות נגיפיות בין אזורים אנטומיים 22. בנוסף, רקמת הריאה CF טיפחה את המגוון הנגיפי הנמוך ביותר שנצפה עד כה בכל מערכת אקולוגית 22. רוב הווירוסים שזוהו היו פאגיםעם הפוטנציאל להדביק פתוגנים CF. עם זאת, וירוסים האיקריוטים כגון herpesviruses, אדנו-וירוסים, ווירוסי הפפילומה אנושיים (HPV) היו גם זוהו. באירוע אחד, שבו ציסטות ברקמת הריאה נצפו במהלך נתיחה, יותר מ 99% מהגנום וירוס הפפילומה אנושי היה התאושש, למרות שהמטופל מעולם לא אובחן עם הפפילומה או קרצינומה של ריאות. זה מצביע על כך הווה הגיוון הנגיפי משקף לא רק את חומרת נזק לרקמות, אלא גם עלול לחשוף ולהסביר מחלה uncharacterized בסיסית. הפרוטוקולים שתוארו כאן מספקים דרך פשוטה, אך רבת עוצמה לבודד את חלקיקים נגיפיים דמוי (VLPs) מדגימות שמורכבות מכמויות גדולות של ריר סמיך, מארח ותאי חיידקים, DNA החופשי, כמו גם פסולת תא. משלים metagenomics, metatranscriptomics משמש כדי לפקח על הדינמיקה בביטוי גנים ברחבי קהילת החיידקים והמארח 9,23. במקרה זה, שני חיידקים והוזt mRNA צריך להיבחר באופן מועדף. מאז mRNAs חיידקים אינם polyadenylated, לא ניתן לנצל שיטה נפתחת mRNA מבוסס אוליגו-DT. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בדגימות הקשורים מארח אם הדגימות ידועות מכילות כמויות גדולות של mRNA אוקריוטים. דוגמאות רבות הקשורים בבעלי חיים, כוללים ליחה CF, מכילות צפיפות גבוהה של תאים בנוסף לסכומים גבוהים של פסולת הסלולר וnucleases הכוללים RNases. לכן, עוד משימה מאתגרת היא למנוע השפלה RNA נרחבת במהלך metatranscriptome עיבוד. ברוב המקרים, רנ&quot;א הכל חולץ מליחת CF הוא מושפל באופן חלקי, המגביל את היישומים ושירות במורד הזרם של RNA נגזר. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. היעילות של גישות אלה עם זאת מוגבל, במיוחד כשעובדים עם אופן חלקי מושפל 9,24 rRNA. השיטות המועסקות כאן לאפשרed לאחזור של רנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי המתאים להסרה מוחלטת rRNA במורד הזרם יעיל. השוואה ישירה של היעילות בהסרת rRNA מרנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי השוואת שתי ערכות שונות שהומחש על ידי אל Lim et. (2012) 9. בסך הכל, המטרה של כתב היד הזה היא לספק סט שלם של פרוטוקולים (איור 1) כדי ליצור metagenomes רובה נגיפי וחיידקים, וmetatranscriptome, ממדגם הקשורים לבעלי חיים יחיד, תוך שימוש במדגם ליחה נגרם כדוגמא. עבודה מעבדה מולקולרית צריכה לכלול אזורים נפרדים הגברה לפני ואחרי כדי למזער את הזיהום צולב. השיטות להתאמה בקלות לסוגי מדגם אחרים, כגון רקמה 22, אף ולוע ומטליות לוע תחתונים 25, שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ואלמוגים (נתונים שלא פורסמו). כל דגימה צריכה להיות מעובד מייד עם אוסף במיוחד כאשר metagenomics חיידקים ונפגשהמחקרי atranscriptomics הם רצויים. אם הדגימות הוקפאו, הוא מגביל את הבידוד של תאי חיידקים שלמים לmetagenomes חיידקים כהקפאת פוטנציאל לשבש את שלמות התא. עם זאת, הקפאה אינה מונעת metatranscriptomics ובידוד נגיפי, אבל איכות של RNA וכמות חלקיקים נגיפיים התאוששו עשויה להיות מושפע בתהליך ההפשרה הקפאה. חשוב לציין כי ליחה מושרה שימשה כמקור העיקרי של דגימות במחקרים רבים הקשורים לחולי CF מבוגרים ומחלות ריאה כרוניות אחרות 26,27 כBAL יכול להיות פולשני מדי. במחקרים שלנו, דגימות כיח נאספו עם שיטה זהירה ועקבית דגימה, כלומר, מי פה הבא ושטיפה של חלל הפה באמצעות תמיסת מלח סטרילית כדי לשמור על זיהום חיידקים אוראליים בתוך דגימות הליחה למינימום.

