Name: באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב Laevis Xenopus קונוסים צמיחה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למד כיצד לנתח דינמיקת מיקרוטובולים בקונוסי צמיחה של Xenopus laevis באמצעות תוכנת plusTipTracker. השיטה מאפשרת זיהוי אוטומטי, מעקב ויזואליזציה וניתוח מהיר של חלבוני +TIP בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר גאודנז דנזר ולחברי המעבדה שלו על יצירת תוכנת plusTipTracker ועל הדיון המועיל בנוגע לשימוש בתוכנה, במיוחד מריה בגוניס וסבסטיאן בסון. אנו מודים במיוחד למרכז המדיה של בוסטון קולג' על הסיוע והתמיכה ביצירה ובעריכה של הסרטון. אנו מודים גם לחברי מעבדת לאורי על דיונים מועילים וביקורת בונה, ולאביגיל אנטואן על הגהה של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי פרס NIH R00 MH095768 ל-LAL.

הפרוטוקול והסרטון הזה נועדו לשמש כבן לוויה למאמר המקורי המתאר את חבילת התוכנה בפירוט רב יותר 4, כמו גם את הדוח הטכני שמגיע עם תוכנות להורדה באתר האינטרנט של המעבדה Danuser. קוראים מוזמנים לעיין במסמכים אלה בזהירות אם יש שאלות נוספות בנוגע לשימוש בתוכנה. .1 לפני ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר כל סרט הזמן לשגות לתוך רצף של TIFF (פורמט קובץ תמונה שתייגת) קבצי תמונה. אם יש קונוסים צמיחה מרובים / תאים בסרט נתון, יבול ראשון כל חרוט צמיחה / תא כדי ליצור תמונה ברצף משלה. הערה: זה אינו הכרחי, כפי שניתן לבחור אזורים של ריבית בודדים (ROI) בתוך plusTipTracker. עם זאת, שימוש בממדי תמונה קטנים יותר מגדיל את המהירות של העיבוד חישוביים, כך שלב זה מומלץ אם יש שטח ריק משמעותי בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציל את כל סדרת TIFF משלותיקייה בשם &quot;תמונות&quot; בתוך נתיב שMATLAB מוגדר גישה (שים לב כי &quot;תמונות&quot; היא תלויות רישיות). כדי להוסיף לדרך חדשה, לנווט לספריית קבצים הרלוונטית בחלון &quot;התיקייה הנוכחית&quot;, לחץ לחיצה ימנית, על סמל הספרייה, ובחר באפשרות &quot;הוסף לנתיב - תיקיות נבחרות ותת תיקיות&quot;. חשובה שתיקיית תוכנת plusTipTracker תתווסף לנתיב, כמו גם. </li></ol> .2 PlusTipGetTracks הערה: הצעד הראשון בניתוח תמונה היא לזהות את כוכבי שביט EB1-GFP, לקשר שביטים למסלולים, ולקבוע את הפרמטרים של דינמיקת microtubule. זה שהושג עם &quot;plusTipGetTracks&quot; הפקודה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל ניתוח, יישום MATLAB פתוח והקלד &quot;plusTipGetTracks&quot; לתוך החלון הפקודה. זה יגרום תיבת הדו שיח חדשה להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הגדרת פרויקטים חדשים&quot; ובחר באחת (או מורה) של סדרת תמונת TIFF הקודמת על ידי בחירה &quot;תמונות&quot; המתאימות תיקייה (או ספריות המכילות &quot;דימויים&quot; תיקיות). עם השלמת שלב זה, ספריית קבצים (roi_1) ייווצר (באותה התיקייה שמכילה &quot;תמונות&quot;) שיכילו את קבצי נתונים העתידיים. הערה: ניתן להשלים את הצעד &quot;פרויקטים חדשים שהוקם&quot; לפני הזמן, במהלך נפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש יופיע: &quot;בחר מצולע, לחץ לחיצה ימנית על הנקודה האחרונה, ולחץ על &#39;צור מסכה&#39;&quot;. לחץ על &quot;אישור&quot;. התמונה הראשונה בסדרת התמונה שנבחרה לאחר מכן ניתן תהיה מוצג. השתמש בעכבר כדי ללחוץ וליצור מצולע המקיף את מכלול חרוט הצמיחה. לחץ לחיצה כפולה על העכבר כדי לסגור את המצולע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמצולע סגור, תיבת הדו שיח תופיע: &quot;האם אתה רוצה לבחור את ההחזר על ההשקעה אחרת?