Name: Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: למדו לבנות וקטורי גן מיקוד ב-E. coli בשיטת subcloning plus insertion המהירה. שיטה זו מאפשרת יצירת וקטורים מותאמים אישית בתגובה אחת, ומשפרת את יעילות הנדסת הגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T.R.R הגה את הפרויקט, תכנן וביצע ניסויים והכין את כתב היד. E.J.K ו-S.E.M ביצעו ניסויים. כל המחברים תרמו אינטלקטואלית לכתב היד הסופי. עבודה זו מומנה על ידי מלגת חדשנות של אוניברסיטת לסטר ל-SEM ועל ידי מלגת מחקר בכירה של מועצת המחקר הרפואי הבריטית (MRC) ל-S.M.C (MR/J009202/1). ריצוף ה-DNA בוצע על ידי מעבדות חלבון וחומצות גרעין (PNACL), המרכז לשירותי ביוטכנולוגיה מרכזיים, אוניברסיטת לסטר. ברצוננו להודות ל- A. Francis Stewart על אספקת הפלסמידים Rox ו- Dre. פלסמידים pL451 ו-pL452 התקבלו מהמכון הלאומי לסרטן (NCI), פרדריק, ארה"ב.

1. גן מיקוד עיצוב <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין שיבוט מתאים BAC המכסה את האזור הגנומי של עניין. ודאו שזה isogenic לסוג של תאי גזע עובריים להיות שונה למשל, שיבוטים RPCI-23 וRPCI-24 BAC לגן מיקוד עם C57BL / 6 ES תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל גן קונבנציונלי מיקוד קריטריונים בעת תכנון וקטור המיקוד. פרמטרים עיקריים כוללים אם נדרש השינוי להיות מכונן או מותנה, הגדרת אקסונים קריטיים (CE) למחיקה באסטרטגיה גן בנוקאאוט ומרווח ומיקום של קלטות אינטרוניים. הערה: כל אחד מהם כבר דן בפירוט במקום אחר 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזורים הגנומי כל אחד מ5-6 קילו איגוף אתר שינוי היעד. הערה: הגודל של להכניס את subcloned לכן בדרך כלל 10-12 קילו, אם כי הגבול העליון יכול להיות גבוה ככל 80 kb עם העתק נמוך subcloning פלסמיד כמו p15A, pBR322 וכו &#39;ועד 200 kb עם BACוקטור. </li></ol> 2. Multiplex Recombineering oligos <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> oligos עיצוב לשדרת פלסמיד (פלסמיד subcloning) והסמן לבחירה (קלטת הכנסה). עיצוב כל אוליגו כך שהוא מכיל 180 HA נ&quot;ב איגוף אתר היעד הגנומי ו -20 נ&quot;ב של רצף תחול ספציפי של קלטת ההכנסה או פלסמיד subcloning (איור 2). הערה: זרועות הומולוגיה לא צריכים להכיל את כל אלמנטים חוזרים, הנוכחות של אלמנטים חוזרים תגרום למיקוד וsubcloning שגויים. ניתן לאתר אלמנטים חוזרים על ידי שימוש בכלים מבוסס אינטרנט כגון &#39;&#39; חזור Masker &#39;&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל אתר ייחודי אנזים הגבלה (RE) באחת מoligos הווקטור כדי linearize וקטור גן מיקוד לתאי גזע עובריים מיקוד (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו פרמטרים אוליגו באמצעות תכנית מנתח אוליגו. תשמור על עצמך, כדי למנוע מבנים משניים באזור תחולs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצר יותר HA (50 נ&quot;ב) של קלטת ההכנסה נסבלת ומניב מספר נמוך יותר של recombinants אבל להבטיח שפלסמיד subcloning HA הוא תמיד ארוך יותר (180 נ&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכיוון של להכניס את הדנ&quot;א הגנומי של השיבוט בפרט BAC תוך שימוש בכלים מבוסס אינטרנט כמו &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. להקים את הכיוון של שכפול מOris על ידי לבדוק את המפה של עמוד השדרה פלסמיד BAC המשמשת לבניית ספריית BAC. הערה: Oris הוא בדרך כלל הפוך לכיוון תעתיק של סמן כלורמפניקול (CHL) לכל פלסמידים BAC הנפוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי איגרות חוב מסוף phosphorothioate (PTO) עד סוף &#39;5 של אוליגו שהוא מנוגד לכיוון של שכפול על שיבוט BAC. הוסף שינוי 5 פוספט &#39;לאוליגו ההפוך (איור 2). הערה: קלטת PCR phosphorothioated א-סימטרית על עיכול אדום מייצרת ssDNA ביניים שראש יכול גדיל מפגרשל מזלג השכפול. הערה: מקסימאלי תדירות רקומבינציה זמנית הוא ציין עם הקלטות מוגנות הגדיל המפגר. גדיל מוביל מוגן או קלטות מוגנות כפולים לא יכולות לייצר את יעילות רקומבינציה שווה בכמה לוקוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין oligos עם עמוד או טיהור HPLC. </li></ol> 3. שינוי Clone BAC עם pSC101 BADgbaA Recombineering פלסמיד. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפוך את ה זן coli הנושא את recombineering BAC הבקיא, להפוך אותו עם פלסמיד pSC101 BADgbaA המכיל את הגנים אדומים 16. הערה: פלסמיד pSC101 BADgbaA מכיל את הגנים אדומים וRecA תחת השליטה של אמרגן arabinose מושרה ARAÇ-P BAD, סמן בחירת טטרציקלין וreplicon pSC101 רגיש לטמפרטורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדקור קצה פיפטה סטרילית בתרבות אגר BAC ולחסן 5.0 מיליליטר של מרק lysogeny pH 8.0 המכיל 12.5 (LB)56; g מיליליטר -1 Chl. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות רועדות ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל 10% (v / v) פתרון גליצרול, צינורות microcentrifuge וcuvettes electroporation על קרח. מגניב צנטריפוגה בקירור גדולה וmicrocentrifuge עד 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הצפיפות האופטית (OD) של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר ולמדוד הספיגה ב 600 ננומטר. הכן תאי electrocompetent (כמפורט להלן) כאשר מגיעה קריאת 600 OD של 0.3 עד 0.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר בצנטריפוגה גדולה ב1,216 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של גליצרול 10% המצוננים ומסובב את תאים ב17949 XG במשך 20 שניות על 4 מעלות צלזיוס. לבצע שטיפת צעד כוללת של 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בהיקף כולל של 50 μl של גליצרול 10% ולהוסיף 10-200 ng של פלסמיד recombineering pSC101 BADgbaA. לקבל השעיה תא בודדת על ידי pipettingמעלה ומטה מספר פעמים ולאחר מכן להעביר את התאים קובט electroporation פער 1 מ&quot;מ טרום צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate התאים עם הגדרה של 1.8 KV, 25 μF ו -200 Ω. הערה: בדוק את ההגדרות הנכונות עבור כל מותג של electroporator. קבוע זמן של electroporation פחות מ -4 מעיד על קיומו של מלח וזיהומים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לשחזר את התאים ב 1 מיליליטר של LB ולהעביר את תאי צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות gbaA BAC ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות רועדות ב 200 סל&quot;ד. הערה: פלסמיד pSC101 BADgbaA הולך לאיבוד כאשר תאים גדלים על 37 מעלות צלזיוס בשל איון של גורם שכפול RepE הטמפרטורה רגישה. לגדל תאי gbaA על 30 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פונקציות recombineering. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיליליטר של LB המכיל 12.5 מיקרוגרם מיליליטר -1 Chl ו -4 מיקרוגרם מיליליטר -1 טטרציקלין (ט) לתרבות gbaA BAC התאוששה. לגדולO BAC gbaA התרבות / N ליום 30 ב &#160; ° C רועד ב 200 סל&quot;ד. הערה: יעילות השינוי של electroporating פלסמיד gbaA supercoiled היא גבוהה מספיק כדי לאפשר O צמיחת הרוויה / N בתקשורת נוזלית. </li></ol></li></ol> 4. הכנת הכנסת קלטות וsubcloning פלסמידים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב HA לקלטת ההכנסה (ים) ופלסמיד subcloning, לבצע תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), תוך שימוש oligos הארוכה שונה כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי למנוע שריד פלסמיד לתגובת recombineering, להשתמש מוצא R6K או תבנית פלסמיד טווח מארח הצר דומה כדי להגביר את קלטת ההכנסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, linearize תבנית פלסמיד באמצעות לעכל RE (טבלה 2). בחר RE שחותך מחוץ לאזור ההגברה PCR וחום מומת. חום להשבית RE כפי שהומלץ על ידי manufacturer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת השרשרת של פולימראז (PCR), תוך שימוש במערכת ה- DNA פולימראז hotstart באיכות גבוהה. הכן תערובת אמן PCR כמפורט (לוח 3). לבצע רכיבה תרמית כפי שמוצג (לוח 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוצרי ה- PCR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. עומס 1-5 μl של כל PCR על 1% (w / v) agarose ג&#39;ל המכיל 0.5 מ&quot;ג מיליליטר -1 Ethidium ברומיד (EtBr). הערה: הנוכחות של מוצרי הגברה שאינן ספציפיים אינה מתערבת בתגובת recombineering. במקרים מסוימים עם זאת, פריימר-הדימרים עלולים להפחית את יעילות recombineering. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להסיר את תבנית פלסמיד מPCRs על ידי טיפול עם DpnI אחריו לנקות PCR. DNA Elute בנפח מינימאלי של מים ללא יונים סטרילי (כפי שהומלץ על ידי היצרן). הערה: תוספת של DpnI לקנה בלתי תוצאות PCR תגובות ביעילות מופחתת של מחשוף של התבנית ה- DNA פלסמיד מפוגל דואר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת DNA PCR מוגבר על ידי ניתוח agarose ג&#39;ל נגד קבוצה ידועה של תקני ה- DNA למשל, λ HindIII לעכל או באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop. </li></ol> 5. subcloning Plus הכנסה <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את O / לקפל N BAC gbaA תרבות 50 על ידי הוספת 200 μl 10 מיליליטר LB + Chl + ט. לגדול ב 30 &#160; ° C רועד ב 200 סל&quot;ד עבור שעה 1 50 דקות. כולל מדגם לשמש כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל כל חומרים והציוד לrecombineering 4 ° C כמתואר בשלב 3.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים pH אגר LB 8 צלחות המכילות ריכוז הנכון של האנטיביוטיקה המתאימה סלקטיבית (ים) שתאפשר בחירה של בר דנ&quot;א, כמו גם לבחירה של וקטור subcloning (לוח 4). הערה: אנטיביוטיקה חלקם pH רגיש. השימוש LBpH אגר 8 ככלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10% (w / v) פתרון של L-arabinose. סנן לעקר דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר. הערה: arabinose גורם ביטוי של חלבוני recombineering מפלסמיד gbaA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את OD של תרבות gbaA BAC באמצעות ספקטרופוטומטר. ברגע שOD 600 של .25-0.3 הוא הגיע, לגרום לחלבוני recombineering כפי שמתוארת בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של פתרון arabinose 10% עד 10 מיליליטר של תרבות BAC כדי להשיג ריכוז סופי של arabinose של 0.2%. כולל תרבות uninduced (ללא arabinose) לשמש כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תרבות BAC ל-37 &#160; ° רועד C חממה וגורם לביטוי אדום במשך 45 דקות רועדות בסל&quot;ד 230. הערה: הביטוי של חלבונים אדומים הוא לא יעיל ליום 30 במעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים ולשטוף עם גליצרול 10% 3 פעמים כמתואר בשלב 3.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600-1,000 ng כל אחד מפלסמיד subcloning וקלטת ההכנסה (ים) תגובת recombineering. כולל וקטור בלבד ווקטור תוספת בקרות להוסיף יחידים לבדוק את מיומנות רקומבינציה ויושרה של הווקטור והקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל השעיה תא בודדת על ידי pipetting מעלה ומטה. בצע electroporation כמתואר בשלב 3.1.7 והתאוששות שלאחר מכן ב 1 מיליליטר LB ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לרב-עותק פלסמידים או 10 מיליליטר של LB ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות עבור וקטורי BAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים שונים צלחת למשל התרבות התאושש, 90%, 10%, 1% על הצלחות אגר בחירה הכפולה ולגדול ב 37 &#160; ° C במשך 16 שעות. </li></ol> 6. ניתוח של recombinants <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: בחר 6-12 מושבות ולבצע מושבה PCR באמצעות פריימר איגוף HA ופריימר הספציפי להוסיף. כולל פלסמיד subcloning וCAS ההכנסהפלסמיד Sette כמו גם שיבוט BAC ההורה כפקדים שליליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח agarose ג&#39;ל של PCRs המושבה. לזהות שיבוטים חיוביים על ידי הנוכחות של להקה בהירה בגודל הצפוי. הערה: היעילות הגבוהה של תהליך שיבוט SPI מייצרת recombinants הנכון בעיקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות לתוך 5 מיליליטר pH LB 8 המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית ולגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן minipreps DNA באמצעות ערכת טיהור עמודה לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BAC miniprep DNA באמצעות בידוד פנול, כלורופורם סטנדרטי או פרוטוקול דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מעכלים RE על DNA miniprep. DNA נפרד על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. לנתח את דפוסי RE לזהות שיבוטים המכילים את גדלי שברים הצפויים של וקטור המיקוד הנכון. בחר RE שמפלה בין להכניס הווקטור חסר (ים) ואת הווקטור המכיל את התוסף (ים) באופן ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Optioסופי: להשיג תאים שהם מחוסרים BAC, שעדיין קיים בE. coli לאחר recombineering, להשתמש DNA פלסמיד miniprep להפוך DH5alpha או DH10B E. תאי coli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע רצפי DNA על פני HA וקלטת הכנסה כדי לבדוק שגיאות סינתזת אוליגו. </li></ol>

