Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבנות וקטורים מכוונים לגנים באמצעות תת-שיבוט פלוס החדרה. זה מושג על ידי הפיכת הגב המכיל אי קולי עם פלסמיד מחדש. השלב השני כולל יצירת קלטות החדרה זרחניות אסימטריות, ופלסמידים תת-שיבוט על ידי תגובת שרשרת פולימראז.

לאחר הוספת ארבינוז, חלבוני השילוב מחדש של GBAA באים לידי ביטוי וקלטת ההחדרה הטרמינלית שהשתנתה ופלסמיד תת-שיבוט עוברים אלקטרופורציה. רצף ה-DNA הרצוי נלכד בו זמנית מאחור ומשתנה עם קלטת ההחדרה לפלסמיד השיבוט המשנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו קומבינציה סטנדרטית, הוא שניתן לבצע בניית וקטור מכוון גנים בתגובה אחת.

כדי להתחיל לתכנן אוליגוסים עבור קלטת ההחדרה ועיצוב הפלסמיד של תת-השיבוט, כל אוליגו כך שהוא מכיל 180 זרועות הומולוגיה של זוגות בסיסים המאגפים את אתר היעד הגנומי ו-20 זוגות בסיסים, רצף תחול ספציפי לקלטת ההחדרה או פלסמיד השיבוט המשנה. לאחר מכן, קבע את הכיוון של הכנסת ה-DNA הגנומית של השיבוט האחורי באמצעות כלי מבוסס אינטרנט כמו שיבוט db. קבע את כיוון השכפול מ- או ES על ידי בדיקת מפת עמוד השדרה של הפלסמיד האחורי המשמש בגב.

בניית ספרייה, הוסף שני קשרי פוספו טרמינליים שמונה, כך שחמשת הקצה הראשוני של האוליגו נמצא מול כיוון השכפול על השיבוט האחורי. לאחר מכן, הוסף שינוי של חמישה פוספטים ראשוניים לאוליגו ההפוך. ראשית דוקרים קצה פיפטה סטרילי לתוך תרבית האגר האחורית ומחסן 5.0 מיליליטר מרק אודין.

גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר מכן, מצננים, תמיסת גליצרול 10%, מיקרו צנטריפוגה, צינורות ואלקטרופורציה, קובטות על מקרר קרח, צנטריפוגות גדולות בקירור ומיקרו צנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, קבע את הצפיפות האופטית של התרבית באמצעות ספקטרופוטומטר.

מדידת ספיגה. ב-600 ננומטר. הכן את התאים המוכשרים האלקטרו כאשר מגיעים לקריאת OD 600 של 0.3 עד 0.8.

כאשר התרבית מוכנה, סובב את התאים בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. שוטפים את התאים במיליליטר אחד של גליצרול 10% צונן וסובבו שוב. בצע את שלבי הכביסה הללו בסך הכל שלוש פעמים.

השעו מחדש את התאים בנפח כולל של 50 מיקרוליטר והוסיפו 10 עד 200 ננוגרם של הפלסמיד המחודש. השג תרחיף תא בודד על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן העבר את התאים לאלקטרופורציה לפני צינון. ווט. לאחר מכן, הכניסו את הווט למכשיר אלקטרופורציה והפעילו את התאים מיד לשחזר את התאים במיליליטר אחד של LB ולהעביר את התאים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

גדל את תרבית הגב ב-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר זמן זה, הוסף תשעה מיליליטר LB לתרבית המשוחזרת. גדל בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד כדי לשלב את זרועות ההומולוגיה בקלטת ההחדרה ובפלסמיד השיבוט הסוב-ק.

בצע PCR באמצעות האוליגו ששונו זמן רב שהוכנו קודם לכן. לחלופין, ליניאריזציה של תבנית הפלסמיד באמצעות אנזים הגבלה, בחר אחד שחותך מחוץ לאזור הגברת ה-PCR ומופעל בחום. הגדר את ה-PCR באמצעות מערכת התחלה חמה בנאמנות גבוהה, DNA פולימראז.

הכן תערובת מאסטר PCR ובצע רכיבה תרמית על פי שיטות עבודה מומלצות. לאחר התגובה, נתח מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל AROS. טען 1 עד 5 מיקרוליטר מכל PCR על ג'ל 1%aros.

לאחר מכן, טהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR. כמת את ה-DNA המוגבר של ה-PCR מול קבוצה ידועה של תקני DNA או באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. לאחר דגירה של לילה, יש לדלל את תרבית ה-GBAA האחורית פי 50 ולהכין תרבית נפרדת לבקרה שלילית.

מגדלים את התרביות המדוללות ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך שעה ו-50 דקות. לאחר מכן, צננו את כל החומרים והציוד המשלבים מחדש לארבע מעלות צלזיוס כפי שהודגם קודם לכן. הכן תמיסה של 10% משקל לנפח של OSE ועקר מסנן דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרון.

כאשר ה-OD של התרבות האחורית מגיע לרמה הרצויה, המשך בהשראת החלבונים המשולבים מחדש. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסה 10% ערבית ל-10 מיליליטר של תרבית הגב כדי להשיג ריכוז aose סופי של 0.2%כלול תרבית לא מושרית שתשמש כבקרה שלילית. העבירו את התרביות לאינקובטור טלטול של 37 מעלות צלזיוס והשרו הבעה אדומה למשך 45 דקות עם טלטול ב-230 סל"ד.

סובבו את התאים ושטפו עם 10% גליצרול שלוש פעמים כפי שהוצג קודם לכן ב-600 עד 1000 ננוגרם. כל אחת מקלטות ההכנסה והפלסמיד של שיבוט המשנה לתגובת הקומבינציה מחדש כוללים וקטור בלבד ובקרת הכנסה וקטורית בתוספת יחידה כדי לבדוק את מיומנות הרקומבינציה ושלמות הווקטור. לאחר מכן, השג תרחיף תא בודד והפעל את התאים אלקטרו כפי שהוצג קודם לכן.

אפשר התאוששות במדיה LB ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עבור פלסמידים מרובי עותקים או ב-10 פאונד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות עבור וקטורים אחוריים. השלם דילולים שונים עם התרבות המשוחזרת בבחירה כפולה. אגר בבקשה וגדל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

כשהוא מוכן, בחר מושבות לחמישה מיליליטר LB המכילים את האנטיביוטיקה הסלקטיבית וגדל בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בערכת טיהור עמודות כדי להכין מיני DNA הכנה, הכנס את אנזים ההגבלה המתאים ולאחר מכן זהה את השיבוטים המכילים את גדלי השברים הצפויים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. לבסוף, בצע ריצוף DNA על פני זרועות ההומולוגיה וקלטת ההחדרה כדי לבדוק אם יש שגיאות פוטוסינתזה של אולי.

בדוגמה זו, ניתוח עיכול הגבלה של P שני RX תוספת EYFP אחת המכילה שיבוטים הראה את הדפוס הצפוי המצביע על כך שהם מכילים את וקטור הנוקין שהורכב כהלכה. סכימה זו ממחישה את הרעיון של זמירה של בקט. שימוש בשיבוט משנה בתוספת ניתוח החדרה של מוצרי PCR אישר כי קלטות שולבו כהלכה.

בנוסף, כאשר נותחו שיבוטים אחוריים חיוביים לאחר הוספת אנזים ההגבלה המתאים, התקבל הדפוס הצפוי. ניתוח עיכול הגבלה של 12 אמר R SR שני שיבוטי SBI הראו הרכבה וקטורית נכונה ברוב הרקומביננטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות וקטורים מכוונים לגנים במהירות באמצעות תת-שיבוט פלוס הכנסה.