&quot; אם התמונה יש חרוט צמיחה אחר לנתח, בחר &quot;כן&quot;; אחרת זההנבחר &quot;לא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרויקטים שינותחו באופן מיידי. לחץ על &quot;בחרו פרויקטים&quot; ובחר את התיקייה (roi_X) כדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך listSelectGUI יופיע. בחר את הפרויקט (ים) מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;. בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;איתור&quot;, &quot;מעקב&quot;, ו &quot;לאחר עיבוד&quot;. ברגע שבחירות אלה נעשו, בצד ימין של תיבת הדו שיח יהפוך להגדרה. קביעת תצורה של כל אופציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים אלה משמשים כדי לקשר שביטים זוהו במסלולי MT. פרטים עבור בחירת הפרמטרים שליטה אלה למעקב כלולים בדפי 9-10 של טכני דווח PDF המלווה את הורדת חבילת תוכנה; לקרוא דוח זה בזהירות אם בעיות הם נתקלו. לצורך מעקב אחר השביטים EB1-GFP בXenopשלנו laevis קונוסים צמיחה, להשתמש בהגדרות המעקב הבאות: חפש טווח רדיוס (פיקסלים) 5-12, אורך תת מסלול מינימאלי (מסגרות) 3; אורך מקסימאלי גאפ (מסגרות) 8; מקס כיווץ פקטור 0.8, זווית מקס קדימה 50, זווית מקס אחורה 10, תנודות רדיוס 2.5. הגדרות אלה שמוצגים באיור 1. </li></ol> הערה: מקס כיווץ פקטור מוגדר לצמצם את מספר &quot;הפערים לאחור&quot; מזוהים, כמו &quot;פערים אחורה&quot; אינם מועילים לניתוח בהקשר של קונוסים צמיחה, בהתחשב בתנאים הצפופים וצפויות השגיאות בקשרי מסלול. בנוסף, שניהם זווית מקס קדימה, כמו גם שינויי הרדיוס מוגדר גבוהה יחסית, כMTs חרוט צמיחת תערוכת טרנסלוקציות תכופה קטנה בנוסף לגידולים וshrinkages, וחיזוק הגדרות שליטה אמורה, מאפשר תנועה מוגברת במהלך שלב ההצמדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את פוסט עיבוד הגדרות בהתאם להגדרות רכישת תמונה הספציפיות הרצויות. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההגדרות הוגדרו, לחץ על &quot;התחל&quot;. התוכנה תפעל לפי הגדרות שנבחרו. פעולה זו עשויה להימשך דקות עד שעות, תלוי במספר פרויקטים שנבחרו והגדלים שלהם. Command Window מציג הזמן המשוער שנותר לכל פונקציה. כאשר צעד plusTipGetTracks הושלם, החלון הפקודה יציג את &quot;סיים!&quot; הערה: רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT יש עכשיו כבר מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר לבחינה הן מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), חיים במסלול צמיחה (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). </li></ol> .3 PlusTipSeeTracks הערה: כעת, לאחר שמסלולי microtubule הוגדרו, &quot;plustipSeeTracks&quot; הפונקציה משמש להדמיה מסלול 4. פונקציה זויכול לספק במספר יציאות להדמיה, כוללים מפות דינמיקת MT במרחב ובסרטים במהירות, אבל כאן, הדגש הוא אך ורק על שימוש ב&quot; סרטי מסלול &quot;כדי להציג מסלולי MT על גבי התמונות חרוטים צמיחה. בעוד plusTipGetTracks יכול לנתח סרטים מרובים בו זמנית, plusTipSeeTracks יכול רק לנתח סרט אחד בכל פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;plusTipSeeTracks&quot; לתוך החלון הפקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טעינת תיבת הדו שיח, לחץ על &quot;בחר פרויקט&quot;. בחר את ספריית האב המכילה את הפרויקט לדמיין ולחץ על &quot;בחר תיקייה&quot;. חלון חדש יופיע: &quot;בחר בפרויקט שאתה רוצה לדמיין&quot;. בחר את הקובץ לדמיין ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחץ על &quot;בחר שמורים את ההחזר על ההשקעה&quot;. נווט לאותה התיקייה roi_X כאחד שנבחר בשלב הקודם ובחר את הקובץ בשם &quot;roiYX&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;בחר