<table><tbody><tr><td>מאגר ליזה RNA מבוסס גואנידין איזותיוציאנט</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent שימש במחקר זה</td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה; 0.1 עד 0.15 מ"מ</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>חרוזי זירקוניה-סיליקט שימשו במחקר זה</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, דרגה מולקולרית (אבקה יבשה)</td> <td>Promega</td><td>V3155</td><td>ניתן לרכוש מכל חברה אחרת</td></tr><tr><td>פילטר מזרק סטרילי; 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות קרום PVDF הידרופילי</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I אנזים&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק סטרילי; 0.02 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>קוטר: 25 מ"מ</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד</td><td>בקמן</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12; ב. (14 x 90 מ"מ), מתאים לרוטור SW41 Ti ואולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>SW41 Ti רוטור</td><td>בקמן</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 רוטור זווית קבועה</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA פולימראז</td><td>מונסראט ביוטק</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>נקנה בעבר מ- Fidelity Systems</td></tr><tr><td>מסנן מטריצת אלומינה עם טבעת תמיכה בפוליפרופילן טבעתי; 0.02 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>ממברנות מסנן Whatman Anodisc שימשו במחקר זה; קוטר 25 מ"מ</td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהב</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase ללא RNase I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>ניתן לרכוש מכל חברה אחרת</td></tr><tr><td>גליקוגן, דרגת RNA</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>ניתן לרכוש מכל חברה אחרת</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה מהירים של אוק רידג'</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>להליך מיצוי DNA בנפח גדול, מתאים לרוטור SS-34 בזווית קבועה</td></tr><tr><td>ערכת הסרת rRNA כוללת</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ניתן להשתמש בערכת זהב מלאה של ScriptSeq (אפידמיולוגיה) כדי לשלב הסרת rRNA עם הכנת ספריית ריצוף</td></tr><tr><td>צזיום כלוריד&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>הקסאדציטרימתיל-אמוניום ברומיד (CTAB)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור הלא טהור: metagenomes הרצף וmetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

הנגישות של רצף תפוקה גבוהה יש מהפכה בתחומים רבים של ביולוגיה. על מנת להבין טוב יותר קהילות נגיפיות וחיידקים הקשורים מארח, עבודה מקיפה להפקת DNA ו- RNA פותחה. העבודה במקביל יוצרת metagenomes נגיפי וחיידקים, כמו גם metatranscriptomes, ממדגם יחיד עבור סידור הדור הבא. הצימוד של גישות אלה מספק סקירה של שני מאפייני המיון השונים ופונקציות הקהילה מקודדת. שיטות שהוצגו להשתמש סיסטיק פיברוזיס ליחה (CF), סוג מדגם בעייתי, משום שהוא צמיג במיוחד ומכיל כמות גבוהה של mucins, DNA נויטרופילים חופשי, ומזהמים אחרים לא ידועים. הפרוטוקולים שתוארו כאן למקד את הבעיות הללו והצלחה לשחזר DNA הנגיפי וחיידקים עם זיהום הדנ&quot;א אנושי מינימאלי. כדי להשלים את לימודי metagenomics, פרוטוקול metatranscriptomics היה מותאם להתאושש שני החיידקיםוmRNA מארח המכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA). סקירה של מאפייני הנתונים מוצגת ללשמש כנקודת התייחסות להערכת ההצלחה של השיטות. דגימות כיח CF נוספות גם נאספו ל( i) להעריך את העקביות של פרופילי Microbiome על פני שבעה ימים רצופים בתוך מטופל בודד, וכן (ii) להשוות את העקביות של גישת metagenomic לסידור המבוסס על גן 16S RNA ריבוזומלי. התוצאות הראו כי תנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיקה היו מינימליות ופרופילי טקסונומיה של החיידקים הקשורים CF הנפוצים היו דומים מאוד בין ספריות 16S rDNA וmetagenomes שנוצרו מDNA תמוגה hypotonic (HL) -derived. עם זאת, ההבדלים בין פרופילי מיון שונים 16S rDNA שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL מציעים שתמוגה hypotonic והצעדים הכביסה ליהנות בלא הסרת DNA האדם נגזר בלבד, אלא גם של חיידקים שמקורם בextracellulDNA ar שעלול לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל.