<ol><li>Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+1+%28HDAC1%29%2C+but+not+HDAC2%2C+controls+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).</li>
<li>Harvey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+carcinogen-induced+tumorigenesis+in+p53-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice.</a> Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).</li>
<li>Waterhouse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoproliferative+disorders+with+early+lethality+in+mice+deficient+in+Ctla-4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4.</a> Science. 270, 985-988 (1995).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+of+homology+required+for+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).</li>
<li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+beta-globin+locus+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317, 230-234 (1985).</li>
<li>Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+transgene+insertion+into+human+chromosomes+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors.</a> Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).</li>
<li>Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-strand-break+repair+model+for+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The double-strand-break repair model for recombination.</a> Cell. 33, 25-35 (1983).</li>
<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-256 (1984).</li>
<li>Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFu%2C+J+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+logic+for+DNA+engineering+using+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).</li>
<li>Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+by+ET-recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+homologous+recombination-based+method+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering.</a> Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+recombineering+approach+by+adding+RecA+to+%CE%BB+red+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination.</a> Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).</li>
<li>Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+recombineering+plasmids+for+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria.</a> Gene. 379, 109-115 (2006).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RecE+enhances+linear-linear+homologous+recombination+and+facilitates+direct+cloning+for+bioprospecting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting.</a> Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).</li>
<li>Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecE%2FRecT+and+Redalpha%2FRedbeta+initiate+double-stranded+break+repair+by+specifically+interacting+with+their+respective+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners.</a> Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).</li>
<li>Maresca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+heteroduplex+intermediates+in+lambda+Red+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination.</a> BMC Mol. Biol. 11, 54(2010).</li>
<li>Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red+recombineering+in+Escherichia+coli+occurs+through+a+fully+single-stranded+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate.</a> Genetics. 186, 791-799 (2010).</li>
<li>Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+recombineering-based+method+for+generating+conditional+knockout+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations.</a> Genome Res. 13, 476-484 (2003).</li>
<li>Chan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+based+approach+for+high-throughput+conditional+knockout+targeting+vector+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction.</a> Nucleic Acids Res. 35, e64(2007).</li>
<li>Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+by+homologous+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli.</a> Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).</li>
<li>Lee, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+Escherichia+coli-based+chromosome+engineering+system+adapted+for+recombinogenic+targeting+and+subcloning+of+BAC+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA.</a> Genomics. 73, 56-65 (2001).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li>
<li>Valenzuela, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+of+the+mouse+genome+coupled+with+high-resolution+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis.</a> Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoproteomics+profiling+of+HDAC+inhibitors+reveals+selective+targeting+of+HDAC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes.</a> Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).</li>
<li>Mulryan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+vas+deferens+contraction+and+male+infertility+in+mice+lacking+P2X1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors.</a> Nature. 403, 86-89 (2000).</li>
<li>Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+basis+of+processivity+in+lambda+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).</li>
<li>Antoch, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li>
<li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150(2012).</li>
<li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+use+of+YACs%2C+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li>
<li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+trimming%3A+minimizing+clone+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
</ol>