ספריית פלט&quot; לייעד wכאן MATLAB יחסוך קבצי ההדמיה המסלול. שים לב: אנו ממליצים על שימוש באותה התיקייה שמכילה את שאר הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הפוך מסלול סרט&quot; ומסך יופיע בו מוצגות כל plusTipGetTracks המסלולים מחושב משביטי עצה +. פעולה זו תשמור את סדרת זמן במעקב בפורמט סרט, בקובץ &quot;allTracks_X_X_X&quot;. יש אפשרות לשמירת הסרט כAVI, אחרת פורמט ברירת המחדל הוא כקובץ Quicktime.mov. </li></ol> .4 PlusTipGroupAnalysis הערה: הפונקציה אחרונה זו משמשת ליצירת קבוצות של סרטים לניתוח והשוואה של הפרמטרים מסלול MT שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; לתוך החלון הפקודה. כדי לבחור באופן ידני את הקבוצות להשוואה, הראשון דה בחר &quot;קבוצה אוטומטית מהיררכיה&quot;. לאחר מכן, לחץ על &quot;פרויקטים בחרו&quot;. נווט אל ספריות אב המכילות את כל תיקיות roi_Xכדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך listSelectGUI יופיע. בחר את כל הפרויקטים שייכללו בקבוצות מהצד השמאלי של המסך ולהעביר אותן לצד ימין של המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;. בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקט ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יופיע חלון: &quot;אנא בחר קבוצה ראשונה מהרשימה&quot;. לחץ על &quot;אישור&quot;. חלון listSelectGUI יציג שוב. הפעם, בחרו רק את קבצים שמתאימים לקבוצה הראשונה שצריך להיות ויקווה יחד. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הזן את שם הקבוצה, ולחץ על &quot;אישור&quot;. יופיע חלון: &quot;בחר בקבוצה אחרת?&quot; תשובה בהתאם, ולהמשיך בחירת קבוצות. יופיע חלון: &quot;בחר מיקום לשמירת רשימת הקבוצות שלך&quot;. נווט אל המיקום ולחץ על &quot;שמור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מדריך פלט בחר&quot; לבחור בי תיקיות הפלט תהיהמאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר איזה סוג של ניתוח קבוצה לנהל - אם מסלולי MT יש ייקוו לכל קבוצה או לניתוח תא צריכה להתבצע. המבחנים הסטטיסטיים המומלצים כבר מיועדים. כדי לכלול את כל המסלולים בניתוח, בטל את הבחירה &quot;הסר מסלולים בתחילת / סיום של סרט&quot;. אחרת, יש תיבה זו נבחרה מסיר את כל מסלולי צמיחת MT שנמצאים בתהליך כסרט מתחיל או מסתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בחירת ניתוח הקבוצה מורכבת, בחר &quot;השוואת קבוצות&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li>
<li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality%3A+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li>
<li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).</li>
<li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li>
<li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li>
<li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413(2012).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li>
<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

PlusTipTracker מספק ממשק משתמש פשוט, גרפי כדי לזהות במהירות ובאופן אוטומטי שביטים EB1-GFP כמעט כל גלויים בקונוס תא או צמיחה, לקשר שביטים למסלולים, ולחשב פרמטרים MT. פרסומים אחרים דיווחו העיצוב של סוגים דומים של תוכנה (לדוגמא, מרקס et al. ניתוח כמו גם מנוצל של דינמיקת EB1 מתויגת בקונוסים צמיחה 18). אבל, תוכנה זו נראית ייחודית בה להקל על גישה, כפי שהוא להורדה חופשית מאתר האינטרנט של המעבדה Danuser, המתמחה בעיצוב בקוד פתוח, Turn-Key תוכנות שימושיות לקהילת התא הביו...

