באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב Laevis Xenopus קונוסים צמיחה
7 בספטמבר 2014
המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule.
מטרת הליך זה היא להשיג מידע כמותי לגבי חלבון מעקב אחר מיקרו-צינוריות פלוס או דינמיקת קצה פלוס וחרוטי צמיחה חיים באמצעות חבילת התוכנה בתוספת גשש קצה. כאן אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת GFP EB one וחרוטי גידול XUS lavis מתורבתים, אך ניתן להשתמש בפרוטוקול דומה עבור סוגי תאים אחרים לאחר רכישת תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של חרוטי גידול עובריים מתויגים ומתורבתת. השלב הראשון בהליך הוא להשתמש בפקודה פלוס טיפ, לקבל מסלולים לזיהוי שביטי GFP אחד EB, לקשר את השביטים למסלולים ולקבוע את הפרמטרים של דינמיקת מיקרו-צינורות.
השלב השני הוא להשתמש במסלולי הפקודה בתוספת טיפ C כדי לדמיין את מסלולי המיקרו-צינורות המונחים על גבי תמונות חרוט הגדילה. השלב האחרון הוא להשתמש בניתוח קבוצת טיפים פלוס כדי לנתח ולהשוות את פרמטרי מסלול המיקרו-צינורות של קבוצות סרטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש במעקב אחר ידיים לניתוח מסלולי טיפ בודדים פלוס, הוא ששיטה זו מאפשרת זיהוי, מעקב, הדמיה וניתוח מהירים ואוטומטיים.
השלב הראשון בניתוח תמונה הוא זיהוי שביטי GFP אחד EB, קישור השביטים למסלולים וקביעת הפרמטרים של דינמיקת המיקרו-צינורות. זה מתקבל באמצעות הפקודה בתוספת טיפ. קבל מסלולים לפני ניתוח תמונה.
המר כל סרט דולג זמן לרצף של קבצי תמונה TIFF ושמור כל סדרה בתיקיה משלה הנקראת תמונות. שים לב שתמונות הן תלויות רישיות. כדי להתחיל בניתוח, פתח את אפליקציית MATLAB והקלד פלוס טיפ קבל רצועות לחלון הפקודה.
פעולה זו תגרום להופעת תיבת דו-שיח חדשה. לחץ על, הגדר פרויקטים חדשים ובחר אחת או יותר מסדרת תמונות ה-TIFF הקודמת על ידי בחירת תיקיית התמונות המתאימה. עם השלמת שלב זה, תיווצר ספריית קבצים.
לחץ על, בסדר. לאחר הצגת התמונה הראשונה, השתמש בעכבר כדי ללחוץ וליצור מצולע. לאחר מכן מקיף את כל חרוט הצמיחה.
לחץ פעמיים על העכבר כדי לסגור את המצולע. תיבת דו-שיח תופיע אם לתמונה יש חרוט גדילה נוסף. כדי לנתח, בחר כן.
אחרת, בחר לא. השלב הבא הוא בחירת הפרויקטים שינותחו באופן מיידי. לחץ על בחר פרויקטים ובחר את התיקייה.
כדי לנתח רשימה, יופיע מסך בחירה דביק. בחר את הפרויקטים מהצד השמאלי של המסך והעבר אותם לצד ימין. לחץ על, בסדר.
בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקטים ולחץ על שמור, בחר זיהוי, מעקב ועיבוד לאחר מכן. לאחר ביצוע בחירות אלה, הצד הימני של תיבת הדו-שיח יהפוך לניתן להגדרה. מלא את הגדרות העיבוד שלאחר העיבוד.
בהתאם להגדרות רכישת התמונות הספציפיות הרצויות, לחץ על התחל. לאחר מכן התוכנה תפעיל את השלבים שהוזנו. חלון הפקודה מציג את הזמן המשוער שנותר עבור כל פונקציה ויציין מתי השלב יסתיים לפעול.
כעת, לאחר שהוגדרו מסלולים מיקרו צינוריים, הפונקציה פלוס מסלולי קצה C משמשת להדמיית מסלול ולהצגת המסלולים המיקרו-צינוריים המונחים על גבי תמונות חרוט גדילה. זה מתקבל עם הפקודה בתוספת טיפ C רצועות בתוספת טיפ C רצועות בחלון הפקודה. לאחר טעינת תיבת הדו-שיח, לחץ על בחר פרויקט.
בחר את ספריית האב המכילה את הפרויקט להמחשה חזותית ולחץ על בחר תיקיה. לאחר הופעת החלון, בחר את הקובץ להמחשה ולחץ עליו. אוקיי, לאחר מכן, לחץ על בחר החזר ROI שמור נווט לאותה תיקיית אזור עניין כמו זו שנבחרה בשלב הקודם ובחר את הקובץ בשם R-O-I-Y-X.
לחץ על בחר ספריית פלט כדי לציין היכן MATLAB תשמור את קבצי ההדמיה של הרצועה ולאחר מכן בחר צור סרט רצועה. יופיע מסך המציג את כל הרצועות. טיפ פלוס קבל רצועות מחושבות מההערות של טיפ הפלוס.