T.R.R הוא הממציא של בקשת פטנט בריטית על טכנולוגיית רקומבינר מולטיפלקס.

בנייה של שורות תאי גזע עובריים ומודלי עכבר היסטורי מעורבת גן המיקוד באמצעות בונה פלסמיד המכילה את האלל שונה 4. עם זאת, הבנייה של וקטורי גן המיקוד המורכבים אלה הוכיחה את עצמו צוואר בקבוק משמעותי בזמן הייצור של מודלים כאלה. פיתוח אסטרטגיות בניית וקטור recombineering מבוסס אפשר עיצובי וקטור משופרים והרכבת וקטור יעילה יותר. עם זאת, פרוטוקולי recombineering הנוכחיים עדיין כרוכים שלבים מרובים, דורשים טיהור פלסמיד ביניים ולהשתמש זני חיידקים שונים. Subcloning הכנסה בתוספת מציע גישה חדשנית לבניית וקטור שניתן לבצע באירוע electroporation אחד בזן מארח BAC תושב. השירות של SPI במיקוד גן נבדק כאן במגוון רחב של יישומי בניית וקטור. בכל המקרים שנבדקו כאן, SPI הוכיח להיות יעיל ופלסמיד רקומביננטי הנכון הופק.ברוב המכריע של המקרים, הקלטות שונות מרובות הוכנסו בצורה נכונה בוקטור המיקוד. קלטות DNA גדולות ווקטורים שוכנו בקלות בפרוטוקול SPI והפגינו הגמישות של מערכת זו. SPI מסתמך על השימוש ברצפי הומולוגיה ארוכים והגנת phosphorothioate (PTO) של קלטות DNA ליניארי. שינוי PTO מקנה הגנה מפני exonucleases לDNA ליניארי 20,21 וHA הארוך מגביר את יעילות רקומבינציה להתיר ריבוב. עם זאת, סינתזה של רצפי אוליגו יותר מגדילה את הסיכוי של צבירת שגיאות במיוחד מחיקות. מוטציות באוליגו יכולות להיות הרסניות, במיוחד אם הם מכסים אזורי חלבון קידוד. רצפי DNA על פני HA ומכסה את האורך המלא של הקלטת הוכנסה מומלץ מאוד לחסל את השיבוטים עם כל שינויי רצף. שימוש במערכת ה- DNA פולימראז באיכות גבוהה גם הציעה להימנע מהקדמה שלשגיאות y PCR. האורך ובהרכב של HA של פלסמיד subcloning הוא יותר קריטי ביחס לזה של קלטת ההכנסה (מידע לא מוצג). עבור יישומים רגישים במיוחד כמו הבנייה של וקטורים להתרפק, שבו מוטציות כל באזורי אקסון אינן נסבלות, HA של קלטת ההכנסה יכול להתקצר (50-120 נ&quot;ב), כדי למנוע בעיות הקשורות לoligos הארוכה. קלטת ההכנסה גם ניתן להשאיר phosphorothioated ללא שינוי או הכפול (שבו ידע של הכיוון של שכפול אינו זמין). אבל ריבוב במקרים אלה עדיין דורש מוגנים ארוך פלסמידים subcloning HA. אזהרה של אסטרטגיה המסוימת הזה היא הפחתת יעילות ריבוב שעשוי להשפיע על שיבוט SPI בלוקוסים שונים. האורך של קלטת ההכנסה ופלסמיד subcloning הוא עוד פרמטר חשוב בשיבוט SPI. מולקולות DNA גדולות electroporate פחות ביעילות ובהשפעה מצטברת, ניתנו מחדשquirement להציג את כל הקלטות באותו התא (מידע לא מוצג). הריבוב הוא יעיל ביותר עם קלטות הכנסה קטנות יותר. DNA שברים גדולים יותר מאשר 3 kb גם להציב גבול על עיבוד ssDNA האדום בתיווך, שהוא יעיל ביותר עד 3 kb 30. קלטות הכנסה עולה על 3 קילו הן כפולים resected ולשלב מחדש בצורה פחות יעיל באמצעות מסלול עצמאי בטא 20. לכן, הקרנה של מושבות מספיק כדי לזהות את השיבוט הנכון הופכת להיות חשובה במקרים אלה. משך זמן ארוך יותר של פוסט electroporation רקומבינציה גם מגדיל את סיכויי ההחלמה של השיבוט הנכון בתרגילי SPI קשים. עד ארבע קלטות קטנות (&lt;1.5 kb) יכול להיות מוכנסת בו זמנית עם תהליך SPI, אם כי יעילות הריבוב יורדת עם כל קלטת נוספת (מידע לא מוצג). עם זאת, זה משקף את התוצאה של ניסוי SPI אופטימלי ורצוי לשקול את גבולות ריבוב בעת שימוש רבים קלטות גדולות. </p&gt; הפיתוח של כלים לעריכת הגנום כמו חזרות palindromic קצרות interspaced באופן קבוע התקבצו מערכת (CRISPR) endonuclease -cas9 אפשרה יצירת שינויי הגנום רומן והובילה להנדסת הגנום יעילה יותר 36. עם זאת, טכנולוגיות חדשות יותר אלה משלימים וקטורי גן מיקוד ולא תפסו את מקומן. זה שחזה כי מערכת CRISPR-CAS יכולה להחליף בחירת אנטיביוטיקה ולהמשיך ולעדכן את פרוטוקול recombineering זמנית.