מטרתה של שיטה זו היא לקבל מידע כמוני אודות microtubule (MT) בתוספת-מעקב סוף החלבון (+ טיפ) דינמיקה בחיים קונוסים צמיחה. MT + טיפים מועילים בקבוצה של חלבונים הלמקם את התוספת-הקצוות של MTS 9,10. הם מבצעים מגוון רחב של פונקציות להסדיר פרמטרים של חוסר יציבות MT הדינמי 11, כוללים שיעורים של פילמור, קטסטרופה, והצלה. שיטה המשמשת היטב אחד לניתוח דינמיקת MT היא לעקוב אחר ההתנהגות של EB1 עצה +, אשר נקשר באופן ספציפי לMT גדל בתוספת-מסתיים 1,12. EB1 ידוע לגייס כמה חלבונים אחרים לMT גדל בתוספת-מסתיים 13,14, ולאחרונה כבר נקבע כגורם התבגרות MT 15, קידום שניהם צמיחת MT ותדירות אסון 15,16. מחקרים של דינמיקת MT בתוך קונוסים צמיחה רבים מנוצלים שיטות עבודת יד מעקב כדי למדוד שינויים בדינמיקת EB1-GFP לאורך הזמן 1-3, כlocalizati EB1לMT יכול לשמש תוספת מסתיימת כסמן לפילמור MT. יתרון עיקרי לבחינת שביטים EB1-GFP כמדד לצמיחת MT הוא שדינמיקת MT ניתן למדוד גם באזורים של החפיפה MT משמעותית. בעוד השיטה של שביטים EB1-GFP יד מעקב סיפקה תובנות שימושיות לMT התנהגויות 1-3, זה זמן רב ויכול להיות מוטה. בנוסף, כצמיחה חריגה התנהגויות קונוס עשויות התוצאה של משמרות דקות בדינמיקת cytoskeletal, ניתוח תת קבוצה קטנה בלבד של MTS (בדרך כלל נדרשות כאשר יד מעקב) עלול להחמיץ מידע משמעותי. לפיכך, אנו מודדים פרמטרים דינמיקת MT הגלובליים באמצעות חבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, לאחר הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו, שפותחה במעבדת Danuser, נעשתה שימוש במספר מחקרים המאפיינים את דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8. זה קוד פתוח,אה ידידותי, חבילה מבוססת MATLAB הכוללת זיהוי אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. רשימה של פרמטרים ספציפיים של דינמיקת MT מחושבים על ידי תוכנה זו ארוכה (ראה 4 קוד לפרטים נוספים), אבל לניתוח של דינמיקת MT בקונוסים צמיחה, הפרמטרים השימושיים ביותר הם מהירות מסלול של צמיחת MT (במיקרון / דקה), מסלול של צמיחה חיים (בשניות), ואורך מסלול של צמיחה (במיקרון). את התוכנה ניתן להוריד מאתר אינטרנט המעבדה Danuser ישירות (תחת &quot;תוכנה&quot;). בעוד המעבדה Danuser תומכת כעת ממשק חדש לניתוח מעקב עצה +, אשר שולב לתוך חבילת תוכנה בשם u-מסלול 2.0, התוכנה המקורית, עצמאית תישאר זמינה. האלגוריתמים הבסיסיים בין שתי התוכניות הם אותם (לפחות כמו של 2014), עם רק הבדל של תפוקות ממשק וניתוח. למשתמש המתחיל עם MATLAB הקטן ו / או התנסות אנליזה חישוביתence, יש plusTipTracker תכונות ידידותי למשתמש יותר, ובכלל זה תפוקות פרמטר סטטיסטיות אוטומטיות. כאן, אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחת laevis תרבותי צפרדעים. פרוטוקול זה נוצל בשנים האחרונה בעיתון בחינת דינמיקת MT 17. ראו גם אל אפלולי ואח. 2012 5 להוראות מפורטות לגבי קונוסים צמיחת culturing להביע EB1-GFP. בעוד מאמר זה התמקד בעיקר בבחינת דינמיקת EB1-GFP בקונוסים צמיחה, באותו הפרוטוקול יכול לשמש לסוגי תאים אחרים 17. לכל סוגי התאים, מרווח הזמן בין מסגרות צריך להיות בין 0.5-2 שניות למעקב עצה + אופטימלי. מרווח זמן של עד 4 שניות בין המסגרות אפשרי, אבל זה עלה תוצאות מרווח זמן בשגיאות מעקב נוספות.