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף ולעבד דגימות מורכבות הקשורות למארח כגון כיח סיסטיק פיברוזיס, כדי לחקור את הקהילות הוויראליות והמיקרוביאליות באמצעות גישות מטגנומיות ומטא-טרנסקריפטומיות. זה מושג על ידי שאיפת הנבדק תמיסת מלח היפרטונית 7% באמצעות נבולייזר, ולאחר מכן איסוף דגימות ליחה מושרות לאורך פרק זמן של 30 דקות. לאחר מכן, הדגימה הומוגנית מיד ומופצת באופן שווה לארבעה צינורות המסומנים כמטגנום ויראלי, מטגנום מיקרוביאלי, מטא טרנסקריפטום וליחה נוספת.לאחר מכן, צינור המטא טרנסקריפטום אטום, ממוקם אופקית והליחה הומוגנית במהירות בינונית למשך 10 דקות. לבסוף, אליקוטים בודדים מעובדים בנפרד כדי לבודד ולטהר תאים נגיפיים או חיידקיים לפני בידוד חומצות גרעין למחקרים מטגנומיים. בסופו של דבר, חומצות הגרעין המבודדות משמשות להכנת ספריית ריצוף תפוקה גבוהה ליצירת ספריות מטא-גנומיקה ומטא-טרנסקריפטומיקה.היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא מספק זרימת עבודה מקיפה לעיבוד דגימה מורכבת הקשורה למארח לחקר קהילות נגיפיות וחיידקים ברמת ה-DNA וה-RNA. הדגמה חזותית של הליך זה היא קריטית מכיוון ששלבי הטיפול המקדים בדגימה חשובים כדי להבטיח טיפול נכון בדגימה בעוד שקשה ללמוד את שלבי טיהור התאים הוויראליים והמיקרוביאליים בשל המורכבות בהליך לפני איסוף הדגימה, סמן ארבע שפופרות של 15 מיליליטר לדגימה עם הדברים הבאים, הראשון עם מטגנום נגיפי, השני כמטגנום מיקרוביאלי מספר שלוש עם מטא טרנסקריפטום וצינור מספר ארבע ככיח נוסף. הוסף שני מיליליטר של חרוזי סיליקה של 0.1 מילימטר לתוך הצינור המסומן מטא טרנסקריפטום, ואחריו שישה מיליליטר של מאגר ליזה RNA מבוסס גיני איזותיוציאנט, או מאגר ליזה של GITC.בהתאם להליך איסוף הדגימה המתואר בפרוטוקול הטקסט ובאמצעות כוסות דגימה מראש, העריכו את נפח הדגימה על ידי שקילת הכוס לאחר איסוף הדגימה והפחיתו את משקל הכוס הריקה. עבור המשקל הנותר, גרם אחד יהיה שווה ערך למיליליטר אחד של דגימה. אם נפח הדגימה קטן משמונה מיליליטר, הוסף את הנפח המתאים של 0.02 מיקרומטר מסונן XPBS אחד כדי להביא את הנפח הסופי לשמונה מיליליטר.לאחר מכן השתמש מיד במזרק של שלושה מיליליטר כדי להומוגניזציה של הדגימה עד שלא יישארו גושים גלויים בתוך הליחה באמצעות אותו מזרק שאב מיד שני מיליליטר ליחה והזריק אותו לתוך צינור המיקרו טרנסקריפטום המכיל חרוזי סיליקה ומאגר ליזה GITC. סגור את המכסה והשתמש בסרט פרה כדי לאטום היטב את המכסה כדי למנוע דליפה, השתמש במערבולת, אדוני כדי להומוגניזציה מיידית של הליחה במהירות בינונית למשך 10 דקות. באמצעות אותו מזרק, שני מיליליטר ליחה כל אחד לתוך הצינורות המסומנים מטגנום וירה ומטגנום מיקרוביאלי, ומעבירים את הליחה הנותרת מכוס הליחה לצינור המסומן כיח נוסף.אחסן את כל הצינורות בארבע מעלות צלזיוס או על קרח והובל למעבדה במידת הצורך כדי ליצור מטגנום ויראלי. לאחר הכנת מאגרים ותמיסות. טפל בדגימות מראש על ידי הוספת מאגר מגנזיום מלוח מסונן של 0.02 מיקרומטר לנפח כולל של שישה מיליליטר.כדי לסייע בהמסת ריר, הוסף שישה מיליליטר של 6.5 מילי-מולרי של DTT לכל דגימה. מערבולת נמרצת לערבב ולדגור במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מערבולת נמרצת, הדגימות מסתובבות שוב ב-3056 Gs ו-10 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות.אספו כל סופרנטנט לתוך שפופרת חדשה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש במסנן נקודתי של 45 מיקרומטר המותקן על מזרק כדי לסנן את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 15 מיליליטר. הסר 100 מיקרוליטר של דגימה לתוך צינור מיקרו פוגה ולאחר מכן בצע טיפול בכלורופורם.חלץ את הסופרנטנט ובצע טיפול DN one. הוסף נפח שווה של 4%para של פורמלדהיד כדי לתקן את הדגימה. למיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי, עיין בפרוטוקול הטקסט לגישת העשרת חלקיקים נגיפיים.אחרת, באמצעות תמיסות צזיום כלוריד טריות, הגדר שיפוע צזיום כלוריד על ידי העמסת מיליליטר אחד של 1.7 גרם למיליליטר של תמיסת צזיום כלוריד לכל צינור, ואחריו מיליליטר אחד של 1.5 גרם למיליליטר, מיליליטר אחד של נקודה 35 גרם למיליליטר, ולבסוף, מיליליטר אחד של 1.2 גרם למיליליטר של תמיסת צזיום כלוריד. לבסוף, טען שישה עד שמונה מיליליטר של דגימה לצינורות שיפוע בודדים. סמן שכבות בודדות כדי לציין את המיקום של כל שבר.