הפיתוח של טכנולוגיות מיקוד גן אפשר הבנייה של שורות תאים ובמודלים עכבר כדי לחקור מערכות ביולוגיות שונות 1-3. שלב ראשון מפתח בשינוי של רצף הגנומי הוא התכנון והבנייה של גן מיקוד וקטור 4. וקטורי מיקוד הם בונה פלסמיד הנושאות את האלל של עניין המכיל את השינויים הרצויים (ים) מוקף סמן בחירה (למשל, נאומיצין), ואזורים הגנומי ארוכים הנדרשים לרקומבינציה ההומולוגית יעילה בתאי יונקים 5. שינוי גנטי מדויק מושגת על ידי כניסתה של וקטור המיקוד לתאי גזע עוברי (ES) 6 או 7 תאים סומטיים, לפי רקומבינציה הומולוגית בין מתיחות זהות של רצף ה- DNA על וקטור המיקוד ואת תוצאות המוקד הגנומי בהעברת השינוי המיועד לגנום על ידי המרה גן 8. modifi כזהניתן להזריק תאי גזע עובריים לed blastocysts עכבר כדי לייצר צאצאים (תעתועים), כי אז יכולים לשדר אללים שונה אלה באמצעות תאי המין 9. תוואי חלופי כדי לייצר עכברים הטרנסגניים כרוך microinjection של וקטור ביטוי גנים לzygotes עכבר תאי יחיד, מה שמוביל לשילוב של הווקטור בגנום העכבר 10 האקראי. שיטות מסורתיות של בניית וקטור יש לסמוך על קונבנציונלי &quot;לגזור ולהדביק&quot; שיבוט באמצעות אנזימי הגבלה וligases DNA לשבט הסמן שונה בחירה ושברים הגנומי לשדרת וקטור. עם זאת, גורם טבוע הגבלה של שיבוט מסורתי הוא הבחירה של אתרי הגבלה והמיצוב, במיוחד עם רצפי DNA עוד. זה לעתים קרובות מחייב צעדי subcloning מרובים וגם מציג רצפי DNA זרים לתוך הווקטור, אשר מוביל לעתים קרובות ליעילות נמוכה של גן המיקוד. Recombineering (eng recombinogenicineering) היא טכנולוגית הנדסת DNA שמתגברת על מגבלות אלה באמצעות רקומבינציה ההומולוגית (HR) בתיווכו של חלבוני רקומבינציה הפאג בE. תאי coli 11,12. מאז כל אזור של רצף הומולוגי יכול לשמש כמצע של recombineering, אילוצי הזמינות של אתרי הגבלה יוסרו. רצפי DNA גדולים יכולים להיות שונה בצורה חלקה ישירות in vivo, וכך גם שמירה על השלמות המבנית שלהם 13. Recombineering הוא מאוד יעיל עם הומולוגיות קצרות (50 נ&quot;ב) 14 ולכן זרועות הומולוגיה (HA) יכולות להיות משולבות בצורה נוחה רצפי אוליגו סינטטיים. בניסוי טיפוסי recombineering, אוליגו או שבר כפול DNA גדילים (dsDNA) המכיל HA הוא electroporated לתוך E. המוסמך recombineering תאי coli המכילים את היעד ממוקם גם על כרומוזום או על פלסמיד 15. פוטנציאל רקומבינציה מוענק על ידי ביטוי מושרה של rec האדוםombination חלבונים של הפאג 16,17 או חלבוני RecET של prophage RAC 18. Exonuclease האדום / Rece ממיר dsDNA ליניארי לדנ&quot;א חד-גדילים (ssDNA) ביניים, שהוא חייב לאחר מכן על ידי שותפתה, אדום / rect, חלבון חד-גדילי חישול (SSAP) 19. חישול של ssDNA ארוך או קצר לאוליגו רצף היעד המשלים שלה מתרחש בגדיל המפגר של מזלג השכפול ומוביל לשילוב של הרצף באתר היעד. מפגר רקומבינציה ssDNA גדיל הוא בסיס ליעילות הגבוהה של recombineering ויכול להיות מתואר על ידי 20,21 מודל רקומבינציה &#39;ביתא&#39;. עבודה recombineering אופיינית לבנות וקטור גן מיקוד כרוך אחד משני המסלולים הבאים. מסלול אחד כרוך subcloning אזור גנומי הרצוי משיבוט BAC העכבר לפלסמיד ואחרי ההחדרה רציפה של אתרי רקומבינציה LoxP, סמן בחירה <sעד&gt; 22 וכו &#39;, או את המסלול החלופי כרוך מיקוד המוקד הגנומי BAC עם אלמנטי וקטור מיקוד השונים על ידי מספר סיבובים של recombineering 10,23 ולאחר מכן subcloning המוקד שונה לפלסמיד על ידי תיקון פער ​​שיבוט 24,25. וריאציות על הנושא הזה כבר בשימוש בצינורות recombineering תפוקה גבוהה שונים, כחלק מתוכניות ייצור עכבר גדול 26,27. עם זאת, הליכים אלה כרוכים בשלבים מסובכים וארוכים, דורשים השימוש בוקטורים מיוחדים וא coli זנים (למשל, Cre לבטא בתאים) ולנצל את צעדי ביניים אחת או יותר מטיהור DNA וקטור מחדש שינוי (טבלה 1). Subcloning הכנסה בתוספת (SPI) הוא טכניקת recombineering רומן המשלבת רקומבינציה בטא ותיקון פער ​​שיבוט לתהליך יחיד (איור 1). ההרכבה וקטור SPI היא פשוטה, מהירה וגמישה, ומציעה שיפור משמעותי בrecombi הסטנדרטיneering גישות (טבלת 1). הנה, אנחנו מדגימים את הקלות ואת השירות של שימוש SPI עבור יישומי בניית וקטור שונים עם דגש מיוחד על בניית עיצובי וקטור שאינם סטנדרטיים ומאתגרים. מקרי מבחן כללו בניית וקטור להתרפק כתב ניאון, וקטור להתרפק ביטוי חלבון מתויג כפול, וקטור כתב ניאון BAC ווקטור נוקאאוט מותנה. אלה בחנו דרכים שונות הדרישה למקם קולט פני תא, לטהר מורכב חלבון גרעיני או על תנאי לקטוע הביטוי של גן.