<table><tbody><tr><td>תוכנת plusTipTracker</td><td>Danuser Lab</td><td><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td><td>תוכנה זו עשויה להתארח באתר אחר בעתיד. אם האתר הרשום אינו קיים, חפש "Danuser Lab Software" במנוע חיפוש באינטרנט כדי למצוא את האתר.</td></tr><tr><td>תוכנת MATLAB</td><td>Mathworks</td><td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות plustiptracker תוכנה כדי למדוד microtubule dynamics ב laevis xenopus קונוסים צמיחה

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) בתוספת-מעקב-end חלבונים (+ טיפים) בתרגום לתוספת-סיום הגדילה של MTS ולהסדיר דינמיקת MT 1,2. אחד הטיפים הידועים ביותר ושימוש נרחב + לניתוח דינמיקת MT הוא כריכה-End החלבון, EB1, הקושר את כל תוספת-קצות MT גדלו, ובכך, מהווה סמן לפילמור MT 1. מחקרים של EB1 התנהגות בתוך קונוסים צמיחה רבים השתמשו זמן רב ו, שיטות עבודת יד מעקב בעזרת מחשב מוטה לנתח פרט MTs 1-3. הגישה שלנו היא לכמת פרמטרים הגלובליים של דינמיקת MT שימוש בחבילת התוכנה, 4 plusTipTracker, בעקבות הרכישה של רזולוציה גבוהה, תמונות בשידור חיות של EB1 מתויג בקונוסים צמיחה עובריים בתרבית 5. תוכנה זו היא חבילה מבוססת MATLAB, קוד פתוח, ידידותי למשתמש, המשלבת איתור אוטומטי, מעקב, הדמיה, וניתוח לסרטים של + טיפים, שכותרתו fluorescently. כאן, אנו מציגים הפרוטוקול לשימוש plusTipTracker לניתוח השביטים עצה + fluorescently שכותרתו בקונוסים צמיחת laevis תרבותיים צפרדעים. עם זאת, תוכנה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין דינמיקת MT בסוגי תאים שונים 6-8.

שימוש בתוכנה זו, כמתואר כאן יספק כמה קבצי מידע שלכמת דינמיקת עצה + בתאים חיים. PlusTipGetTracks הפונקציה מזהה את הרצועות (באמצעות הגדרות דוגמא מוצגות באיור 1), ולאחר מכן מספק פרמטרים לגבי מסלולי עצה +. כדי להציג את המידע שהתוכנה קיבלה, ללכת לספריית roi_X שיצרה בשלב 2.2. התיקייה "ההישג" מכילה "overlayImages", שהיא סדרה של תמונות המציגות את כוכבי השביט שזוהה. בחינת תמונות אלה באמצעות תוכנת ניתוח תמ...