לאחר מכן אזנו כל זוג שניים מנוגדים לטווח של מיליגרם אחד. נעל בזהירות כל צינור בדלי הסיבוב. העמיסו על הרוטור והצנטריפוגה בטמפרטורה של 82, 844 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים.לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינורות מהמחזיק מבלי לשבש את שיפועי הצפיפות בעזרת מחט בגודל 18 המחוברת למזרק של שלושה מיליליטר. ודא שהקצה הפתוח של המחט פונה כלפי מעלה. חודרים את הצינור ממש מתחת לשכבת הצפיפות של 1.5 גרם למיליליטר ושואבים לאט כ-1.5 מיליליטר תמיסה לתוך המזרק.הסר לאט את המחט ואפשר לשבר הנותר בצינור לטפטף לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר דרך הפנצ'ר. סמן זאת כמותניים שבר עליון העבר את התמיסה במזרק המכיל את ה-V ps לשני צינורות מיקרו פוגה חדשים. לאחר הכנת מאגרים ותמיסות, על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף חמישה נפחים של נקודה 22 מיקרומטר מסוננת XPBS אחד כדי לדלל כל הומוגנט מתחת למכסה המנוע הכימי, הוסף אתנול בטא MAR capta לנפח של 2% לריכוז הסופי של הנפח, ונדנד את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לאחר הדגירה.סובב את הדגימה ב-3056 GS ו-10 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש ב-10 מיליליטר מים בדרגה מולקולרית כדי להשעות מחדש את הגלולה ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני שתחזור על הכביסה. לאחר סיבוב אחרון, ולאחר השלכת ה-SUP natin, השתמש בחמישה מיליליטר של מאגר XDNA אחד כדי להשעות מחדש את הגלולה לפני הוספת 15 מיקרוליטר של ds.אחד למיליליטר של דגימה דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב חוזר במשך שעתיים. לאחר סיבוב הדגימות והשלכת החטיף, השתמש ב-10 מיליליטר של מאגר SE כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר מכן סובב את הדגימה וחזור על הכביסה.השתמש בשני מיליליטר של מאגר SE כדי להשעות מחדש את הגלולה ולהעביר את המתלה לשני צינורות מיקרו פוגה. לאחר מכן סובב את הצינורות ב -16, 000 GS בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לבסוף, לאחר הסרת הסופרנטנט, השתמשו בערכת מיצוי דנ"א גנומית בהתאם להוראות עבור חיידקים גראם-חיוביים.כדי לבודד את ה-DNA, תוצאות קודמות ליצירת מטאגנומים ויראליים מסוכמות כאן. הווירומים מכילים מעט רצפים שמקורם בבני אדם, כאשר רק דגימה אחת המכילה 70% דגימת DNA אנושית CCF 4 A הושמטה משלב האולטרה-צנטריפוגה של שיפוע הצפיפות, וכתוצאה מכך, היא הכילה יותר מ-97% רצפים שמקורם בבני אדם. איור זה מציג תמונה פלואורסצנטית של דגימת כיח CF טיפוסית לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.vlp ברור נצפה בהיעדר חלקיקים גדולים בעקבות הפרדת שיפוע הצפיפות הנראית כאן. שבע דגימות ליחה יומיות נאספו מחולה סיסטיק פיברוזיס יחיד שהתחיל אנטיביוטיקה דרך הפה. לאחר היום השלישי של האיסוף, התשואה הכוללת של ליזה היפוטונית, או HL DNA שנאסף מכל דגימה, נעה בין 210 ננוגרם ליותר מחמישה מיקרוגרם מספריות ריצוף Illumina שנוצרו עבור כל דגימה.כל הספריות מלבד אחת הניבה יותר ממיליון רצפים ויותר מ-85% רצפים באיכות גבוהה נשמרו בעיבוד מקדים של נתונים. באמצעות תוכנת הדפסה, הכמות הכוללת של רצפים שמקורם בבני אדם נעה בין 14% ל-46%כפי שמוצג כאן, הפרופילים המיקרוביאליים של תת-הדגימות דומים מאוד לדגימות לאחר שני טיפולי ליזה היפוטוניים. בנוסף, הליזיס ההיפוטוני השני מגדיל את חלק הרצפים הלא אנושיים בשישה עד 17% בתוך המטאגנומים.אל תשכח שעבודה עם דגימות קליניות ופתוגנים פוטנציאליים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש להשתמש תמיד בציוד מגן אישי בכל עת במהלך הטיפול בדגימה. נדרשות טכניקות טובות של ביולוגיה מולקולרית ומיקרוביולוגיה בעת ביצוע הליך זה כדי להבטיח שלא יהיה זיהום.לאחר הליך זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע מטגנומיה נגיפית ומיקרוביאלית, כמו גם מחקרים מטא-טרנסקריפטומיים מדגימות מורכבות כגון כיח CF.