<table><tbody><tr><td>אנטיביוטיקה למעט זאוצין</td><td>סיגמא: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>אמפיצילין, A9518-5G; כלורמפניקול , C1919-5G; בלסטיצידין, 15205-25 מ"ג; גנטמיצין, G1264-50MG; היגרומיצין, H3274-50MG; קנמיצין,: K1876-1G; טטרציקלין הידרוכלוריד, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin זמין גם משיבוטי Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>ניתן להשיג שיבוטי RPCI-23 או RPCI-24 BAC</td><td>129/Sv BAC מ-Invivogen או Life technologies/</td></tr><tr><td>Fisher KOD hotstart DNA polymerase system</td><td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>אוליגוס ארוך</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; קישור גנים: https://www.genelink.com</td><td>IDT Ultramers או Gene Link אוליגוס ארוכים</td><td>PTO ופוספוספט זמינים כשינויים מותאמים אישית. טיהור PAGE מומלץ בחום לאוליגו ארוך.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR של MinElute</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>עדיפות ערכות טיהור PCR עם פליטה מינימלית.</td></tr><tr><td>ערכת הכנה למיני ספין QIAPrep</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>עדיפות עמוד סיליקה או ערכות מטריצה דומות.</td></tr><tr><td>אנזימי הגבלה</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>ראה אתר NEB לרשימה של RE.</td></tr></tbody></table>

subcloning plus ההכנסה (spi) - recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

מיקוד גנים מתייחס לשינוי מדויק של מיקום גנטי באמצעות רקומבינציה הומולוגית. יצירת קווי תאים חדשים ומודלים של עכברים טרנסגניים בשיטה זו מחייבת בניית וקטור 'מטרה', המכיל רצפי DNA הומולוגיים לגן המטרה, ומהווה במשך שנים רבות צעד מגביל בתהליך. ניתן לבצע בניית וקטור in vivo בתאי Escherichia coli באמצעות רקומבינאזות הומולוגיות בתיווך רקומבינאזות פאג'ים בטכניקה הנקראת רקומבינריה. רקומבינר הוא הטכניקה המועדפת לשיבוט רצפי ההומולוגיה הארוכים (>4kb) ורכיבי מיקוד שונים כולל סמני בחירה הנדרשים לתווך חילופי אללים יעילים בין וקטור מיקוד למיקום הגנומי הקוגנטי שלו. פרוטוקולי קומבינר טיפוסיים עוקבים אחר סכימה איטרטיבית של אינטגרציה צעדית של מרכיבי המיקוד ודורשים שלבי טיהור וטרנספורמציה ביניים. כאן, אנו מציגים מתודולוגיית קומבינר חדשה של הרכבת וקטור באמצעות גישת מולטיפלקס. תיקון פער פלסמיד מתבצע על ידי לכידה בו זמנית של רצף גנומי מספריות כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים של עכבר והכנסת סמני בחירה כפולים של חיידקים ויונקים. שיטת תת-שיבוט פלוס החדרה זו יעילה ביותר ומניבה רוב של רקומביננטים נכונים. אנו מציגים נתונים לבנייה של סוגים שונים של וקטורים מדווחים של גנים מותנים שנבנו בשיטה זו. בניית וקטור SPI מרחיבה מאוד את הרפרטואר של ארגז הכלים המשולב מחדש ומספקת שיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לבניית וקטורים מורכבים אלה.