השלב שומר את סדרת זמן המסלול בפורמט סרט. הפונקציה הסופית משמשת ליצירת קבוצות סרטים לניתוח והשוואה של פרמטרי המסלול המיקרו-צינוריים. זה מתקבל באמצעות ניתוח קבוצת הפקודה פלוס טיפים.
פעם אחת פלוס טיפ קבל רצועות הופעל עבור מספר סרטים וקבוצות משנה שונות של נתונים מוכנות להשוואה. הקלד ניתוח קבוצת עצות פלוס בחלון הפקודה כדי לבחור תחילה באופן ידני את הקבוצות להשוואה בטל את הבחירה בקבוצה אוטומטית מההיררכיה. לאחר מכן לחץ על פרויקטים נבחרים.
נווט אל ספריות האב המכילות את כל תיקיות ה-ROI. כדי לנתח רשימה, יופיע חלון ממשק משתמש גרפי. בחר את כל הפרויקטים שייכללו בקבוצות מהצד הימני של המסך והעבר אותם לצד ימין.
לחץ על, בסדר. לאחר מכן בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקטים ולחץ על שמור יופיע חלון. לחץ על.
אוקיי, והחלון הדביק של בחירת הרשימה יוצג. שוב, בחר רק את הקבצים המתאימים לקבוצה הראשונה שיש למשוך יחד ולחץ על. בסדר. הזן את שם הקבוצה ולחץ על, בסדר.
יופיע חלון, ענו בהתאם והמשיכו לבחור קבוצות. לאחר מכן בחר מיקום לשמירת רשימת הקבוצות ולחץ על שמור. לחץ על בחר ספריית פלט כדי לבחור היכן יאוחסנו תיקיות הפלט.
לבסוף, בחר איזה סוג של ניתוח קבוצתי לבצע. כאן אנו בוחרים נתוני מאגר מכל התאים והקבוצות. לחץ על השוואת קבוצות.
תמונה זו מציגה את הפרמטרים של דינמיקת מיקרו צינורות המתקבלים מהפונקציה בתוספת מסלולי טיפ גיט. סרטון זה מדגים את מסלולי המיקרו-צינורות המתקבלים מהפונקציה בתוספת מסלולי קצה C. לבסוף, תמונה זו מציגה את פרמטרי המיקרו-צינורות המתקבלים מניתוח קבוצת הפונקציה פלוס הקצה.
שימוש ביישום גיליון אלקטרוני. ניתן לבחון את הפרמטרים הללו שנרכשו מקבוצות שונות של סרטים גם כעלילות קופסה באמצעות תוכנת עיבוד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש במעקב אחר טיפים פלוס כדי לקבל מידע כמותי לגבי מיקרו-צינוריות פלוס דינמיקת קצה וחרוטי צמיחה חיים על ידי שימוש בפונקציות בתוספת מסלולי טיפ גיט בתוספת מסלולי טיפ C, וניתוח קבוצת טיפים פלוס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את השימוש בחבילת התוכנה המבוססת על MATLAB, plusTipTracker, לניתוח דינמיקה של מיקרוטובוליים באמצעות +TIPs מסומנים פלואורסצנטית. הפרוצדורה מספקת גישה שיטתית לכימות התנהגותם של חלבונים העוקבים אחר הקצה הפלוס של המיקרוטובוליים באפיקוזי גדילה חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דינמיקת מיקרוטובוליים
רקע
- מיקרוטובוליים ממלאים תפקיד מכריע במבנה ובבתפקוד התאי.
- חלבוני +TIP הם חלבונים הנקשרים לקצוות הצומחים של המיקרוטובוליים.
- ניתוח כמותי של דינמיקת +TIP חיוני להבנת תהליכים תאיים.
- שיטות קיימות למעקב אחר מיקרוטובוליים עלולות להיות ממושכות ופחות יעילות.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לניתוח דינמיקה של מיקרוטובוליים באמצעות plusTipTracker.
- להגביר את ההבנה של התנהגות +TIP בתאים חיים.
- להדגים את היתרונות של מעקב אוטומטי על פני שיטות ידניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בפקודה plusTip, get tracks לזיהוי "שביטים" (comets) של EB1-GFP.
- קישור השביטים למסלולים לקביעת פרמטרים של דינמיקת מיקרוטובוליים.
- ויזואליזציה של מסלולי מיקרוטובוליים באמצעות פקודת plusTip C tracks.
- ניתוח קבוצתי של פרמטרי מסלולי מיקרוטובוליים על פני מספר סרטונים.
תוצאות עיקריות
- הושגה זיהוי ומעקב אוטומטיים של דינמיקת מיקרוטובולות.
- טכניקות הוויזואליזציה סיפקו תובנות ברורות לגבי התנהגות המיקרוטובולות.
- ניתוח קבוצתי אפשר ביצוע מחקרים השוואתיים בין תנאים שונים.
- השיטה הוכחה כמהירה ויעילה יותר משיטות מעקב מסורתיות.