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מיועד למיצוי וריכוז של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית שנאספה ממי ים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים המתאימים לניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה טנדם.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ורחבה לריצוף RNA בלתי מוטה של דגימות נגיפיות מבודדים קליניים אנושיים.

רצף עמוק משוחד של RNA וירוסי ממדגמים קליניים

Metagenomics שימש לחקירת המיקרוביום של מזון בקר תחמיץ. הניתוח בוצע על ידי ריצוף רובה ציד. גישה זו שימשה לאפיון הרכב הקהילה המיקרוביאלית בתוך מזון הבקר.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש שילוב של חישובית ומחקר ספסל למצוא רצפי חדשניים אשר לא ניתן להפריד בקלות בין רצף טיהור משותף, אשר עשוי להיות מוכר באופן חלקי בלבד.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

רצף Nanopore הוא טכנולוגיה חדשנית המאפשרת רצפי בעלות חסכונית במיקומים מרוחקים והגדרות משאב-עני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור רצף של mRNAs מתוך דם שלם התואם לתנאים כאלה.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

מטה-פרוטאומיקה קלינית מציעה תובנות לגבי המיקרוביום האנושי ותרומתו למחלות. רתמנו את הכוח החישובי של פלטפורמת גלקסי כדי לפתח זרימת עבודה ביואינפורמטית מודולרית המאפשרת ניתוח מטא-פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מורכבת ואפיון של סוגי דגימות קליניות מגוונות הרלוונטיים למחקרי מחלות.

זרימת עבודה של מטה-פרוטאומיקה קלינית המיושמת בפלטפורמת הביואינפורמטיקה של גלקסי לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביום העומדות בבסיס מחלות אנושיות

למדו שיטה מקיפה לעיבוד דגימות ריר מורכבות מחולי סיסטיק פיברוזיס לצורך חקר קהילות ויראליות ומיקרוביאליות באמצעות גישות מטגנומיות ומטטרנסקריפטומיות.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

גלה סרטונים נוספים