ניתן להשתמש במתודולוגיות מיקוד גנים כדי ליצור עכברים טרנסגניים עם אללים נוק-אאוט, נוק-אין ומתויגים. כאן, אנו מתארים שיטה משופרת של קומבינר מחדש ב-E. coli, שאנו מכנים 'תת-שיבוט פלוס הכנסה', שניתן להשתמש בה כדי ליצור וקטורים מכוונים לגנים מותאמים אישית במהירות.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבנות וקטורים מכוונים לגנים באמצעות תת-שיבוט פלוס החדרה. זה מושג על ידי הפיכת הגב המכיל אי קולי עם פלסמיד מחדש. השלב השני כולל יצירת קלטות החדרה זרחניות אסימטריות, ופלסמידים תת-שיבוט על ידי תגובת שרשרת פולימראז.לאחר הוספת ארבינוז, חלבוני השילוב מחדש של GBAA באים לידי ביטוי וקלטת ההחדרה הטרמינלית שהשתנתה ופלסמיד תת-שיבוט עוברים אלקטרופורציה. רצף ה-DNA הרצוי נלכד בו זמנית מאחור ומשתנה עם קלטת ההחדרה לפלסמיד השיבוט המשנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו קומבינציה סטנדרטית, הוא שניתן לבצע בניית וקטור מכוון גנים בתגובה אחת.כדי להתחיל לתכנן אוליגוסים עבור קלטת ההחדרה ועיצוב הפלסמיד של תת-השיבוט, כל אוליגו כך שהוא מכיל 180 זרועות הומולוגיה של זוגות בסיסים המאגפים את אתר היעד הגנומי ו-20 זוגות בסיסים, רצף תחול ספציפי לקלטת ההחדרה או פלסמיד השיבוט המשנה. לאחר מכן, קבע את הכיוון של הכנסת ה-DNA הגנומית של השיבוט האחורי באמצעות כלי מבוסס אינטרנט כמו שיבוט db. קבע את כיוון השכפול מ- או ES על ידי בדיקת מפת עמוד השדרה של הפלסמיד האחורי המשמש בגב.בניית ספרייה, הוסף שני קשרי פוספו טרמינליים שמונה, כך שחמשת הקצה הראשוני של האוליגו נמצא מול כיוון השכפול על השיבוט האחורי. לאחר מכן, הוסף שינוי של חמישה פוספטים ראשוניים לאוליגו ההפוך. ראשית דוקרים קצה פיפטה סטרילי לתוך תרבית האגר האחורית ומחסן 5.0 מיליליטר מרק אודין.גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר מכן, מצננים, תמיסת גליצרול 10%, מיקרו צנטריפוגה, צינורות ואלקטרופורציה, קובטות על מקרר קרח, צנטריפוגות גדולות בקירור ומיקרו צנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, קבע את הצפיפות האופטית של התרבית באמצעות ספקטרופוטומטר.מדידת ספיגה. ב-600 ננומטר. הכן את התאים המוכשרים האלקטרו כאשר מגיעים לקריאת OD 600 של 0.3 עד 0.8.כאשר התרבית מוכנה, סובב את התאים בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. שוטפים את התאים במיליליטר אחד של גליצרול 10% צונן וסובבו שוב. בצע את שלבי הכביסה הללו בסך הכל שלוש פעמים.השעו מחדש את התאים בנפח כולל של 50 מיקרוליטר והוסיפו 10 עד 200 ננוגרם של הפלסמיד המחודש. השג תרחיף תא בודד על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן העבר את התאים לאלקטרופורציה לפני צינון. ווט. לאחר מכן, הכניסו את הווט למכשיר אלקטרופורציה והפעילו את התאים מיד לשחזר את התאים במיליליטר אחד של LB ולהעביר את התאים לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.גדל את תרבית הגב ב-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר זמן זה, הוסף תשעה מיליליטר LB לתרבית המשוחזרת. גדל בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד כדי לשלב את זרועות ההומולוגיה בקלטת ההחדרה ובפלסמיד השיבוט הסוב-ק.בצע PCR באמצעות האוליגו ששונו זמן רב שהוכנו קודם לכן. לחלופין, ליניאריזציה של תבנית הפלסמיד באמצעות אנזים הגבלה, בחר אחד שחותך מחוץ לאזור הגברת ה-PCR ומופעל בחום. הגדר את ה-PCR באמצעות מערכת התחלה חמה בנאמנות גבוהה, DNA פולימראז.הכן תערובת מאסטר PCR ובצע רכיבה תרמית על פי שיטות עבודה מומלצות. לאחר התגובה, נתח מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל AROS. טען 1 עד 5 מיקרוליטר מכל PCR על ג'ל 1%aros.לאחר מכן, טהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR. כמת את ה-DNA המוגבר של ה-PCR מול קבוצה ידועה של תקני DNA או באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. לאחר דגירה של לילה, יש לדלל את תרבית ה-GBAA האחורית פי 50 ולהכין תרבית נפרדת לבקרה שלילית.מגדלים את התרביות המדוללות ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-200 סל"ד למשך שעה ו-50 דקות. לאחר מכן, צננו את כל החומרים והציוד המשלבים מחדש לארבע מעלות צלזיוס כפי שהודגם קודם לכן. הכן תמיסה של 10% משקל לנפח של OSE ועקר מסנן דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרון.כאשר ה-OD של התרבות האחורית מגיע לרמה הרצויה, המשך בהשראת החלבונים המשולבים מחדש. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסה 10% ערבית ל-10 מיליליטר של תרבית הגב כדי להשיג ריכוז aose סופי של 0.2%כלול תרבית לא מושרית שתשמש כבקרה שלילית. העבירו את התרביות לאינקובטור טלטול של 37 מעלות צלזיוס והשרו הבעה אדומה למשך 45 דקות עם טלטול ב-230 סל"ד.סובבו את התאים ושטפו עם 10% גליצרול שלוש פעמים כפי שהוצג קודם לכן ב-600 עד 1000 ננוגרם. כל אחת מקלטות ההכנסה והפלסמיד של שיבוט המשנה לתגובת הקומבינציה מחדש כוללים וקטור בלבד ובקרת הכנסה וקטורית בתוספת יחידה כדי לבדוק את מיומנות הרקומבינציה ושלמות הווקטור. לאחר מכן, השג תרחיף תא בודד והפעל את התאים אלקטרו כפי שהוצג קודם לכן.אפשר התאוששות במדיה LB ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עבור פלסמידים מרובי עותקים או ב-10 פאונד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות עבור וקטורים אחוריים. השלם דילולים שונים עם התרבות המשוחזרת בבחירה כפולה. אגר בבקשה וגדל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.כשהוא מוכן, בחר מושבות לחמישה מיליליטר LB המכילים את האנטיביוטיקה הסלקטיבית וגדל בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בערכת טיהור עמודות כדי להכין מיני DNA הכנה, הכנס את אנזים ההגבלה המתאים ולאחר מכן זהה את השיבוטים המכילים את גדלי השברים הצפויים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. לבסוף, בצע ריצוף DNA על פני זרועות ההומולוגיה וקלטת ההחדרה כדי לבדוק אם יש שגיאות פוטוסינתזה של אולי.בדוגמה זו, ניתוח עיכול הגבלה של P שני RX תוספת EYFP אחת המכילה שיבוטים הראה את הדפוס הצפוי המצביע על כך שהם מכילים את וקטור הנוקין שהורכב כהלכה. סכימה זו ממחישה את הרעיון של זמירה של בקט. שימוש בשיבוט משנה בתוספת ניתוח החדרה של מוצרי PCR אישר כי קלטות שולבו כהלכה.בנוסף, כאשר נותחו שיבוטים אחוריים חיוביים לאחר הוספת אנזים ההגבלה המתאים, התקבל הדפוס הצפוי. ניתוח עיכול הגבלה של 12 אמר R SR שני שיבוטי SBI הראו הרכבה וקטורית נכונה ברוב הרקומביננטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות וקטורים מכוונים לגנים במהירות באמצעות תת-שיבוט פלוס הכנסה.