המבוססת על MATLAB, חבילת תוכנות הקוד הפתוחה, plusTipTracker, ניתן להשתמש בו לסדרת תמונה של + טיפים, שכותרתו fluorescently לנתח לכמת דינמיקת microtubule.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב Laevis Xenopus קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

מטרת הליך זה היא להשיג מידע כמותי לגבי חלבון מעקב אחר מיקרו-צינוריות פלוס או דינמיקת קצה פלוס וחרוטי צמיחה חיים באמצעות חבילת התוכנה בתוספת גשש קצה. כאן אנו מתארים את השלבים לניתוח תמונות של דינמיקת GFP EB one וחרוטי גידול XUS lavis מתורבתים, אך ניתן להשתמש בפרוטוקול דומה עבור סוגי תאים אחרים לאחר רכישת תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של חרוטי גידול עובריים מתויגים ומתורבתת. השלב הראשון בהליך הוא להשתמש בפקודה פלוס טיפ, לקבל מסלולים לזיהוי שביטי GFP אחד EB, לקשר את השביטים למסלולים ולקבוע את הפרמטרים של דינמיקת מיקרו-צינורות.השלב השני הוא להשתמש במסלולי הפקודה בתוספת טיפ C כדי לדמיין את מסלולי המיקרו-צינורות המונחים על גבי תמונות חרוט הגדילה. השלב האחרון הוא להשתמש בניתוח קבוצת טיפים פלוס כדי לנתח ולהשוות את פרמטרי מסלול המיקרו-צינורות של קבוצות סרטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש במעקב אחר ידיים לניתוח מסלולי טיפ בודדים פלוס, הוא ששיטה זו מאפשרת זיהוי, מעקב, הדמיה וניתוח מהירים ואוטומטיים.השלב הראשון בניתוח תמונה הוא זיהוי שביטי GFP אחד EB, קישור השביטים למסלולים וקביעת הפרמטרים של דינמיקת המיקרו-צינורות. זה מתקבל באמצעות הפקודה בתוספת טיפ. קבל מסלולים לפני ניתוח תמונה.המר כל סרט דולג זמן לרצף של קבצי תמונה TIFF ושמור כל סדרה בתיקיה משלה הנקראת תמונות. שים לב שתמונות הן תלויות רישיות. כדי להתחיל בניתוח, פתח את אפליקציית MATLAB והקלד פלוס טיפ קבל רצועות לחלון הפקודה.פעולה זו תגרום להופעת תיבת דו-שיח חדשה. לחץ על, הגדר פרויקטים חדשים ובחר אחת או יותר מסדרת תמונות ה-TIFF הקודמת על ידי בחירת תיקיית התמונות המתאימה. עם השלמת שלב זה, תיווצר ספריית קבצים.לחץ על, בסדר. לאחר הצגת התמונה הראשונה, השתמש בעכבר כדי ללחוץ וליצור מצולע. לאחר מכן מקיף את כל חרוט הצמיחה.לחץ פעמיים על העכבר כדי לסגור את המצולע. תיבת דו-שיח תופיע אם לתמונה יש חרוט גדילה נוסף. כדי לנתח, בחר כן.אחרת, בחר לא. השלב הבא הוא בחירת הפרויקטים שינותחו באופן מיידי. לחץ על בחר פרויקטים ובחר את התיקייה.כדי לנתח רשימה, יופיע מסך בחירה דביק. בחר את הפרויקטים מהצד השמאלי של המסך והעבר אותם לצד ימין. לחץ על, בסדר.בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקטים ולחץ על שמור, בחר זיהוי, מעקב ועיבוד לאחר מכן. לאחר ביצוע בחירות אלה, הצד הימני של תיבת הדו-שיח יהפוך לניתן להגדרה. מלא את הגדרות העיבוד שלאחר העיבוד.בהתאם להגדרות רכישת התמונות הספציפיות הרצויות, לחץ על התחל. לאחר מכן התוכנה תפעיל את השלבים שהוזנו. חלון הפקודה מציג את הזמן המשוער שנותר עבור כל פונקציה ויציין מתי השלב יסתיים לפעול.