מסקנות
- plusTipTracker הוא כלי בעל ערך לחקר דינמיקה של מיקרוטובוליים.
- הגישה האוטומטית משפרת את הדיוק ואת היעילות של הניתוח.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה לסוגי תאים ותנאים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות של דינמיקת מיקרוטובוליים באזורי הצמיחה (growth cones) של נוירונים מספק תובנות מכניסטיות לגבי הדרכה אקסונית ויצירת סינפסות, תהליכים הרלוונטיים למודלים של הפרעות נוירו-התפתחותיות. ניתוח אוטומטי של מסלולי שביטים של +TIP מאפשר סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות המשפיעות על הבקרה של השלד התאי, ובכך תומך באימות מטרות בצינורות גילוי במדעי המוח. גישה זו מפחיתה הטיות אנליטיות ומגבירה את הסבירות לעומת מעקב ידני, ובכך משפרת את הביטחון החזוי במחקרי מעורבות מטרות (target engagement) בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של דינמיקת הפולימריזציה של מיקרוטובולי כקריאה פונקציונלית עבור מטרות המווסתות את הצמיחה או היציבות של האקסון.
- ערך תפעולי: מספק פרמטרים כמותיים סטנדרטיים (מהירות צמיחה, תדירות עצירות, קצב קטסטרופה) לצורך הערכה עקבית של פנוטיפ המטרה על פני ספריות של תרכובות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות רב-פרמטריות הניתנות לשחזור של התנהגות מיקרוטובוליים, המתאימות למזעור ואוטומציה של בדיקות בפורמטים של 96 או 384 בארות.
- ערך תפעולי: מסייע בסטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות שונות על ידי הגדרת בחירת ROI ברורה, פרמטרי מעקב וספי סף לניתוח קבוצות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר פנוטיפים של דינמיקת מיקרוטובוליים in vitro למנגנונים הרלוונטיים למחלה במודלים של התפתחות עצבית או ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: תומך ברצף מתרביות נוירונים ראשוניות לפרוסות אורגנוטיפיות או לתיקוף in vivo באמצעות מתודולוגיית מעקב +TIP משומרת.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, שבו פנוטיפים כמותיים של השלד התאי מנחים את בחירת המטרה לפני זיהוי המולקולה המובילה ובדיקת יעילות פרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מטרות קינאז, פוספטאז או חלבונים הקשורים למיקרוטובוליים באמצעות מדידה ישירה של דינמיקת comet של +TIP בקוני צמיחה חיים.
- סריקה: מספק פלטים מנורמלים ומוכנים לבדיקה (צפיפות comet, אורך מסלול, התפלגויות מהירות) המאפשרים חישוב Z'-factor ואישור פגיעות (hit confirmation).
- אנליזה: מספק השוואות סטטיסטיות ברמת קבוצה (ממוצע, שונות, הסטות בהתפלגות) החיוניות להערכת השפעות של תרכובות על פני חזרות ביולוגיות.
- מחקר תרגומי: מקשר פנוטיפים של השלד התאי לבדיקות של צמיחת אקסון או יצירת סינפסה, בתיאום עם נקודות סיום פונקציונליות פרה-קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מסגרת אנליטית מרכזית מבוססת MATLAB, הישמיה לסוגי תאים מגוונים (נוירונים, פיברובלסטים, שורות תאי סרטן) המבטאים +TIPs פלואורסצנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החוזאי במודולציה של המטרה על ידי הפחתת השונות הגלומה במעקב ידני ואפשרות לזיהוי שינויים דינמיים עדינים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות זיהוי אוטומטי של שביטים (comets), אלגוריתמי מעקב סטנדרטיים ועיבוד באצווה של סדרות time-lapse.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת פרופילים רב-פרמטריים של השלד התאי בשלב מוקדם יותר של ציר הזמן של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על חומרת הפנוטיפ הכמותית של המיקרוטובוליים ועל עוצמת ההצלה (rescue) המושרית על ידי התרכובת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות תאים חיים, בסביבת MATLAB ובסימון חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, EB1-GFP) בתרביות נוירונים ראשוניות.
- תלוי במערכות רכישת תמונות בשיטת time-lapse בעלות רזולוציה גבוהה ורעילות פוטונית נמוכה, המסוגלות ללכוד דינמיקה של שביטי +TIP במרווחי זמן של 1–2 שניות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרת ROI (היקף קו הצמיחה), פרמטרי מעקב (מרחק קישור, פער בין פריימים) ומסנני עיבוד לאחר רכישה.
- כולל שיקולי התאמה למורפולוגיות תאים משתנות (למשל, קוני צמיחה לעומת גזעי אקסונים) ורמות ביטוי של +TIP במערכות מודל שונות.
- מוגבל על ידי הדרישה לשביטי +TIP ניתנים לזיהוי ולמעקב; ייתכן שלא יתאים לתנאים שבהם אירועי פולימריזציה של מיקרוטובוליים הם דלילים או לא יציבים ביותר.