subcloning-plus-insertion-spi-novel-recombineering-method-for-rapid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הומולוגי רקומבינציה טכניקות מאוד...

Recombineering הומולוגי רקומבינציה בבונה<em&gt; דרוזופילה</em

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

כאן אנו מדווחים על שיטת עריכת גן מהירה ויעילה מבוססת על RMCE שעבר על מקורות AAVS1 של תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) המשפרת על מערכות שתוארו לעיל. באמצעות טכניקה זו, קווי isogenic יכולים להיוצר במהירות ובאמינות ללימודים השוואתיים נכונים, הקלת מחקר בתיווך transgenesis עם hPSCs.

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג' ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.

נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T

וירוס רקומביננטי הקשור באדנו (rAAV) נמצא בשימוש נרחב להעברת גנים קליניים ופרה-קליניים. שימוש לא מוערך מספיק עבור rAAVs הוא התמרה חזקה של תאים בתרבית ללא צורך בטיהור. עבור חוקרים חדשים ב-rAAV, אנו מספקים פרוטוקול לשיבוט קלטות טרנסגניות, ייצור וקטורים גולמיים והתמרה של תרביות תאים.

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה

אנו מתארים פרוטוקול לשיטת שיבוט בתפוקה גבוהה, שיבוט מעבורת מבוסס CRISPR (שיבוט CRISPRshuttle), המאפשר העברת מקטעי DNA מעניינים בין וקטורים ללא צורך בהגברת PCR של שברי ה-DNA.

שיבוט מעבורות מבוסס CRISPR: שיטת שיבוט בתפוקה גבוהה

המבחן גבוהות מבוך פלוס הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדידת חרדה כמו התנהגות בעכברים. כאן, אנו מציגים סרט המראה את הליכי מפורט לביצוע הבדיקה.

מבוך פלוס גבוהות עבור עכברים

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

למדו לבנות וקטורי גן מיקוד ב-E. coli בשיטת subcloning plus insertion המהירה. שיטה זו מאפשרת יצירת וקטורים מותאמים אישית בתגובה אחת, ומשפרת את יעילות הנדסת הגנטיקה.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

גלה סרטונים נוספים