כעת, לאחר שהוגדרו מסלולים מיקרו צינוריים, הפונקציה פלוס מסלולי קצה C משמשת להדמיית מסלול ולהצגת המסלולים המיקרו-צינוריים המונחים על גבי תמונות חרוט גדילה. זה מתקבל עם הפקודה בתוספת טיפ C רצועות בתוספת טיפ C רצועות בחלון הפקודה. לאחר טעינת תיבת הדו-שיח, לחץ על בחר פרויקט.בחר את ספריית האב המכילה את הפרויקט להמחשה חזותית ולחץ על בחר תיקיה. לאחר הופעת החלון, בחר את הקובץ להמחשה ולחץ עליו. אוקיי, לאחר מכן, לחץ על בחר החזר ROI שמור נווט לאותה תיקיית אזור עניין כמו זו שנבחרה בשלב הקודם ובחר את הקובץ בשם R-O-I-Y-X.לחץ על בחר ספריית פלט כדי לציין היכן MATLAB תשמור את קבצי ההדמיה של הרצועה ולאחר מכן בחר צור סרט רצועה. יופיע מסך המציג את כל הרצועות. טיפ פלוס קבל רצועות מחושבות מההערות של טיפ הפלוס.השלב שומר את סדרת זמן המסלול בפורמט סרט. הפונקציה הסופית משמשת ליצירת קבוצות סרטים לניתוח והשוואה של פרמטרי המסלול המיקרו-צינוריים. זה מתקבל באמצעות ניתוח קבוצת הפקודה פלוס טיפים.פעם אחת פלוס טיפ קבל רצועות הופעל עבור מספר סרטים וקבוצות משנה שונות של נתונים מוכנות להשוואה. הקלד ניתוח קבוצת עצות פלוס בחלון הפקודה כדי לבחור תחילה באופן ידני את הקבוצות להשוואה בטל את הבחירה בקבוצה אוטומטית מההיררכיה. לאחר מכן לחץ על פרויקטים נבחרים.נווט אל ספריות האב המכילות את כל תיקיות ה-ROI. כדי לנתח רשימה, יופיע חלון ממשק משתמש גרפי. בחר את כל הפרויקטים שייכללו בקבוצות מהצד הימני של המסך והעבר אותם לצד ימין.לחץ על, בסדר. לאחר מכן בחר מיקום לשמירת רשימת הפרויקטים ולחץ על שמור יופיע חלון. לחץ על.אוקיי, והחלון הדביק של בחירת הרשימה יוצג. שוב, בחר רק את הקבצים המתאימים לקבוצה הראשונה שיש למשוך יחד ולחץ על. בסדר. הזן את שם הקבוצה ולחץ על, בסדר.יופיע חלון, ענו בהתאם והמשיכו לבחור קבוצות. לאחר מכן בחר מיקום לשמירת רשימת הקבוצות ולחץ על שמור. לחץ על בחר ספריית פלט כדי לבחור היכן יאוחסנו תיקיות הפלט.לבסוף, בחר איזה סוג של ניתוח קבוצתי לבצע. כאן אנו בוחרים נתוני מאגר מכל התאים והקבוצות. לחץ על השוואת קבוצות.תמונה זו מציגה את הפרמטרים של דינמיקת מיקרו צינורות המתקבלים מהפונקציה בתוספת מסלולי טיפ גיט. סרטון זה מדגים את מסלולי המיקרו-צינורות המתקבלים מהפונקציה בתוספת מסלולי קצה C. לבסוף, תמונה זו מציגה את פרמטרי המיקרו-צינורות המתקבלים מניתוח קבוצת הפונקציה פלוס הקצה.שימוש ביישום גיליון אלקטרוני. ניתן לבחון את הפרמטרים הללו שנרכשו מקבוצות שונות של סרטים גם כעלילות קופסה באמצעות תוכנת עיבוד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתמש במעקב אחר טיפים פלוס כדי לקבל מידע כמותי לגבי מיקרו-צינוריות פלוס דינמיקת קצה וחרוטי צמיחה חיים על ידי שימוש בפונקציות בתוספת מסלולי טיפ גיט בתוספת מסלולי טיפ C, וניתוח קבוצת טיפים פלוס.

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

למד כיצד לנתח דינמיקת מיקרוטובולים בקונוסי צמיחה של Xenopus laevis באמצעות תוכנת plusTipTracker. השיטה מאפשרת זיהוי אוטומטי, מעקב ויזואליזציה וניתוח מהיר של חלבוני +TIP בתאים חיים.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב Laevis Xenopus קונוסים צמיחה

גלה סרטונים נוספים